1、沉默基因第1頁，共20頁，2022年，5月20日，0點57分，星期五肝細胞肝癌（hepatocellular carcinoma HCC）是全球性的健康問題之一。我們南通啟東是WHO確定的HCC高發研究現場。研究基于我們的首次發現NET-1在HCC組織中特定表達，并發現該基因參與HCC細胞的分裂增殖和癌發生、發展密切相關的細胞運動過程,探討針對NET-1的siRNA抑制肝癌癌細胞株(SMMC-7721)中NET-1基因的表達，及該基因對癌細胞增殖、遷移、內吞的影響。 一、項目研究背景第2頁，共20頁，2022年，5月20日，0點57分，星期五NET-1與NET-2到NET-7一起統稱為NET-

2、X，它們是由Serru等于2000年在EST 數據庫中發現的7 個新的含4 次跨膜蛋白超家族( transmembrane 4 superfamily 或tetraspan family, 簡稱TM4SF) 的成員。 NET-1(C4.8、P503s、Tspan-1) 定位于染色體1p34.1上，其mRNA全長為1297bp(基因庫登記號碼AF065388)，為TM4SF的成員之一，最近證實其為腫瘤相關基因。第3頁，共20頁，2022年，5月20日，0點57分，星期五1、NET-1siRNA表達質粒和myc-NET-1重組表達質粒的構建 。2、細胞培養與轉染。 3、細胞內總RNA抽提及RT-Q

3、PCR檢測NET-1m RNA。4、Western blot檢測NET-1蛋白表達。5、CCK-8法檢測細胞增殖活性。 6、流式細胞儀(FCN)檢測各組細胞處于不同細胞周期中的比例與增殖指數。7、細胞劃痕試驗檢測細胞二圍空間的遷移能力。 8、Transwell小室檢測細胞三圍空間的遷移能力。9、Capture-ELISA方法測量細胞內生物素標記的轉鐵蛋白水平。10、 anti-uPAR標記的癌細胞偽足形成實驗。一、 材料與方法第4頁，共20頁，2022年，5月20日，0點57分，星期五系統 組織 成人組織 胎兒組織 惡性組織 第一組 第二組 第三組消化系統 胃 + NA* + 食道 + NA

4、NA 小腸 + NA NA 結腸 + NA NA 直腸 + NA + 胰腺 NA + 肝 +泌尿生殖系統 腎 + + + 睪丸 + + + 宮頸 + NA (halan 細胞l) + 宮體 + NA + 前列腺 + NA NA 乳腺 + NA NA 內分泌系統 垂體 + NA NA 甲狀腺 + NA NA 腎上腺 + NA NA淋巴造血系統 造血細胞 NA * 淋巴結 + NA NA 骨髓 NA NA 脾臟 + NA NA 胸腺 + NA NA神經系統 腦 + + NA 脊髓 + NA NA 視網膜 + NA NA其他 心 + 黑色素瘤 + 肺 + + NA 肌肉 + + NA 皮膚 + +

5、NA 胎盤 + NA NA *NA:現在未做檢測； *白血病，淋巴瘤 1. 檢測人體組織中NET-1mRNA表達鎖定研究目標 HCC二、結果M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11Lanes M: 200ng of 1kb size ladder (New England BioLabs); Lanes1-3: Normal Fetal Liver Tissues; Lanes 4-7: Normal Adult Liver Tissues; Lanes 8 -11: Liver Cancer Tissues 第5頁，共20頁，2022年，5月20日，0點57分，星期五轉染NET-1

6、siRNA和myc-NET-1后SMMC-7721細胞中NET-1mRNA的表達（RT-QPCR）以未處理組為1。NET-1-siRNA組和myc-NET-1組分別與未處理組相比 (P0.05，p0.01)；NET-1-siRNA組與pU6H1-GFP組相比(P0.05，p0.01)；myc-NET-1組與pcDNA3.1/myc組相比( P0.05，p0.01) 2、RT-QPCR檢測轉染NET-1siRNA和myc-NET-1細胞中NET-1 mRNA的結果 第6頁，共20頁，2022年，5月20日，0點57分，星期五3. NET-1蛋白表達在HCC組織中顯著高于癌旁組織中。-actinN

7、ET-1Lanes 1,3,5,7 cancerous tissues; Lanes2,4,6,8: adjacent noncancerous tissues第7頁，共20頁，2022年，5月20日，0點57分，星期五（1）隨時間的延長NET-1-siRNA處理組細胞增殖明顯減少； NET-1穩定表達組細胞增殖明顯增多。4. 干擾NET-1 可以抑制HCC細胞增殖第8頁，共20頁，2022年，5月20日，0點57分，星期五（2）NET-1-siRNA處理組細胞存在G0/G1和G2/M期阻滯，G0/G1和G2/M期細胞比例分別增加了17.04%和10.97%，S期細胞比例降低。NET-1穩定表

