1、空氣輔助霧化的細胞遞送參數的優化大面積皮膚傷口與多種突發事件、重大疾病緊密相關，是臨床上常見病癥，其遷延不愈的特性嚴重降低了患者的生活質量，甚至危及生命，并且在全球范圍內造成了巨大的經濟負擔1-2。由大面積皮膚創傷而引發的一系列嚴重并發癥和感染是威脅患者生命的兩個重要因素3。因此，除了給患者靜脈注射液體和營養素以抵消脫水和補充失去的蛋白質外，采取有效的治療方法以減輕患者疼痛和挽回生命顯得至關重要。目前臨床實踐的有效治療方法主要為自體皮膚移植術4-5，但對于自體皮源本已稀缺的患者，該方法仍面臨著巨大挑戰。細胞移植術是解決這個問題的有效方法6-8，即從患者身上采集自體皮膚細胞（通常是角質形成細胞）

2、后直接遞送到傷口，或經過細胞培養傳代后懸浮，再遞送到傷口。事實證明，細胞移植術可以顯著影響細胞在傷口中的分布和增殖9-11。近些年，細胞移植術已經從靜脈注射、肌肉注射、注射器或移液槍的局部滴/注12-13發展到霧化式噴灑14-16。盡管靜脈注射、肌肉注射或局部細胞給藥均顯示出治療效果，但前兩種給藥方法會導致作用于傷口部位的細胞濃度低，治療效果不佳12；通過移液槍或注射器進行局部細胞給藥雖可減少患者疼痛，但細胞遞送效率低，且分布不均勻13。細胞懸浮液噴霧自體移植用自體表皮衍生細胞，使用更小的自體部位（供體部位與燒傷面積比例可達1100）即可在短時間內完成再上皮化16-17，對于深部、大面積和不規

3、則創面，該方法能實現細胞的快速和高效的遞送。目前涉及組織修復與再生應用的空氣噴槍或霧化裝置仍存在一些缺陷，如生成的霧滴大小不一致、分布不均勻18，霧化參數對霧化特性的精確控制尚不清楚9，在輔助空氣壓力為69 kPa下，細胞活化率僅為65%19，有相關文獻報道20對細胞霧化遞送4天后，細胞增殖能力大受影響，細胞活化率降為45%。如何實現藥物的均勻化霧化、不同面積的霧化或較高的細胞活化率霧化是細胞給藥霧化遞送裝置開發中需面臨的幾個關鍵技術問題。空氣輔助霧化方法具有僅需較低空氣壓力和射流壓力即可實現較好的霧化效果，以及較大的射流通道可避免堵塞等特點21，本文構建了基于該霧化方法的可用于細胞遞送的霧化

4、裝置，通過對其霧化特性測試方法研究，側重分析霧化高度、輔助氣體流量和射流流量等霧化參數對霧化特性和生物墨水（Bio-ink）遞送的影響，以指導霧化參數的優化設計和提高生物墨水的霧化噴涂效率。2 裝置設計及試劑材料2.1裝置原理及設計空氣輔助霧化的細胞遞送裝置（Air-Assisted Atomization Device，AAAD）的工作原理如圖1（a）所示，空氣泵輸出的氣體通過空氣濾芯過濾后分兩個流路，一路經氣壓調節閥后在霧化噴嘴出口處形成穩定的高速渦旋氣流，另一路也經氣壓調節閥以穩定壓力驅動無菌儲液管中細胞懸浮液，并在噴嘴的針管出口形成液柱或液膜。在噴嘴出口處，氣體與生物墨水之間會形成很高

5、的相對速度，從而破壞液柱或液膜，改變生物墨水的流動性、表觀粘性和表面張力，最終使連續相的生物墨水變成分散相以達到霧化效果。其中，兩個流路中氣壓調節閥分別用于調節輔助空氣氣壓以控制氣體流量和調節無菌儲液管的驅動壓力以控制射流流量。為分析霧化高度對霧化性能的影響，霧化噴嘴可沿導桿做上下滑動。圖1AAAD原理及裝置Fig.1Principle and setup for air-assisted atomization deviceAAAD主要包含氣動控制模塊和霧化噴嘴模塊兩部分，實物分別如圖1（b）和圖1（c）所示。裝置主要組成部件包含流量為10 L/min的微型空氣壓縮泵（中國，SKOOCOM）

6、，100 kPa與200 kPa量程且靈敏度均優于0.2%的精密調壓閥（日本，SMC），儲液筒（日本，MUSASHI），27G霧化針管（日本，MUSASHI），霧化針管的內徑為200250 m，噴嘴的內徑為0.71.0 mm。采用量程為5 L/min且精度優于1.5%的微型空氣流量計（中國，SENLOD）和量程為40 mL/min且精度優于5%的微型液體流量計（瑞士，SENSIRION）來測量輔助氣體流量和射流流量。2.2試劑材料人永生化表皮細胞（HaCaT，中國，COBIOER）用含10%胎牛血清（FBS，中國，TIANHANG）和1%青霉素/鏈霉素（A5955，Sigma）的高糖培養基（D

