1、第七講原核基因表達調控模式 華銳學院理工系華銳學院分子生物學課件8/25/2022 基因表達(gene expression)是指生物基因組中結構基因所攜帶的遺傳信息經轉錄、翻譯等一系列過程，合成特定的物質，進而發揮其特定的生物學功能和生物學效應的全過程。對這個過程的調節就稱為基因表達調控（gene regulation或gene control）。 生物學意義：適應環境、維持生長和增殖；維持個體發育和分化。8/25/2022高進勇8/25/2022高進勇原核生物和真核生物都能夠根據周圍環境(如溫度、營養成分等)的變化，改變自己的代謝方式。而代謝方式的變化通常可以通過對基因表達過程的調控得以實

2、現。機體可以在基因表達過程的任何階段進行調控，一般以轉錄水平上的調控為主。8/25/2022高進勇原核生物細胞的基因和蛋白質種類較少，如大腸桿菌基因組約為4.60106bp共有4 288個可以框架。據估計，一個細胞中總共含有107個蛋白質分子。如果每個基因等同翻譯的話，任何一個多肽應有2 500拷貝。但是，這些蛋白質并不是以相同拷貝數存在于每個細胞中的，有些蛋白質的數目相當固定，另一些則變化很大。8/25/2022高進勇每個大腸桿菌細胞有約15 000個核糖體，50種核糖體蛋白、糖酵解體系的酶、DNA聚合酶、RNA聚合酶等都是代謝過程中必需的，其合成速率不受環境變化或代謝狀態的影響，這一類蛋白

3、質被稱為永久型（constitutive）合成的蛋白質。8/25/2022高進勇另一類則被稱為適應型或調節型（adaptive or regulated），因為這類蛋白質的合成速率明顯地受環境的影響而改變。如大腸桿菌細胞中一般只有15個-半乳糖苷酶，但若將細胞培養在只含乳糖的培養基中，每細胞中這個酶的量可高達幾萬個分子。8/25/2022高進勇7.1.1基因表達調控的基本概念順式作用元件：對基因表達有調節活性的DNA序列，其活性只影響與其自身同在一個DNA分子上的基因；順式作用元件通常不編碼蛋白質，多位于基因旁或內含子中。如啟動子、終止子、操縱基因等。7. 1 原核基因表達調控總論8/25/2

4、022高進勇反式作用因子：通過擴散自身表達產物（酶、調節蛋白）控制其他基因的表達,反式作用因子通常為的蛋白質或RNA。如調控蛋白、轉錄因子等。基因表達的調控主要通過反式作用因子和順式作用元件相互識別、相互作用而實現。8/25/2022高進勇轉錄因子（transcription factor ）是轉錄起始過程中RNA聚合酶所需要的輔助因子。轉錄因子是參與正調控的反式作用因子，在無轉錄因子時，RNA聚合酶不能起始轉錄。轉錄因子通常識別位于基因上游啟動子附近的順式作用元件。8/25/2022高進勇基因表達調控主要表現在以下二方面：轉錄水平上的調控(transcriptional regulation

5、)；轉錄后水平上的調控（post-transcriptional regulation），包括（1）mRNA加工成熟水平調控（differential processing of RNA transcrpt）；（2）翻譯水平調控（differential translation of mRNA）。8/25/2022高進勇 基因調控的指揮系統也是多樣的，不同的生物使用不同的信號來指揮基因調控。原核生物中，營養狀況(nutritional status)和環境因素(environment factor)對基因表達起著舉足輕重的影響。在真核生物尤其是高等真核生物中，激素水平和發育階段是基因表達調控的

6、最主要手段，營養和環境因素的影響力大為下降。8/25/2022高進勇 在轉錄水平上對基因表達的調控決定于DNA的結構、RNA聚合酶的功能、蛋白因子及其他小分子配基的相互作用。細菌的轉錄與翻譯過程幾乎發生在同一時間間隔內，轉錄與翻譯相耦聯（coupled transcription and translation）。真核生物中，轉錄產物（primary transcript）只有從核內運轉到核外，才能被核糖體翻譯成蛋白質。8/25/2022高進勇8/25/2022高進勇原核生物的基因調控主要是轉錄調控，包括負轉錄調控和正轉錄調控。在負轉錄調控系統中，調節基因的產物是阻遏蛋白（repressor）

