1、第六章 基因的表達與調控(上) 原核基因表達調控模式61 原核基因表達調控總論62 乳糖操縱子與負控誘導系統63 色氨酸操縱子與負控阻遏系統64 轉錄后調控原核生物暴露在環境中，食物供應無保障，只有根據環境條件的改變合成各種不同的蛋白質，使代謝過程適應環境的變化，才能維持自身的生存和繁衍。它有一套準確地調節基因表達和蛋白質合成的機制。如果每個基因等同翻譯，每一個多肽應有相同的拷貝數。結論是否定的，基因的表達是被控制的。有些蛋白質的數目相當固定，另一些則變化很大；50種核糖體蛋白數量十分穩定。糖酵解體系的酶數目也極恒定。DNA聚合酶、RNA聚合酶等代謝過程中十分必需的酶或蛋白質（組成型合成蛋白）

2、的合成速率不受環境變化或代謝狀態的影響。而另一種類型則被稱為適應型或調節型(adaptive or regulated)，這類蛋白質的合成速率明顯地受環境的影響而改變。例如，一般情況下，一個大腸桿菌細胞中只有15個分子的-半乳糖苷酶，但若將細胞培養在只含乳糖的培養基中，每個細胞中這個酶的量可高達幾萬個分子。其他參與糖代謝的酶，氨基酸、核苷酸合成系統的酶類，其合成速度和總量都隨培養條件的變化而改變。細菌中的基本調控機制有如下規律:一個體系在需要時被打開，不需要時被關閉。這種“開-關”(on-off)活性是通過調節轉錄來建立的，即通過調節mRNA的合成來實現的。一個系統處于“off”狀態時可能是本

3、底水平的基因表達，常常是每世代每個細胞合成12個mRNA分子和極少量的蛋白質分子。必須明白所謂“關”實際的意思是基因表達量特別低，或者無法檢測。61 原核基因表達調控總論生物的遺傳信息是以基因的形式儲藏在細胞內的DNA(或RNA)分子中的。隨著個體的發育，DNA有序地將遺傳信息，通過轉錄和翻譯的過程轉變成蛋白質，執行各種生理生化功能，完成生命的全過程。從DNA到蛋白質的過程，叫做基因表達(gene expression)，對這個過程的調節就稱為基因表達調控(gene regulation或gene control)。基因調控是現階段分子生物學研究的中心課題。要了解動、植物生長發育的規律、形態結

4、構特征和生物學功能，就必須弄清楚基因表達調控的時間和空間概念。 基因表達調控在兩個水平上體現 (1)轉錄水平上的調控(transcriptional regulation); (2)轉錄后水平上的調控(post-transcriptional regulation)，包括mRNA加工成熟水平上的調控(differential processing of RNA transcript);翻譯水平上的調控(differential translation of mRNA)。對于原核生物，以營養狀況(nutritional status)和環境因素(environmental factor)為主要的

5、基因表達影響因素。在真核生物尤其是高等真核生物中，激素水平(hormone level)和發育階段(developmental stage)是基因表達調控的最主要手段，而營養和環境因素的影響力大為下降。在轉錄水平上對基因表達調控取決于DNA的結構、RNA聚合酶的功能、蛋白因子及其他小分子配基的相互作用。6.1.1 原核基因調控機制的類型與特點原核生物的基因調控主要發生在轉錄水平上，根據調控機制的不同可分為負轉錄調控(negative transcription regulation)和正轉錄調控(Positive transcription regulation)。負轉錄調控系統在負轉錄調控系

6、統中，調節基因的物質是阻遏蛋白(repressor)阻止結構基因轉錄。其作用部位是操縱區。它與操縱區結合，轉錄受阻。負控誘導系統阻遏蛋白不與誘導物結合時，阻遏蛋白與操縱區相結合，結構基因不轉錄，阻遏蛋白結合上誘導物時，阻遏蛋白與操縱區分離，結構基因轉錄。負控阻遏系統阻遏蛋白與效應物結合時，結構基因不轉錄。正轉錄調控系統在正轉錄調控系統中，調節基因的產物是激活蛋白(activator)，激活蛋白結合與DNA的啟動子及RNA聚合酶后，轉錄才會進行。在正控誘導系統中，誘導物的存在使激活蛋白處于活性狀態，轉錄進行。在正控阻遏系統中，效應物分子的存在使激活蛋白處于非活性狀態，轉錄不進行。細菌中的轉錄調控