7、MEM，Gibco）在T75 cm培養瓶（美國，CORNING）中培養，孵育條件為37 、CO2的體積分數為5%。每4天傳代一次，每隔一天更換一次培養基。當細胞達到90%以上匯合時，用胰蛋白酶（15090046，Gibco）收集細胞，將細胞懸液在室溫下以1 000 r/min的轉速離心5 min，棄去上清液，再將細胞重懸于無菌生理鹽水（ST341，中國，Beyotime）中，配制成細胞密度約為106 cells/mL的生物墨水。在霧化基本特性測試中，均以無菌生理鹽水為研究對象。3 霧化特性測試方法3.1霧滴粒徑分布及均勻度分析本文采用激光粒度儀（JL-3000，中國，JNGX）對霧滴粒徑進行測

8、量。該儀器主要基于夫瑯和費（Fraunhofer）衍射理論測量霧滴尺寸及對應的霧滴個數。霧化噴嘴產生的霧滴是由大小不等的霧滴群組成，本文霧滴粒徑分布采用體積累積分布表示，平均粒徑采用體積平均粒徑D4，3計算，即：D4,3=nD4nD3（1）經換算可得：D4,3=fD（2）其中：n是各個單一粒徑對應的霧滴個數；D是霧滴的粒徑，單位為m；f是各單一粒徑的霧滴群對應的體積頻度。通常，霧滴粒徑是不連續的，但當霧滴數量足夠多時，可假設霧滴的粒徑累計分布是連續的，通常其符合Rosin-Rammler分布（簡稱“R-R”分布）規律22，即：F(Di)=1exp(DiD)k（3）其中：F(Di)表示霧滴粒徑小

9、于Di的體積累計百分比；D為霧滴的特征尺寸，即F(Di)=0.632對應的霧滴粒徑；k為均勻度指數，k越大，表示霧滴粒徑分布的均勻性越好。對于符合“R-R”分布規律的霧化，若粒徑Di和Dj對應的累計百分比分別為F(Di)和F(Dj)，則由式（3）不難推導出霧化均勻度指數kDi,Dj，即：kDi,Dj=1lgDilgDj(lgln11F(Di)lgln11F(Dj).（4）3.2霧化角測試及霧化面積評估霧化過程中霧滴群在空間呈圓錐狀分布，該圓錐的張角即為霧化角，其大小直接影響霧化面積A。本文采用工業相機（DMK 23G445，德國，THE IMAGING SOURCE）對霧化狀態攝像后，在Mat

10、lab（美國，MathWorks）中計算霧化角。使用寬工作距離范圍的物鏡（BLADE 2.4/12， Korea， FIM optcis），攝像分辨率為640480像素，其中每個像素對應物方尺寸為139 m。由于單幀圖像信噪比（Signal-to-Noise Ratio，SNR）較低，邊界提取不準確，而隨著圖像疊加數量的增加，SNR也將增大。經測試，單幀圖像的SNR僅為11.8 dB，用于霧化邊界提取誤差較大，通過對多幀圖像進行疊加，可顯著提高圖像的SNR。當疊加圖像達到227幀時，圖像SNR為50 dB，對疊加后的高SNR圖像進行二值化處理，能夠有效保留霧化邊界，且邊界更加清晰。隨著圖像的疊

11、加數量增多，SNR將進一步增大，如當疊加視頻中所有圖像時（總幀數為238），圖像SNR可達65.5 dB。本文計算霧化角的方法是：先對霧化過程進行連續視頻拍攝，分析時，疊加視頻的所有幀的圖像，以提高圖像SNR，如圖2（a）為單幀圖像，圖2（b）為視頻疊加圖像；對霧化角圖像進行二值化，采用局部自適應閾值分割算法，該算法可根據局部光強分布自動調整二值化閾值，對于邊界的識別更加準確和穩定，如圖2（c）；圖2（d）為二值化圖像的邊界數據點，考慮到靠近噴嘴和遠離噴嘴處的霧化角度有所變化，因此數據點的分析也分為兩部分，采用最小二乘法擬合數據點，得到邊界直線方程，進而計算得到靠近噴嘴的霧化角1和遠離噴嘴處的