8、達組細胞更快地進入細胞周期進程，G0/G1期細胞比例明顯降低。GFPsiRNA組NET-1 siRNA組對照組NET-1過表達組第9頁，共20頁，2022年，5月20日，0點57分，星期五5. 干擾NET-1 可以抑制HCC細胞遷移在NET-1siRNA組中顯著減少(p0.05)，在myc-NET-1組中明顯增加(p0.05） NET-1 siRNA處理細胞后遷移能力明顯下降。第10頁，共20頁，2022年，5月20日，0點57分，星期五轉染48h后穿過Matrigel膠細胞數NET-1 siRNA組（21.425.74）和pU6H1-GFP（45.608.25）差異有顯著統計學意義（P0.0

9、5）；myc-NET-1組（64.806.14）和pcDNA3.1/myc（38.207.22）差異有顯著統計學意義（P0.05）。 第11頁，共20頁，2022年，5月20日，0點57分，星期五6. 干擾NET-1 可以抑制HCC細胞內吞 轉鐵蛋白(Tfn)內吞實驗顯示，NET-1 siRNA組癌細胞的內吞能力明顯下降。其他組間的內吞作用變化不明顯 。未處理 anti-NET-1 兔IgG NET-1siRNA GFP-siRNA第12頁，共20頁，2022年，5月20日，0點57分，星期五7. 干擾NET-1 可以抑制HCC細胞侵襲偽足形成NET-1siRNA處理細胞偽足形成細胞百分比明顯

10、減少(p0.01) NET-1siRNA處理細胞中以anti-uPAR標記的癌細胞偽足明顯減少。 第13頁，共20頁，2022年，5月20日，0點57分，星期五8.干擾NET-1 可以抑制裸鼠HCC的生長myc-NET-1NET -1 siRNA第14頁，共20頁，2022年，5月20日，0點57分，星期五9.NET-1表達與HCC臨床病理因素和預后的研究(1) NET-1表達與HCC臨床病理因素密切相關。 NET-1基因蛋白表達與HCC臨床病理因素的關系(76例)（2）Kaplan-Meier生存曲線 第15頁，共20頁，2022年，5月20日，0點57分，星期五（3）Cox比例風險模型多因

11、素生存分析HCC轉移、組織學分級，癌中NET-1、JAB1、p-p27T187、p-p27S10、PCNA表達均具有獨立的預后意義。風險分析提示這些因素增強時均能增加HCC病人的死亡風險(其風險比均1)第16頁，共20頁，2022年，5月20日，0點57分，星期五三、討論 本文通過構建NET-1siRNA和myc-NET-1表達質粒，并轉染肝癌細胞SMMC-7721。研究發現NET-1基因參與肝癌細胞的增殖分裂活動，干擾肝癌細胞NET-1基因的表達，可以抑制癌細胞的增殖，使細胞生長受限，可以抑制細胞在二圍、三圍空間的遷移能力、癌細胞內吞能力和侵襲性偽足形成能力。相反，增加NET-1基因的表達，

12、癌細胞表現為顯著增生，更快地進入細胞周期，遷移能力提高。研究結果揭示了肝癌細胞中NET-1基因的功能，為肝癌的發生、發展機制增添了新的內容。 NET-1表達與HCC臨床病理因素和預后相關性的研究顯示為NET-1表達與HCC的組織學分型、病理分級、脈管轉移等臨床病理因素密切相關。癌中NET-1高表達患者生存期明顯減少、 NET-1高表達具有獨立的預后意義。 NET-1 高表達能增加HCC病人的死亡風險。 第17頁，共20頁，2022年，5月20日，0點57分，星期五1.首次發現NET-1在肝臟良惡性組織中表達的特點。2.在HCC細胞中干擾NET-1表達，抑制癌細胞的遷移、 侵襲、內吞和偽足形成的能力，并能抑制裸鼠HCC 生長。提示NET-1可能在HCC細胞運動中發揮作用， 是HCC細胞增殖相關蛋白。3.NET-1表達與HCC臨床病理因素密切相關，是顯著影響患者預后的獨立指標，高表達患者死亡風險增加，具有顯著的臨床預后評估價值。4.已研制的NET-1多克隆抗體，可用于免疫組化、蛋白 印跡等多種實驗，具有臨床推廣使用的可行性與價值。四、項目研究創新點第18頁，共20頁，2022年，5月20日，0點57分，星期五 致 謝1、該課題研究