7、系統可誘導調節基因在特殊物質的作用下，由原來關閉的狀態轉變為活化狀態稱為誘導調節。大腸桿菌在只含乳糖的培養基中開始時生長不好；等合成了利用乳糖的一系列酶，具備了利用乳糖作為碳源的能力時又開始生長。怎樣獲得這一能力的：在誘導物乳糖的誘導下開動了乳糖操縱子，表達它所編碼的3個酶。這3個酶使細菌可以利用乳糖作為碳源。象乳糖操縱子這類基因就是可誘導基因，這類酶被稱為誘導酶，這個生化過程被稱為酶的誘導合成。可阻遏調節基因平時是開啟的，處在產生蛋白質的工作過程中，由于一些特殊代謝物或化合物的積累而將其關閉，阻遏了基因的表達。比如大腸桿菌生活中必須有色氨酸，一般情況下，該操縱子開啟，生產色氨酸合成酶基因表達

8、正常。如果在細菌培養基中加入色氨酸，細菌可利用它來維持生活而不需要再合成，細菌就在2-3min內關閉該操縱子。某一代謝途徑最終產物合成酶的基因可以被這個產物本身所關閉。這種基因被稱為可阻遏基因，這些酶被稱為可阻遏酶，這個現象被稱為可阻遏現象，這些起阻遏作用的小分子被稱為阻遏物。可誘導的操縱子是一些編碼分解代謝糖和氨基酸的蛋白的基因。這些糖和氨基酸平時含量很少，細菌并不分解利用它們，而是利用一般的能源物質葡萄糖的水解來提供能源，因此，這些操縱子常常是關閉的。一旦生存條件發生變化，如葡萄糖缺乏而必須利用乳糖作為能源時，就要打開這些基因。可阻遏基因它們是一些合成各種細胞代謝過程中所必須的小分子物質(

9、如氨基酸、嘌呤和嘧啶等)的基因，由于這類物質在生命過程中的重要地位，這些基因總是打開著的。只有當細菌生活環境中有充分供應時，才關閉這些基因，停止其合成。弱化子對基因活性的影響在這種調節方式中，起信號作用的是有特殊負載的氨酰-tRNA的濃度，在色氨酸操縱子中就是色氨酰-tRNA的濃度。當操縱子被阻遏，RNA合成被終止時，起終止轉錄信號作用的那一段DNA序列被稱為弱化子。當基因轉錄使轉錄產物（RNA）到不同長度時，核糖體會在對應的DNA位置上；此時RNA可以形成某種形式的二級結構；由此決定延伸復合物的結合能力，從而決定基因能否繼續轉錄。細菌的應急反應細菌有時會碰到緊急狀況，比如氨基酸饑餓氨基酸的全

10、面匱乏。為了緊縮開支，渡過難關，細菌會產生一個應急反應停止包括生產各種RNA、糖、脂肪和蛋白質的幾乎全部生物化學反應過程。實施這一應急反應的信號是鳥苷四磷酸(ppGpp)和鳥苷五磷酸(pppGpp)。產生這兩種物質的誘導物是空載tRNA。當氨基酸饑餓時，細胞中便存在大量的不帶氨基酸的tRNA，這種空載的tRNA會激活焦磷酸轉移酶，使ppGpp大量合成。ppGpp的出現會關閉許多基因，以應付這種緊急狀況。 ppGpp 影響RNA聚合酶與這些基因轉錄起始位點的結合，使基因被關閉。ppGpp與pppGpp的作用范圍十分廣泛，它們影響一大批操縱子而被稱為超級調控因子。62 乳糖操縱子負控誘導系統6.2