12、霧化角2。如圖2（d）所示，計算出霧化角1和2后，可進一步估算出生物墨水噴灑在基板上的面積A，即：圖2霧化角測試方法Fig.2Measurement method of atomization angleA=hN(tan12tan22)+hFtan222,(hNtan12)2,hNhFhNhF（5）其中：hN為最小二乘法擬合直線斷點位置距離噴嘴出口位置的高度，hF為霧化基板距離噴嘴出口位置的高度，單位均為mm。3.3霧滴沉降速度由于霧滴沉降速度會影響細胞活性23，本文利用高速相機（HS1，德國，PCO）的雙快門捕獲功能來測算霧滴沉降速度，相機單次曝光時間設置為10 s，拍攝時間間隔T為3.58

13、 s。采用10遠距離物鏡（375-039，日本，三豐），視場為1.652.75 mm2。由于曝光時間極短，拍攝圖像SNR較低，如圖3（a），很難對視場中的霧滴進行準確定位。本文采用BM3D去噪算法，可有效提高圖像質量，如圖3（b）；利用二值化算法對圖像中的霧滴進行識別后，如圖3（c），根據霧滴光強分布計算得到霧滴質心坐標(xT1,zT1)和(xT2,zT2)，高速相機雙快門捕獲圖像處理前與處理后分別如圖3（d）和圖3（e）所示；再根據相鄰兩幀圖像中霧滴的坐標，分別計算出霧滴的橫向運動速度=|xT2xT1|/T，縱向運動速度vz=|zT2zT1|/T，以及合速度vr=2+vz2。圖3霧滴沉降速度

14、測試方法Fig.3Measurement method of droplet settling velocity3.4細胞活化率測試將配制好的生物墨水一部分用于無噴涂的陰性對照，采用注射器（2 mL，中國，KINDLY）擠壓遞送；另一部分用AAAD噴灑。為了評估霧化后活細胞數與死細胞數比例，采用Calcein/PI細胞活性與細胞毒性檢測試劑盒（C2022M，中國，Beyotime）在37 避光孵育30 min，再用倒置熒光顯微鏡（IX73，日本，OLYMPUS）拍攝熒光圖片，并利用ImageJ（美國，National Institutes of Health）對熒光圖像進行自動計數和Merge

15、處理。細胞活化率由活細胞總數占細胞總數（含活細胞與死細胞）的百分比來表示。采用CCK-8試劑盒（C0043，中國，Beyotime）檢測噴涂或未噴涂的細胞在24 h、48 h及72 h后的活性，來分析AAAD噴涂對細胞增殖性能的影響。公開的文獻15中已分析了輔助空氣壓力PA對的影響，即在hF為100mm，PA70kPa時，PA對無顯著差異。在本文中，重點分析hF和輔助空氣流量QA對的影響。3.5統計方法數據表示為平均值標準偏差（Standard Deviation，SD），并使用Origin（美國，OriginLab）做非配對t檢驗（Unpaired t test）、單因素方差分析（One-W

16、ay ANOVA）或雙因素方差分析（Two-way ANOVA），以評估各實驗組之間的差異性。4 結果與討論4.1射流流量和霧化高度對霧滴粒徑分布的影響圖4為霧滴粒徑分布及霧化參數對其影響。QA設定為3 L/min，在不同QL和不同hF的霧化條件下，經激光粒度儀得到不同霧滴粒徑及對應的體積頻度f，如圖4（a）所示，由式（2）可計算出D4，3，根據式（3）可以得到“R-R”分布曲線，在該曲線上分別選取25%和75%累計百分比對應下的粒徑大小D25和D75，一般選取D25和D75之間的分布情況來說明顆粒的集中情況15，利用式（4）計算出kD25,D75來定性分析霧滴的均勻度程度。圖4霧滴粒徑分布及

17、霧化參數對其影響，其中，H1H4分別表示霧化高度為25、50、75及100 mmFig.4Droplet size distribution and the influence of spray parameters on it，H1-H4 represented the spray height of 25， 50， 75 and 100 mm， respectively通過雙因素方差分析，可得出hF、QL以及兩者間的交互作用均對D4，3有顯著影響。利用單因素方差分析來具體探究它們之間的關系，如圖4（b），不難得到：（1）在同等hF下，QL對D4，3有顯著影響，表現為QL越大，D4，3越大；

18、（2）QL=0.2mL/min時，hF對D4，3無顯著影響；（3）以高度為25 mm實驗組為參考組，在相同QL條件下，50 mm實驗組與參考組差異不大，但75 mm實驗組和100 mm實驗組與參考組相比均顯著增大，這說明在霧化過程中，當hF大于一定值后，隨著其進一步增大，霧滴與霧滴間存在融合現象，使得D4，3有顯著增大趨勢，但當QL過低時，hF對D4，3無顯著影響。封裝細胞的霧滴與基板發生撞擊中可能造成細胞損失，一般而言，D4，3越小，細胞活化率越低23；但D4，3過大時，細胞位于霧滴邊緣概率會增加，霧滴與基板撞擊過程中，細胞受到的剪切應力會增大，降低24。因此，hF與QL在細胞遞送中是重要霧

