1、 NMR基礎知識簡介2022年9月23日2 化學結構鑒定 天然產物化學 有機合成化學 動態過程的研究 反應動力學 研究平衡過程（化學平衡或構象平衡） 三維結構研究 蛋白質 DNA. 蛋白/DNA復合物 多糖 藥物設計 NMR研究構效關系（SAR） 醫學 磁共振成像（MRI）NMR的應用領域2022年9月23日3樣品:非磁性及非導電靈敏度:樣品需含 1015 原子核溶液固體Solids成像NMRNMR樣品要求2022年9月23日4NMR譜圖包含的信息Information:Larmor 頻率原子核化學位移: 結構測定(功能團)J-偶合: 結構測定(原子的相關性)偶極偶合:結構測定 (空間位置關系

2、)弛豫:動力學1H13CCH3C=CH-HHCCCHHHHDJHHHCJCHCC=C 0DE = h nab能量和布居數2022年9月23日10 能量與頻率是相關的，我們可以作一些簡單的數學變換： DE = h n n = g Bo / 2p DE = g h Bo / 2p 對于1H來說，在通常的磁體中 (2.35 - 18.6 T), 其共振的頻率在100-800 MHz之間。對13C, 是其頻率的1/4。 在解釋有些 NMR原理時, 我們需要用到圓周運動。 對于描述圓周運動Hz并不是一個好的單位。我們把進動（或Larmor ）頻率定義為 w: w = 2pn wo = g Bo （弧度）

3、 10-1010-8 10-6 10-4 10-2 100 102 wavelength (cm) g-rays x-rays UV VIS IR m-wave radio能量和頻率2022年9月23日11 wo與什么樣的進動相關呢? 有一個現象我們還沒涉及，它就是自旋角動量 l, 所有的核都具有自旋角動量。 我們可以粗略的認為核繞著自己的 z 軸旋轉。如果核磁矩m不為零，它就是一個旋轉的原子磁體。 如果我們外加一個強磁場 Bo, 磁矩 m 與 Bo 相互作用會產生一個扭力。不論磁矩 m 的初始取向如何，他都將傾向與 Bo平行。lBoBoor.mm進動和旋轉的陀螺2022年9月23日12 由于

4、自旋角動量 l 的原因，磁矩為 m 的核會自旋, 因此兩個力會同時作用在它上面，一個力把它拉向 Bo方向，另一個使它保持自旋。最終結果是 m 繞著 Bo進動。 理解進動最好的辦法是想象一個旋轉的陀螺在重力作用下的運動情景。 核磁矩 m 繞著Bo進動的頻率與從能級差值計算所得的頻率是相等的。 雖然這兩個頻率沒有明顯的聯系，但是由嚴格的量子力學推導也可以得到這一結論。 有些現象對于經典NMR模型來說可以把它們看作一個黑匣子。Bowom進動2022年9月23日14 NMR激發需要核自旋體系吸收能量。能量的來源是一個由變化的電場所產生的振蕩的射頻電磁輻射。MozxiB1 = C * cos (wot)

5、B1Transmitter coil (y)yBoNMR激發2022年9月23日15RF 脈沖核磁信號只能在核磁化矢量位于XY平面時才能被檢測到.使用與原子核Larmor頻率相同無線電射頻即可將M 從Z-軸轉向X-或Y-軸.MMrf+M當觀測信號時,RF 脈沖是處于關閉狀態. NMR信號是在毫伏(microvolts)而RF脈沖是在千伏kilovolts.2022年9月23日17 脈沖的寬度不只和其覆蓋的頻率范圍有關，它還表明外加射頻場B1的作用時間。因此，它就是外加扭力對宏觀磁化矢量Mo的作用時間。 特定傾倒角脈沖的寬度也儀器本身有關（B1），我們習慣上以脈沖使宏觀磁化矢量傾倒的角度來標識脈

6、沖。所以我們常見的脈沖有 p / 4、p / 2 和 p 脈沖。zxMxyyzxyMoB1qttpqt = g * tp * B1脈沖寬度和傾倒角2022年9月23日18 最常用的脈沖是p / 2脈沖，它使磁化矢量完全傾倒到 平面： p 脈沖也很重要，它使得自旋體系的布居數反轉。 原則上講我們可以得到任意角度的脈沖。zxMxyyzxyMop / 2zx-MoyzxyMop一些常用的脈沖2022年9月23日19通過RF脈沖的照射，磁化矢量將以RF脈沖的照射方向為軸在垂直于RF脈沖的照射方向的平面內轉動。如使用X-脈沖則磁化矢量將圍繞X-軸方向在YZ平面內轉動。 -只要RF脈沖打開，則磁化矢量的轉