7、，阻止結構基因轉錄。根據其作用特征又分為負控誘導和負控阻遏兩大類。7.1.2原核基因的調控分類8/25/2022高進勇在負控誘導系統中，阻遏蛋白不與效應物（誘導物）結合時，結構基因不轉錄；在負控阻遏系統中，阻遏蛋白與效應物結合時，結構基因不轉錄。阻遏蛋白作用于操縱區。8/25/2022高進勇在正轉錄調控系統中，調節基因的產物是激活蛋自(activator)。也可根據激活蛋白的作用性質分為正控誘導系統和正控阻遏系統。在正控誘導系統中，效應物分子(誘導物)的存在使激活蛋白處于活性狀態；在正控阻遏系統中，效應物分子的存在使激活蛋白處于非活性狀態。8/25/2022高進勇細菌中的轉錄調控體系：(a)負

8、控誘導體系； (b)正控誘導體系8/25/2022高進勇細菌中的轉錄調控體系：(c)負控阻遏體系； (d)正控阻遏體系8/25/2022高進勇 參與大腸桿菌中基因表達調控最常見的蛋白質可能是 因子，基因組序列分析后發現至少存在六種 因子 。除54外，因子在結構上具有同源性，統稱70家族，含有4個保守區，其中第2個和第4個保守區參與結合啟動區DNA，第2個保守區的另一部分還參與雙鏈DNA解開成單鏈的過程。8/25/2022高進勇 大腸桿菌中的因子(以70為例)主要包括四個結構域。8/25/2022高進勇54因子識別并與DNA上的-24和-12區相結合。70啟動子只有在核心酶結合到DNA鏈上之后才

9、能與啟動子區相結合，而54則類似于真核生物的TATA區結合蛋白（TBP），可以在無核心酶時獨立結合到啟動子上。8/25/2022高進勇70 （上）和54 （下） 因子識別并結 合在所調控基因上游的不同區域。8/25/2022高進勇7.1.3 原核基因調控的主要特點 原核生物通過特殊代謝物調節基因活性主要分為可誘導調節和可阻遏調節:1.可誘導調節 是指一些基因在特殊的代謝物或化合物的作用下，由原來關閉的狀態轉變為工作狀態，即在某些物質的誘導下使基因活化。這類基因中最突出的例子是大腸桿菌的乳糖操縱子。8/25/2022高進勇大腸桿菌在含有葡萄糖的培養基中生長良好，在只含乳糖的培養基中開始時生長不好

10、，直到合成了能夠利用乳糖的一系列酶，具備了利用乳糖作為碳源的能力才開始生長。8/25/2022高進勇細菌獲得這一能力的原因就是因為在誘導物乳糖的誘導下啟動了乳糖操縱子，表達它所編碼的3個酶:-半乳糖苷酶使乳糖水解為半乳糖和葡萄糖)，-半乳糖苷透過酶(使乳糖進入細菌細胞內)，-半乳糖苷乙酰基轉移酶(使-半乳糖第六位碳原子乙酰化)。因此，這類基因被稱為可誘導基因，這類酶被稱為誘導酶，這個生物化學過程被稱為酶的誘導合成。8/25/2022高進勇 2.可阻遏調節 這類基因平時都是開啟的，處在產生蛋白質或酶的工作過程中，由于一些特殊代謝物或化合物的積累而將其關閉，阻遏了基因的表達。比如大腸桿菌生活中必須

11、有色氨酸，一般情況下，該操縱子是開啟的。如果在細菌培養基中加入色氨酸，使之能利用培養基中的色氨酸來維持生活而不需要再費力去合成，細菌往往能在2-3 min內完全關閉該操縱子。8/25/2022高進勇這就是說，某一代謝途徑最終產物合成酶的基因可以被這個產物本身所關閉。這種基因被稱為可阻遏基因，這些酶被稱為可阻遏酶，這個現象被稱為可阻遏現象，這些起阻遏作用的小分子被稱為阻遏物。在這里，色氨酸或與其代謝有關的某種物質在阻遏過程(而不是誘導過程)中起作用。8/25/2022高進勇7.1.4 弱化子對基因活性的影響在這種調節方式中，起信號作用的是有特殊負載的氨基酰-tRNA的濃度，在色氨酸操縱子中就是色