19、化參數。細胞傳送裝置在實際使用中QL一般低于5 mL/min14，16，25，否則會影響生物墨水的利用率。經測量，當QA=3L/min時，PA20kPa。利用單因素方差分析可以得到：在H2實驗組和H4實驗組中，QL對kD25,D75有顯著不同的影響，但影響程度不一致，如圖4（c）所示，說明這兩組實驗的霧滴生成狀態不穩定；但在H1H4四組實驗中，當QL相同時，hF對kD25,D75影響不大。為進一步分析噴嘴出口的輔助空氣流場對霧化的影響，研究了20100 kPa輔助氣體壓力下的霧滴分布狀態，如圖4（d）所示，可得到：在PA50kPa時，各實驗組的kD25,D75相差不顯著；而在PA60kPa時，

20、各實驗組的kD25,D75顯著提高，尤其在80 kPa和90 kPa實驗組中，相對于前一個梯度實驗組而言，kD25,D75提高地非常顯著。雖然PA的增大能提高kD25,D75，但同樣會影響細胞遞送中值，在文獻15中已做了相關分析。因此，在一些生物材料需均勻化噴涂而不考慮指標時，可以重點關注PA這項霧化參數。4.2霧化角及霧化面積的影響因素圖5為霧化參數對霧化角及霧化面積的影響。經最小二乘法擬合邊界直線方程，在不同QL下可計算得到1和2，且hN25mm。從圖5（a）中可看到：在QA為3L/min的實驗組中，隨著QL增大，1先從26.44增加到30.81之后一直遞減到8.04，而2在15.5525

21、.26間上下波動；當QL7mL/min時，12；而在QL為8 mL/min或9 mL/min時，12。結果表明，在QA恒定條件下，QL對1的影響比對2的影響顯著。利用式（5）可計算出在不同QL下的霧化面積A，其中取hN=25mm。不難發現在固定hF下調節QL時，在QL=3mL/min條件下的A最大，且hF越大，差異越顯著；在hF=25mm時，霧化面積可控制在100 mm2內，可滿足小面積噴灑的工況，如圖5（b）所示。圖5霧化參數對霧化角及霧化面積的影響Fig.5Effect of atomization parameters on spray cone angle and spray area

22、如圖5（c），在QL為為3mL/min的實驗組中，當QA1.5L/min時，霧化不充分，且1略小于2；而當QA2L/min時，霧化效果良好，1和2會顯著增大，且趨于平穩，12。結果表明，在QL恒定條件下，為形成良好的霧化效果，QA需足夠大，建議不低于2 L/min。其中，部分霧化圖像如圖5（d）所示。4.3氣體流量和霧化高度對霧滴沉降速度的影響圖6（a）是霧滴沉降速度測試平臺；在QL為3mL/min，QA5L/min時，如圖6（b）所示，H1實驗組的最高，隨著霧化高度hF變大，會降低，但H3與H4實驗組的變化不大；在各個實驗組中，QA對影響不大；由圖6（c）和圖6（d）可知，vz和vr均比大的

23、多；在4個實驗組中，H2實驗組的vz和vr最大；在各個實驗組中，QA對vz和vr影響也不顯著。圖6霧滴沉降速度測試及影響分析Fig.6Measurement and influence analysis of drop velocities結果表明，在輔助空氣低流量下，霧滴的運動速度受hF的影響較大；輔助氣體流場主要在噴嘴出口的小范圍內影響，隨著hF變大，霧滴在空氣阻力作用下，會逐漸減小；霧滴的vz和vr在輔助氣體的作用下，有一段加速積累的過程，需運行一定距離后才會逐漸降低。霧滴的運動速度直接影響其與霧化基板之間的剪切應力，為保證細胞霧化遞送中的細胞活化率，霧滴的運動速度應盡可能低。因此，對于本文設計的霧化噴嘴，應避免在50 mm的霧化高度噴涂。4.4生物墨水霧化的細胞活化率影響因素經倒置熒光顯微鏡拍攝和Image J軟件分析后，可得出陰性對照組和不同hF下實驗組中，如圖7（a）。經單因素方差分析，得到hF對有顯著的影響（p0.001）；將各個實驗組與陰性對照組作非配對t檢驗，可得到在50 mm的霧化高度進行細胞傳遞時，確實會顯著降低（p0.001），如圖7（b）所示，該結果同時證明了與霧滴粒徑分布和霧滴沉降速度均存在一定關聯。圖7（c）結