7、動就不會停止。-磁化矢量的轉動速度取決于脈沖強度。-脈沖長度將決定磁化矢量停止的位置。Mrfxyz45o90o180o270o360oRF 脈沖2022年9月23日2090o 或p/2 脈沖將給出最大的信號，所以也就成為準確測定此參數的原因之一。在特定的功率強度下，通過采集一系列不同脈沖長度的譜圖以確定最大值或零強度點。此點就給出90o或180o的脈沖。在BRUKER 儀器，RF 脈沖一般以pn (e.g. p1)等參數來描述其標準單位是微秒(ms)。功率強度是以pln， (e.g.pl1)等參數來描述其標準單位是dB。MrfxyzPulse length90180270360RF 脈沖202

8、2年9月23日21信號接收MB0接受/發射線圈經過脈沖照射后，磁化矢量被轉到XY平面上并繞Z-軸旋轉。由于此轉動切割了接受器的線圈，并在接受器的線圈中產生振蕩電流。其頻率就是Larmor頻率。 在NMR 中，接收線圈與發射線圈是同一線圈。信號首先被送到前置放大器然后送到接收器。接收器分解此信號使之頻率降低到聲頻范圍。模擬數字轉換器將此信號數字化。Vt2022年9月23日22 Nyquist 原理表明采樣的速度至少要是最快的信號（頻率最高）的兩倍。 如果采樣的速度是信號頻率的兩倍，我們就可以清楚的記錄這一頻率的信號。 如果采樣速率降低一半，我們就只能得到頻率為真實頻率 的信號。這些信號會折疊回我

9、們的譜中，相位會與其它的峰不同。這種現象叫做 aliasing.SR = 1 / (2 * SW)數據采集2022年9月23日24接收器(Receiver)檢測方法:具有Larmor頻率NMR信號與激發脈沖混合，所得的差被數字化。混合檢測的信號(10-800 MHz)參照頻率(10-800 MHz)自由衰減信號 (FID)(audio: 0-100 kHz)接受器 (RX22)數字化器 (HADC)計算機儲存2022年9月23日25 當宏觀磁化矢量Mo受到 p / 2 脈沖的傾倒到平面后，檢測線圈中會出現NMR信號。 核自旋系統會向平衡態恢復，宏觀磁化矢量Mo在 平面內的馳豫可用指數函數描述。

10、所以檢測線圈會檢測到一個衰減的cosine信號（單個自旋種類）w = woMxyw - wo 0timeMxytime自由感應衰減（FID）2022年9月23日27NMR 譜儀2022年9月23日28NMR 譜儀2022年9月23日29 NMR 譜儀2022年9月23日30NMR 探頭2022年9月23日31NMR 譜儀: 術語和簡寫AV 系統:CCU:通訊控制單元 Communication Control Unit TCU:時間控制單元 Timing Control UnitFCU:頻率控制單元 Frequency Control UnitGCU：梯度控制單元 Gradient Contr

11、ol UnitSGU:信號產生單元 Amplitude Setting UnitDRU:數字化接收單元 Digital Receiver UnitBSMS:布魯克智能磁體控制系統 Bruker Smart Magnet SystemACB:功放控制板 Amplifier Control BoardRXAD:接收器與模/數轉換器 Receiver and Analog to Digital ConverterHPPR:前置放大器 Pre-amplifierSLCB：樣品和液氦液面控制板 Sample and Level Control BoardSCB：勻場控制板 Shimming Contro

12、l BoardLCB:鎖場控制板 Lock Control BoardLTX：鎖場信號發射板 Lock TransmitterLRX：鎖場信號接受板 Lock RecieverTOPSPIN: 運行軟件 Operating Software2022年9月23日32 通常 B1 的頻率會設置的比其它所有信號的頻率都高（或低）。這樣作的目的是為了避免有信號的頻率高于（或低于）參考頻率。這樣計算機就可以知道信號的正負了。 這樣做會有兩個問題：第一個是噪音問題，多余的噪音會折疊回NMR譜中，影響信噪比。第二個是激發脈沖問題，激發較寬的譜寬需要更高功率的脈沖。 最好的解決辦法是把參考頻率設置到譜頻率的中