11、.1 操縱子: 操縱子模型是與特殊代謝途徑有關的基因轉錄的協同調控模型。操縱子是基因表達和調控的單元，典型的操縱子包括:結構基因：編碼那些在某一特定的生物合成途徑中起作用的、其表達被協同調控的酶。調控元件：如操縱序列，是調節結構基因轉錄的一段DNA序列。調節基因：其產物能夠識別調控元件，例如阻抑物，可以結合并調控操縱基因序列。622 乳糖操縱子大腸桿菌能利用乳糖作為碳源，而利用乳糖作為碳源的酶只有當乳糖成為惟一的碳源時才會被合成。大腸桿菌乳糖操縱子(lactose operon)包括3個結構基因:Z、Y和A。這三個結構基因被同一個轉錄單元lacZYA所編碼，它有一個啟動子Plac。乳糖操縱子的

12、這三個結構蛋白是作為一個多順反子的mRNA一起表達的。lacZYA轉錄單元含有一個操縱基因位點0lac，它位于Plac啟動子5端的-5至+21之間。該位點可被乳糖阻抑物相結合。當該蛋白結合到操縱基因上時，便成為轉錄的強抑制物。乳糖阻抑物被一個獨立的調節基因lac I所編碼，lac I也是乳糖操縱子的一部分;lac I位于Plac的上游。lacZ編碼-半乳糖苷酶，它可以將乳糖水解為半乳糖和葡萄糖。lacY編碼半乳糖苷透性酶，它能將乳糖運送透過細菌的細胞壁。lacA編碼硫代半乳糖苷乙酰轉移酶。lacI基因編碼乳糖阻抑物，當以同亞基四聚體形式存在對具有活性。它對于lac操縱序列結合位點0lac具有很

13、強的親和力，并且對DNA也有較高的親和力。Zac操縱序列位點由具有回文結構的28bp堿基組成 (回文結構是指當一條鏈以5到3的順序從左向右讀對其DNA序列與它的互補鏈也以5至3的方向從右向左讀時完全相同)。操縱序列的這種反向重復對稱正好與由四個相同亞基組成的乳糖阻抑物的內部對稱相匹配。當乳糖缺乏時，阻抑物占據了操縱序列的結合位點， RNA聚合酶不能通過操縱序列。乳糖阻抑物和RNA聚合酶能夠同時結合到乳糖啟動子和操縱序列位點上。乳糖阻抑物使聚合酶結合到乳糖啟動子上的能力增加了兩個數量級。當乳糖阻抑物結合到0lac操縱序列上時，聚合酶是結合到相鄰的Plac啟動子序列上的，只是不能通過之。當缺少誘導

14、物時，乳糖阻抑物阻礙了幾乎全部的lacZYA的轉錄而使之保持很低的轉錄水平。將乳糖加入細胞中后，細胞本身所含的低量的透性酶使它能吸收乳糖，-半乳糖苷酶則催化一些乳糖轉化為異乳糖。異乳糖可以作為誘導物結合到乳糖阻抑物上。從而引起阻抑物四聚體構象的變化，從而降低其對乳糖操縱序列的親和力，乳糖阻抑物從操縱序列上脫離下來可以使聚合酶 (已經位于鄰近的啟動子上)迅速開始lacZYA基因的轉錄。因此，加入乳糖或合成誘導物如異丙基-D-硫代半乳糖苷(IPTG)能非常迅速地刺激乳糖操縱子結構基因的轉錄。若隨后將誘導物清除掉則會導致誘導性轉錄的立即終止，這是因為游離的乳糖阻抑物會立即重新占據操縱序列上的位點，而

15、lac ZYA RNA的轉錄物是極不穩定的。Plac啟動子不是強啟動子。其原因是Plac及其相關的啟動子沒有強的-35序列，其中一些甚至只有弱的-10的共有序列。為了實現高水平的轉錄，它們需要一種特定的激活蛋白即cAMP受體蛋白(CRP)的活化。cAMP即環式AMP，其在生物表達調控過程中起著重要作用。葡萄糖的降解代謝會抑制一些操縱子的轉錄。cAMP在細胞中的增加對這些操縱子的轉錄是有利的。葡萄糖降解物能抑制細胞內cAMP產生。這是因為ATP是cAMP的直接代謝前體，擔任這種轉化的酶是腺苷酸環化酶(adenylcyclase)，此酶受葡萄糖代謝降解物的直接抑制從而造成cAMP不能產生。CRP也

