1、實(shí)驗(yàn)二 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?實(shí)驗(yàn)原理 實(shí)驗(yàn)儀器、材料與試劑 實(shí)驗(yàn)步驟 實(shí)驗(yàn)結(jié)果及討論 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?了解瓊脂糖凝膠電泳的原理掌握瓊脂糖凝膠的制作及進(jìn)行電泳的方法 瓊脂糖是一種天然聚合長(zhǎng)鏈狀分子，沸水中溶解，45 開始形成多孔性剛性濾孔，凝膠孔徑的大小決定于瓊脂糖的濃度。DNA分子在堿性環(huán)境中帶負(fù)電荷，在外加電場(chǎng)作用下向正極泳動(dòng)。DNA分子的遷移速度與相對(duì)分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)成反比。瓊脂糖是一種線性多糖聚合物。濃度越高，孔隙越小，其分辨能力就越強(qiáng)。瓊脂糖濃度(%)線型DNA分子的分離范圍(Kb)0.35600.61200.70.8100.90.571.20.961.50.2312.00

2、.12DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動(dòng)時(shí)，有電荷效應(yīng)與分子篩效應(yīng)。不同的DNA，分子量大小及構(gòu)型不同，電泳時(shí)的泳動(dòng)率就不同，從而分出不同的區(qū)帶。瓊脂糖凝膠電泳法分離DNA，是利用分子篩效應(yīng)，遷移速度與分子量的對(duì)數(shù)值成反比關(guān)系，可依據(jù)DNA分子的大小使其分離。該過程可以通過把分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物和樣品一起進(jìn)行電泳而得到檢測(cè)。溴化乙錠在紫外光照射下能發(fā)射熒光，當(dāng)DNA樣品在瓊脂糖凝膠中從負(fù)極向正極泳動(dòng)時(shí)，溴化乙錠從正極向負(fù)極移動(dòng)，這樣溴化乙錠分子就會(huì)嵌入DNA分子中形成絡(luò)合物，使DNA在紫外光下發(fā)射很強(qiáng)的熒光。在溴化乙錠足夠的情況下，熒光的強(qiáng)度正比于DNA的含量，這樣就可以檢測(cè)DNA的濃度。實(shí)驗(yàn)儀器、材料

3、與試劑 （一） 儀器 1. 水平式凝膠電泳槽 2. 穩(wěn)壓電泳儀 3. 電爐 4. 紫外檢測(cè)儀 5. 臺(tái)式離心機(jī) （二） 材料 實(shí)驗(yàn)一中的PCR產(chǎn)物溴化乙錠（EB）是一種熒光染料，EB分子可嵌入核酸雙鏈的堿基對(duì)之間，在紫外線激發(fā)下，發(fā)出紅色熒光。其熒光強(qiáng)度與DNA的含量成正比。據(jù)此可粗略估計(jì)樣品DNA濃度。 瓊脂糖凝膠EB染色，肉眼可見核酸電泳帶，其DNA量一般5ng。核酸染色劑注意事項(xiàng)：EB是致癌物質(zhì)，切勿用手接觸，更不要污染環(huán)境。電泳指示劑溴酚蘭在堿性液體中呈紫蘭色，一般與蔗糖、甘油或聚蔗糖400組成上樣緩沖液。 作用：增加樣品比重，以確保DNA均勻沉入加樣孔內(nèi)。形成肉眼可見的指示帶，預(yù)測(cè)核

4、酸電泳的速度和位置。使樣品呈色，使加樣操作更方便。上樣緩沖液實(shí)驗(yàn)步驟：瓊脂糖凝膠制備1. 洗凈電泳槽、制膠槽、梳子、擋板，晾干。 2. 插好擋板、梳子。 3. 根據(jù)實(shí)驗(yàn)所需稱取0.4克瓊脂糖，放入制膠 的容器中（一般用三角瓶），然后加入40ml電泳緩沖液（1TAE）。 4. 加熱煮沸，使瓊脂糖完全溶解。 5. 溶液冷至約60時(shí)，加入溴化乙錠4 L (終濃度為0.5 g/ml)，輕輕搖勻，倒入制膠槽上，檢查有無氣泡。6. 室溫下約30-45分鐘后，瓊脂糖溶液完全凝固，小心垂直拔出梳子和擋板，清除碎膠，將凝膠放入電泳槽中。 7. 加入電泳緩沖液（1TAE）至電泳槽中，使液面高于膠面約1mm。 8.

5、在DNA樣品中加入2 L (1/10體積)的10 DNA上樣緩沖液(loading buffer)，混勻，稍甩一下，使溶液都處于離心管底。 9.用移液器吸起離心管中溶液，移入凝膠的梳孔中。PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳使用3 mg的DNA Marker DL2,000（500 ng/條帶）進(jìn)行1%的瓊脂糖凝膠電泳后，各DNA條帶自上至下分別為2kb，1Kb，750bp，500bp，250bp，100bp。關(guān)于瓊脂糖凝膠電泳的實(shí)驗(yàn)技巧和方法幾點(diǎn)注意事項(xiàng)：1.）加樣時(shí)槍頭不要碰壞凝膠壁，否則DNA的帶型將不會(huì)整齊，加樣前要用槍頭吸打凝膠孔中的溶液，以趕走樣品空中的氣泡。2.）每孔最大DNA上樣量決定于

6、DNA樣品片段的大小、數(shù)目及樣品孔形狀與容量。3.）應(yīng)注意每孔最大上樣容量及樣品孔體積，以免加樣時(shí)樣品流入附近樣品孔造成交叉污染，影響結(jié)果分析。問答題1.影響電泳遷移率的因素有哪些？2.試述瓊脂糖凝膠電泳分離DNA的原理。復(fù)習(xí)思考題用多功能DNA純化回收試劑盒（離心柱型）回收DNA在高濃度鹽離子存在的情況下,DNA片斷選擇性的吸附于離心柱內(nèi)的硅基質(zhì)膜上,再通過一系列快速的漂洗離心的步驟去蛋白液和漂洗液將引物,核苷酸,蛋白酶等雜質(zhì)去除,最后低鹽,高PH值的洗脫緩沖液將純凈DNA從硅基質(zhì)膜上洗脫。1在長(zhǎng)波紫外燈下,用干凈刀片將所需回收的DNA條帶切下,盡量切除不含DNA的凝膠,得到凝膠體積越小越好

7、。2將切下含有DNA條帶凝膠放入1.5ml離心管,稱重。 先稱一個(gè)空1.5ml離心管重量,然后放入凝膠塊后再稱一次,兩次重量相減,得到凝膠的重量。3. 加三倍體積溶膠/結(jié)合液DB。 如果凝膠重為0.1g,其體積可視為100l,則加入300l溶膠液。456水浴放置5分鐘（或直至膠完全溶解）。每2-3分鐘渦旋震蕩一次幫助加速溶解。5將上一步所得溶液加入吸附柱AC中（吸附柱放入收集管中）, 12,000 rpm離心30-60秒,倒掉收集管中的廢液。 如果總體積超過750l，可分兩次將溶液加入同一個(gè)吸附柱AC中。6加入700l漂洗液WB（請(qǐng)先檢查是否已加入無水乙醇!）,12,000 rpm 離心1分鐘,棄掉廢液。7加入500l漂洗液WB 12,000 rpm 離心1分鐘,棄掉廢液。 8將吸附柱AC放回空收集管中,12,000 rpm離心2分鐘,盡量除去漂洗液, 以免漂洗液中殘留乙醇抑制下游反應(yīng)。8.取出吸附柱AC,放入