13、間。carrier正交檢測(Quadrature Detection)2022年9月23日33由于NMR檢測器不能檢測出順時針或反時針方向的核磁信號,傅立葉轉換后,將給出+w 和 w兩個峰. xVtxVtFT0-ww正交檢測2022年9月23日34 怎樣才能區別信號的頻率比參考頻率快還是慢呢？解決這個問題的辦法就是使用兩個檢測器，其相位相差90度。 頻率高的信號與頻率低的信號正負相反，這樣就可以區分開頻率的正負。w (B1)BFBFPH = 0PH = 90PH = 0PH = 90FFSS正交檢測2022年9月23日35NMR SignalReference (SFO1)90o0oADCAB

14、RealImaginary數學處理通過使用具有900相位差的兩個基本點檢測器，正負頻率就很容易區分開。實際應用中，并非使用兩個檢測器，而是使用一個檢測器。將檢測到的信號分成兩部分并分別送到具有償使用900相位差兩個通道中。正交檢測2022年9月23日36Channel AChannel BFTFTChannel A + B正交檢測2022年9月23日37 頻域譜寬度(SW)和中心頻率（O1P）在BRUKER的儀器中,頻域譜圖的中央點是由參數SFo1 (=SF + o1)確定. 其中,SF 是所觀測的原子核Larmor頻率; o1p 是偏置頻率可以用來改變頻域譜圖的中央點.o1po1po1p20

15、22年9月23日38在實際測試未知樣品時,可以使用較大的SW值采樣.然后調整O1采樣.最后再調整SW.1. 較大 sw2. 調整 o13. 調整 swo1pnew o1pswswnew sw 頻域譜寬度(SW)和中心頻率（O1P）2022年9月23日39ADCNMR 信號通常包含許多共振頻率及振輻.為能更好的描述NMR信號, 我們一般使用16 或18 bit ADC. 增益值(RG)應被調節到一適當的值.既能充分利用又不至于使接收器過飽和.RG 太低RG 太高RG 適當2022年9月23日40NMR 信號被稱為自由衰減信號 (Free Induction Decay 或 FID).此信號并不能

16、象COS涵數一樣保持同樣的振輻持續下去,而是以指數的方式衰減為零. 此一現象是由所謂的自旋-自旋馳豫造成.(T2 relaxation)在BRUKER儀器中,時域信號的數據點是由參數TD 設定.為使時域信號能夠被完全采集到,TD應為一適當的值,以免使信號被截斷( truncation).自由衰減信號(Free Induction Decay)TD set proper*TD too small2022年9月23日41在測量NMR信號的同時,由于儀器的電子元件及樣品本身產生的噪音也同樣被接收線圈檢測到. 為了得到適當信噪比的圖譜我們一般可以增加掃描次數以達到要求的信噪比(S/N), 信號平均是指

17、通過增加掃描次數來壓制噪音而增加信號強度的方法.N次額外的掃描回給出 倍的增強的信號強度在BRUKER儀器中,掃描次數是由參數ns設置.另外,增加掃描次數時,一定要考慮T1弛豫的影響,也就是說要考慮參數D1的設置信號平均(Signal Averaging)noiselevelsignal2022年9月23日42FID譜圖NSS/N14162561 (ref)2x4x16x信號平均(Signal Averaging)2022年9月23日43 到目前為止我們還沒談到宏觀磁化矢量回復到平衡態的過程。這一過程就是馳豫過程。馳豫分為兩種類型，它們都與時間成指數衰減關系。縱向馳豫（自旋晶格馳豫） （T1）

18、 它主要影響磁化矢量在 z 軸方向的分量（Mz） - 自旋系統與周圍的環境發生能量交換， 自旋系統回復到平衡態。 - 與其它核的偶極偶合以及順磁物質會 影響到T1時間的大小。橫向馳豫（自旋自旋馳豫）（T2） 它主要影響磁化矢量在平面的分量（Mxy） - 自旋自旋相互作用使得Mxy散相 - 還會受到磁場不均運性的影響 - 小于T1MzzxyMxyzxy馳豫現象(Relaxation)2022年9月23日44弛豫效應NMR信號是一個以常數為T2的指數方式衰減的函數。 T2就是橫向弛豫過程的時間常數。此外，在XY平面的磁化矢量需要一定的時間回到Z-軸上。這一過程需要的時間就叫縱向弛豫時間，其時間常數

19、是T1。 T1 和T2 與原子核的種類，樣品的特性及狀態，溫度以及外加磁場的大小有關。信號平均方法成功的關鍵就是要正確設定參數D1。D1必須是五倍的T1以保證在下次掃描時磁化矢量完全回到Z-軸。有時為節省時間，使用小角度的脈沖，重復掃描以達到增強信號的目的。T1=30s, 4 scansa. D1=150s; 90o pulse; 600s;b. D1=15s; 90o pulse; 60s;c. D1=15s; 30o pulse; 60s.abc2022年9月23日45傅立葉轉換(Fourier Transformation)在核磁共振實驗中,由于原子核所處的電子環境不同,而具有不同的共振