16、可稱為分解代謝激活蛋白或CAP是以以二聚體形式存在的。當葡萄糖存在時，大腸桿菌不需要像乳糖這樣的替代碳源。因此代謝操縱子如乳糖操縱子通常不被激活。原因是當葡萄糖存在時會降低細胞內cAMP的水平， CRP自身不能獨立與DNA結合；當葡萄糖缺乏時，大腸桿菌細胞內cAMP水平上升，CRP結合到cAMP上。CRP-cAMP復合物可結合到緊鄰RNA聚合酶結合位點上游的乳糖操縱子的啟動子Plac上游。能使DNA雙螺旋發生彎曲，有利于形成穩定的開放型啟動子-RNA聚合酶結構，使轉錄效率提高50倍。而阻遏物則是一個抗解鏈蛋白(antimeltingpmte五n)，阻止形成開放結構，從而抑制RNA聚合酶的功能。

17、lac 操縱子小結通常情況（葡萄糖供應正常）阻遏蛋白與操縱序列結合，基因不轉錄。細胞外的乳糖通過透性酶吸收到細胞內；細胞內的-半乳糖苷酶將乳糖轉變為異乳糖。異乳糖結合到乳糖阻抑物上使之從操縱序列上脫離，聚合酶迅速開始lacZYA基因的轉錄。這就是負控誘導。然而，還需要細菌生長系統中缺少葡萄糖，使cAMP含量增加，才有足夠量的cAMP與CRP結合形成CRP-cAMP復合物結合于Plac上游。使DNA雙螺旋發生彎曲，轉錄才可以有效地進行。6.3 色氨酸操縱子與負控阻遏系統色氨酸操縱子包括色氨酸合成途經中相關的5個結構基因。該操縱子編碼一個轉錄單元，即從色氨酸啟動子Ptrp和操縱基因位點Otrp向下

18、游轉錄出7kb的轉錄物。像許多涉及氨基酸生物合成的操縱子一樣，色氨酸操縱子也具有當細胞內缺乏生物合成途徑所需的色氨酸時，可使這些基因協同表達的進化系統。色氨酸阻抑物獨立的操縱子trpR編碼的產物-色氨酸阻抑物，能與色氨酸操縱子的操縱基因位點特異性相互作用。操縱基因序列是色氨酸阻抑物的結合位點。操縱基因序列有部分對稱序列。操縱基因的部分對稱序列與色氨酸啟動子序列在-21和+3堿基之間重疊。中心結合區是18個堿基的回文結構。色氨酸阻抑物能結合色氨酸并且只有當它與色氨酸結合形成復合物后才能結合到操縱基因上。阻抑物是含有兩個亞基的二聚體。這一阻抑物二聚體含有一個中心區域和兩個靈活的DNA解讀頭部 (D

19、NA-reading head)，這兩個解讀頭部分別由一個亞基的羧基端形成。只有當色氨酸結合到阻抑物上時，這些解讀頭部才會處于證確的距離，側鏈才會處于正確的構象從而與色氨酸操縱基因的DNA連續的大溝相互作用 ，這樣色氨酸操縱子所編碼的酶的終產物，即色氨酸才可作為共阻抑物起作用，并且通過終產物抑制自身的合成。該阻抑物將轉錄的起始減少了大約70倍。弱化子色氨酸操縱子對轉錄水平的調控與阻抑物有關。另外，如果在操縱基因和trpE基因編碼序列之間的一段序列缺失，會導致基本轉錄水平和活化 (解阻抑)-轉錄水平的上升。該段序列稱為弱化子，它位于trpE起始密碼子前面162nt的轉錄前導序列的123150位。

20、弱化子是一個不依賴因子的終止子區城，在一小段富含GC的回文結構之后是8個連續的U殘基。如果這段序列能在RNA轉錄物中形成發夾結構，就可以作為一個高效的轉錄終止子，因而只有14Obp的轉錄物被合成。如果弱化子缺失，轉錄將被通讀，結構基因將被轉錄。前導RNA結構色氨酸操縱子RNA的前導序列含有4個序列互補區，能形成不同的堿基配對的RNA結構。它們被稱為序列1、2、3和4。弱化子發夾結構是序列3和4配對的產物 (3:4結構)。序列1和2也是互補的，能形成另一個發夾結構1:2。然而序列2還和序列3互補。如果序列2和3形成2:3發夾結構，3:4弱化子發夾結構就不能形成，轉錄就不會終止。在正常情況下，1:

