1、酵母表達實驗步驟酵母培養基配方：YPD 培養液：Yeast extract 10 g, Peptone 20 g, Glucose 20g,溶解于IL ddH2O 中， NaOH 調pH 值為6.5, 112C滅菌20min。YPD固體培養基：100 mL YPD培養液加瓊脂粉1.5g。YSD 培養液： Yeast Nitrogen Base 6.7g, Glucose 20g， Leucine 200 mg， Adenine 100mg, Inositol 200mg，溶解于 1L ddH2O 中，NaOH調pH 值為6.5, 112C 滅菌 20min。YSD固體培養基：100 mL YS

2、D培養液加瓊脂粉1.5g。一、電轉化：1 感受態細胞制備：接種酵母S-78單菌落于2ml YPD培養基中，28 C振蕩培養過夜。取100ul 過夜培養液轉入 50ml YPD中，28C振蕩培養12h （A600為0.70.8 ）。 1500gx5min, 4C離心，收集細胞，用滅菌的預冷雙蒸水洗滌2次。將沉淀細胞 重懸于20ml的預冷1mol/L山梨醇中，同前離心后加入1ml預冷1mol/L山梨醇。 此為酵母感受態細胞，備用。2電轉化取1ul （約1ug）質粒DNA加至80ul感受態細胞，移入0.2cm的電極杯中， 置冰浴5min，采用電脈沖轉化（1500V, 25uF，200Q）,立即加入預

3、冷1mol/L 山梨醇1ml,取200ul涂布在酵母選擇培養基（YSD,酵母氮堿6.7g,葡萄糖20g, 肌醇200mg，腺嘌吟50mg/L）上置28C培養13d菌落出現。二、LiAC轉化酵母感受態細胞的制備劃S-78YPD平板，30C，培養2-3天；挑單克隆于3mLYPD溶液中，30C擴大培養12小時，250轉/min；以1： 25的比例轉入50mL YPD溶液中擴大培養，250轉/min；測OD600在0.40.6之間，停止培養； 收集菌液， 50mL 離心管（滅菌）， 4000 轉 /min 離心 5min ； 細胞合并懸于 20mL 滅菌 ddH2O 中， 4000 轉 /min 離心

4、 5min ； 倒去上清，細胞懸浮于1.5mL混合溶液中（lOxTE, 1M LiAC, ddH2O, 以1:1:8 的體積比混合）質粒的轉化HWTX-XI或突變體質粒DNA 1.0 pg；carrierDNA 10pg； （carrier DNA魚精DNA）上述菌懸液 20pL；PEG 溶液（lOxTE, 1M LiAC 50%PEG4000,以 1:1:8 的體積比混合）1.5mL；混合，30C, 200 轉/min,培養30min；42C 熱擊 15min 后，5000 轉/min 離心5min；棄上清，細胞沉淀用200吐lxTE洗滌，5000轉/min離心5min；棄上清，細胞沉淀懸浮

5、于200mL 1XTE溶液中；細胞懸浮液涂YSD板，30C培養4-6天；蛋白的表達挑取YSD板上直徑為0.51mm菌斑于3mLYSD溶液中擴大培養12h,然 后以1:25的比例轉入50mL YSD溶液中，30C, 250轉/min培養12小時；最后 以1:25的比例轉入1 L YPD溶液中，30C, 250轉/min擴大培養3-4天。3.2. 6.4 突變體的純化收集菌液，將表達上清和預先用0.05M NH4AC （pH7.5）平衡過的DEAE凝膠 （陰離子）混合，室溫放置半小時，然后用抽濾瓶抽濾，所得到的濾液， pH 值 調至4.2后直接上預先用0.1M CH3COONa （pH4.2）平衡好的CM-sepharose陽 離子交換柱(3cm x 30cm),然后用0.1M CCOONa洗脫色素，再分別用含0.1M,0.2M, 0.3M, 0.5M, 1.0M NaCl的0.1