20、頻率.實際上,NMR信號包含許多共振頻率的復合信號.分析研究這樣一個符合信號顯然是很困難的.傅立葉轉換(FT)提供了一種更為簡單的分析研究方法.就是將時域信號通過傅立葉轉換成頻域信號.在頻域信號的圖譜中,峰高包含原子核數目的信息,而位置則揭示原子核周圍電子環境的信息.timefrequencyFT2022年9月23日46 現在計算機中已經有了FID數據。我們可以對FID做一些處理，比如數字濾波等。真正的NMR信號主要位于FID前面的部分，隨著 Mxy 的衰減，FID的后部主要以噪音為主。 直觀上講數字濾波就是給 FID乘上一個函數，使噪音比例較大的FID末端變得較小。主要為信號主要為噪音1數據

21、處理窗口函數(Window Function)2022年9月23日47 對于下面原始的FID，我們分別使用一個正的和負的LB值，以說明它們對最終譜圖的影響。FTFTLB = -1.0 HzLB = 5.0 Hz靈敏度和分辨率的增強（EM）2022年9月23日48 Gaussian/Lorentzian（GM）：提高分辨率。相比純粹用負的LB值來提高分辨率，對信噪比的不良影響要小一些。 Cosine 相移 cosine：主要用于二維譜。 窗口函數的選擇與具體的實驗相關。F(t) = e - ( t * LB + s2 t2 / 2 )F(t) = cos( p t / tmax )其它有用的窗口

22、函數2022年9月23日49SW - spectral width (Hz)SI - data size (points) 數據的大小與譜寬（采樣速度）、和采樣時間有關。數據的點數越多采樣的時間就越長。 即使數據的存儲空間足夠大，過長的采樣時間也會使實驗的時間變得很長。 我們把每個點所對應的Hz 數定義為數字分辨率。 DR = SW / SI 對于 SW 為5 KHz，FID 點數為16K的數據，其數字分辨率為：0.305 Hz/point. 一個很明顯的問題是：當SW很大而SI很小時，數字分辨率就很低，不能準確的反映出譜峰形狀。數據大小和沖零(ZeroFilling)2022年9月23日50

23、 當采樣時間不是足夠長（數據點數較少）時，通過沖零可以提高數字分辨率。 沖零就是在FT前，在FID的末端加上大小為零的點。通常沖零的點數為1倍或2倍。 通過這種方法可以提高數字分辨率，通常可以提高譜圖的質量。如果最初的FID點數太少，通過沖零也不能得到好的譜圖。8K data8K zero-fill8K FID16K FID沖零2022年9月23日51沖零在Topspin軟件中，沖零是通過設置SI的值來實現的。當SI大于TD時，軟件會自動沖零TD=SI=128TD=128; SI=1024TDTDSI2022年9月23日52在BRUKER儀器中，相位調整首先對最大峰進行零級相位調整PH0，然后

24、以一級相位調整PH1來調節其他的峰。1. FT phase2. Adjust ph0on biggest peak3. Adjust otherpeaks with ph1相位調整(Phasing)2022年9月23日53NMR: 原子核間的相互作用分子中的原子并不是孤立存在,它不僅在相互間發生作用也同周圍環境發生作用,從而導致相同的原子核卻有不同的核磁共振頻率.Larmor 頻率化學位移自旋-自旋偶合e.g. B0=11.7 T, w(1H)=500 MHzw(13C)=125 MHz化學位移 B0 kHz自旋-自旋偶合 Hz-kHz2022年9月23日54化學位移(Chemical Shi

25、ft)在磁場中，由于原子核外電子的運動而產生一個小的磁場Be(local field)，此小磁場與外加磁場(B0)方向相反，從而使原子核感受到一個比外加磁場小的磁場(B0+Blo).此一現象我們稱做化學位移作用或屏敝作用。B0Be原子核實際感受到的磁場:B = (1-s) B0s化學位移常數2022年9月23日55PPM 單位由于化學位移是與外加磁場成正比，所以在不同的磁場下所的化學位移數值也不同。也會引起許多麻煩，引入ppm并使用同意參照樣品，就是光譜獨立于外加磁場。0 Hz15003000450060000 ppm48120 Hz15003000450060000 ppm4812參照樣品峰

