1、本章主要內容蛋白質概述 氨基酸 (重點)多肽（重點）蛋白質的結構（重點）蛋白質結構與功能（重點）蛋白質的性質（重點）蛋白質的分離純化與鑒定（重點）七、Protein PurificationSalting outIon exchange chromatographyIsoelectric focusingGel filtration chromatographySDSUltracentrifugationDialysis and ultrafiltrationAffinity chromatography原理：電荷差異，參看amino acidsAnion (陰離子) exchangers D

2、EAE: diethylaminoethylCation (陽離子) exchangers CM: carboxymethylMatrix: 基質 cellulose- and agarose-based resins (樹脂)2. Ion exchange chromatographyIon exchange chromatography等電聚焦（IEF）原理：電荷不同。可用于蛋白質等電點的測定，分辨率高。（pI 60000 rpm應用：純化、分子量測定。最常用方法：密度梯度離心。 (density gradient centrifugation)超速離心原理：蛋白質顆粒的沉降取決于分子的質

3、量和密度。質量和密度大的顆粒比小的顆粒沉降的快，當顆粒沉降到與自身密度相等的介質密度梯度時，就停止不前。常用的密度梯度：蔗糖梯度、聚蔗糖梯度等。6. UltracentrifugationDensity Gradient Centrifugation （密度梯度離心）透析和超濾原理：利用蛋白質分子不能通過半透膜的性質。半透膜：玻璃紙、火棉紙、改性纖維素。應用： 將蛋白質與其他小分子物質分開 濃縮和脫鹽 粗分離 7. Dialysis and ultrafiltrationDialysis (透析)Ultrafiltration (超過濾)Principle: Many proteins can

4、 bind specific molecules (ligand) tightly.Ligand is covalently attached to an inert matrix.A significant purification method.Immunoaffinity chromatography (免疫親和色譜) ligand = antibody8. Affinity chromatography （親和色譜）His-tag（組氨酸標簽）為5-15 His 串在一起的小肽（His6最為常用）。一種親和性tag，通過固定金屬離子的親和色譜（IMAC），用于表達純化。其他用途： -

5、增加蛋白可溶性。 - 提高蛋白穩定性。蛋白質分離純化全過程動(植)物組織漿狀物蛋白混合物蛋白粗溶液蛋白沉淀蛋白液純稀蛋白液蛋白沉淀蛋白液純蛋白液80下保存機械破碎細胞破碎低速離心分級鹽析高速離心溶解(buffer)電泳檢查層析提純鹽析濃縮高/超速離心溶解(buffer)透析電泳檢查（除鹽）(除膜等雜質)蛋白質含量、純度、分子量測定蛋白質含量測定 （1）凱氏定氮法 （2）雙縮脲法 （3）Folin酚試劑法（Lowry法） （4）Bradford法（考馬斯亮藍結合法） （5）紫外吸收法 （6）膠體金測定法蛋白質純度測定 （1）電泳法：常用。純蛋白在不同pH條件下電 泳時，均得到一條區帶（或峰） （2）沉降法：純蛋白在離心場中，以單一的沉 降速度移動 （3）HPLC：常用。純蛋白在洗脫圖譜中呈現單 一的對稱峰。 （4）恒濃度法：純蛋白在一定的溶劑系統中具 有恒定的溶解度。 （5）N-末端分析法：適用于單鏈蛋白質。N-端 只有一種氨基酸。蛋白質分子量測定 （1）SDS 蛋白質在凝膠上的遷移速度取決于 蛋白質的分子量 Marker 分子量標準曲線 （2）凝膠過濾法 不同分子量的蛋白質分子在凝膠過 濾中的洗脫體積不同 FPLC （3）質譜法：準確、快速、需樣量少。本章學習要點會畫20種基本氨基酸及寡肽的結構掌握氨基酸及肽的性質，特別是帶電性質和各氨基酸側鏈性質掌