21、2和3:4發夾結構的形成在能量上是有利的。前導肽前導RNA序列中含有一個有效的核糖體結合位點并能形成由前導RNA 2768號堿基所編碼的14個氨基酸的前導肽。這段前導肽的第10和第11個密碼子編碼連續的色氨酸殘基。色氨酸是稀有氨基酸；通常兩個色氨酸密碼子連續出現的可能性很小，在色氨酸含量很低的情況下核糖體將會在這個位點停滯。前導肽的作用就是決定色氨酸的含量并控制轉錄的終止。弱化作用大腸桿菌中，翻譯在mRNA邊轉錄時邊進行。色氨酸前導肽編碼序列的3端與互補序列1重疊，兩個色氨酸密碼子都在序列1內，終止密碼子在序列1和2之間。由于色氨酸 (色氨酸操縱子合成的酶的最終產物)是翻譯過程中所必需的，因此

22、細胞對它的含量很敏感，它決定了在mRNA中終止子(3:4)發夾結構是否形成。在色氨酸操縱子轉錄進行的過程中，RNA聚合酶在序列2的末端停滯直到核糖體開始翻譯前導肽（即當前導肽開始翻譯時，RNA聚合酶才又繼續沿DNA模板鏈前進合成RNA）。在色氨酸含量很高的情況下，核糖體迅速在兩個色氨酸密碼子處插入色氨酸，這樣翻譯可直達前肽導末端。核糖體封閉了序列2，當RNA聚合酶把3區和4區轉錄出來時，3:4發夾得以形成，當RNA聚合酶到達終止序列時，由于3:4發夾使轉錄可能被終止。這一過程被稱為弱化作用。另一種情況是:如果色氨酸缺乏時，翻譯過程中將缺少其氨酰tRNA，核糖體將在兩個色氨酸密碼子上滯留，封閉了

23、序列1。這使得序列2能自由地與序列3形成發夾結構（即抗終止子）。終止子 (3:4)發夾結構不能形成，轉錄繼續到trpE及其下游。因此終產物色氨酸含量的高低決定了轉錄是提早終止 (弱化)，還是繼續轉錄完整個操縱子。弱化的重要性依靠弱化作用，色氨酸的存在就使色氨酸操縱子的轉錄被抑制了10倍。與色氨酸阻抑物的作用 (70倍)合在一起，這就意味著色氨酸水平對色氨酸操縱子的表達施加了700倍的調節效果。在六種與氨基酸的生物合成相關的操縱子中有弱化作用。例如his操縱子含有編碼一個有連續7個組氨酸密碼子的多肽的前導序列。并不是所有這些操縱子都像色氨酸操縱子那樣有協同調控。例如his操縱子就沒有阻抑物-操縱

24、基因調控，弱化作用是其惟一的反饋調控機制。64 轉錄后調控基因表達的轉錄調控是生物最經濟的調控方式既然是用不著某種蛋白質，其mRNA由于用不著就不必轉錄。但轉錄生成mRNA以后，再在翻譯或翻譯后水平進行微調，是對轉錄調控的補充，它使基因表達的調控更加適應生物本身的需求和外界條件的變化。641 翻譯起始的調控遺傳信息翻譯成多肽鏈起始于而mRNA上的核糖體結合位點(RBS)。所謂RBS，是指起始密碼子AUG上游的一段非翻譯區。在RBS中有SD(Shine-Dalg-arno)序列，長度一般為5個核苷酸，富含 G、A，該序列與核糖體16SrRNA的3端互補配對，促使核糖體結合到mRNA上，有利于翻譯的起始。RBS的結合強度取決于SD序列的結構及其與起始密碼AUG之間的距離。SD與AUG之間相距一般以4-10個核苷酸為佳，9個核苷酸最佳。mRNA的二級結構是翻譯起始調控的重要因素。 mRNA 5端合適的空間結構有利于核糖體的30 S亞基與之相結合。SD序列的微小變化，往往會導致表達效率上百倍甚至上千倍的差異，這是由于核苷酸的變化改變了形成mRNA 5端二級結構的自由能，影響了核糖體30 S亞基與mRNA的結合，從而造成了蛋白質合成效率上的差異。