26、300 MHz500 MHz300 MHz500 MHz1 ppm = 300 Hz1 ppm = 500 Hz2022年9月23日560 ppm428610HC=OHC=CH2CH3即使使用不同的儀器或在不同的場強下，相同的官能團具有相同的ppm值。不同的官能團由于存在于不同的電子環境因而具有不同的化學位移，從而使結構鑒定成為可能.化學位移(Chemical Shift)2022年9月23日57自旋-自旋偶合(Scalar Coupling)相鄰的原子核可以通過中間媒介(電子云)而發生作用.此中間媒介就是所謂的化學鍵.這一作用就叫自旋-自旋偶合作用(J-偶合).特點是通過化學鍵的間接作用.C

27、HCHHC異核J-coupling同核 J-couplingJCHJHH2022年9月23日58自旋-自旋偶合引起共振線的分裂而形成多重峰.多重峰實際代表了相互作用的原子核彼此間能夠出現的空間取向組合.CHJCHCHJCH原始頻率ww-J/2w+J/2JCH自旋-自旋偶合(Scalar Coupling)2022年9月23日59同核J-偶合(Homonuclear J-Coupling)多重峰出現的規則:1. 某一原子核與N個相鄰的核相互偶合將給出(n+1)重峰.2. 等價組合具有相同的共振頻率.其強度與等價組合數有關.3. 磁等價的核之間偶合作用不出現在譜圖中.4. 偶合具有相加性. 例如:

28、HaHbCCwawbJABHBHBHAHAJAB2022年9月23日60HaHbCCHcAB,CBCAAB,C是化學等價的核JAB=JAC同核J-偶合(Homonuclear J-Coupling)2022年9月23日61HaHbCCHcB,C是化學不等價的核JAC=10 HzJAC=4 HzJBC=7 HzABCwAJACJAC同核J-偶合(Homonuclear J-Coupling)2022年9月23日62異核J-偶合(Heteronuclear J-Coupling)*CH*CH2*CH3CH1H2H3CH1H2CH1*CC2022年9月23日63由于一些核的自然豐度并非如此100%。

29、因此譜圖中可能出現偶合分裂的峰和無偶合的峰。氯仿中的氫譜是一個典型的例子。x100H-13CH-13C105 HzH-12C異核J-偶合(Heteronuclear J-Coupling)2022年9月23日64NMR: 鎖場(Lock)實驗對磁場穩定性的要求可以通過鎖場實現，通過不間斷的測量一參照信號(氘信號)并與標準頻率進行比較。如果出現偏差，則此差值被反饋到磁體并通過增加或減少輔助線圈(Z0)的電流來進行矯正。2DLockTXLockRXLockfreq.DZ0-coil2022年9月23日65勻場(Shimming)在樣品中，磁場強度應該是均勻且單一，以使相同的核無論處于樣品的何種位置

30、都應給出相同的共振峰。為達此目的，一系列所謂勻場線圈按繞制所提供的函數方式給出補償以消除磁場的不均勻性，從而得到窄的線形.實際應用中可分為低溫勻場(cryo-shims)線圈和室溫勻場線圈(RT-shims)。低溫勻場線提供較大的矯正。2022年9月23日66去偶(Decoupling)原子核間的偶合導致譜圖的復雜化。CHJCHCHJCHoriginal frequencyww+J/2w-J/2JCH2022年9月23日67如果峰數不多，偶合的方式仍可分析出。但當很多鋒出現時，偶合方式的分析就不是那么容易。*CH3-CH2-未去偶氫去偶去偶(Decoupling)2022年9月23日68氫對碳

31、的偶合作用可以通過對氫施加一個脈沖消除。此一技術稱為去偶。對氫核的飽和照射，促使氫核的自旋狀態快速的變換，臨近的碳核無法感覺到氫核的自旋狀態的取向而只感受到氫核兩種取想的平均效果。具體的說，對氫核的飽和照射使碳核原來的兩條共振線w-J/2和w+J/2合并平均而得到(w-J/2)+(w+J/2)/2=w。CHJCHCHJCHp-pulse on H這相當于使用一系列1800脈沖快速照射氫核。C-HpHC-HpHpHpHC-HC-HC-HC-HpHw+J/2w-J/2w+J/2w-J/2w+J/2w-J/2去偶(Decoupling)2022年9月23日69氫去偶除簡化碳譜還因為有核的Overhauser效應而增加信噪比。decoupledcoupledC-HC-H2*CH3-CH2-去偶(Decoupling)2022年9月23日70如果使用一個連續脈沖照射在氫的共振頻率而不是使用一系列1800脈沖。此法稱為連續波（CW）去偶. 去偶實