12、氨基酰-tRNA的濃度。當操縱子被阻遏，RNA合成被終止時，起終止轉錄信號作用的那一段核苷酸被稱為弱化子。這種因為核糖體在基因轉錄產物上的不同位置，決定了RNA可以形成哪一種形式的二級結構，并由此決定基因能否繼續轉錄的調節方式確實是非常巧妙的。8/25/2022高進勇葡萄糖存在的情況下，即使在細苗培養基中加入乳糖、半乳糖、阿拉伯糖或麥芽糖等誘導物，與其相對應的操縱子也不會啟動，不會產生出代謝這些糖的酶來，這種現象稱為葡萄糖效應或降解物抑制作用。出現這種效應的原因是添加葡萄糖后，細菌所需要的能量便可從葡萄糖得到滿足，葡萄糖是最方便的能源，細菌無需開啟一些不常用的基因去利用這些稀有的糖類。7.1.

13、5 降解物對基因活性的影響8/25/2022高進勇葡萄糖的存在會抑制細菌的腺苷酸環化酶活性，減少環腺苷酸cAMP的合成，與它相結合的蛋白質環腺苷酸受體蛋內(CRP)又稱分解代謝物激活蛋白(CAP)，因找不到配體而不能形成復合物。降解物抑制作用是通過提高轉錄強度來調節基因表達的，是一種積極的調節方式。8/25/2022高進勇細菌有時會碰到緊急狀況，比如氨基酸饑餓時，即氨基酸的全面匾乏。為了緊縮開支，渡過難關，細菌將會產生一個應急反應，包括生產各種RNA、糖、脂肪和蛋白質在內的幾乎全部生物化學反應過程均被停止。實施這一應急反應的信號是鳥苷四磷酸(ppGpp)和鳥苷五磷酸(pppGpp)。產生這兩種

14、物質的誘導物是空載tRNA。7.1.6 細菌的應急反應8/25/2022高進勇當氨基酸饑餓時，細胞中便存在大量的不帶氨基酸的tRNA，這種空載的tRNA會激活焦磷酸轉移酶，使ppGpp大量合成，其濃度可增加10倍以上。 ppGpp的出現會關閉許多基因，當然也會打開一些合成氨基酸的基因，以應付這種緊急狀況。8/25/2022高進勇1961年，Jacob和Monod提出了細菌基因表達調控的模型操縱子學說，解釋了原核生物的基因表達在轉錄水平上是如何調控的。操縱子：是基因表達的協調單位，由啟動子、操縱基因及其所控制的一組功能上相關的結構基因所組成。操縱基因受調節基因產物的控制。7. 2 乳糖操縱子與負

15、控誘導系統8/25/2022高進勇（一）操縱子(operon)的基本組成結構基因、調節基因、操縱基因、啟動子、終止子lacZlacYlacAPlacIPlacOlaclacI8/25/2022高進勇 (1)結構基因(structural gene)是編碼蛋白質或RNA的一段DNA序列。結構基因編碼大量的功能各異的蛋白質。特點：（1）含有2個以上的基因（2）各結構基因串連排列，組成結構基因群lacZlacYlacAPlacIPlacOlaclacI8/25/2022高進勇（3）多個結構基因的DNA被轉錄成多順反子mRNA（4）每個結構基因是一個連續的開放讀框（5）至少在第一個開放讀框5側具有核糖

16、體結合位點(RBS)，核糖體識別并結合 ，起始翻譯。UAAAUGAUGUAA.38/25/2022高進勇(2)調節基因（regulatory gene） （a）概念： (regulator gene)僅指參與其他基因表達調控的RNA和蛋白質的編碼基因。lacZlacYlacAPlacIPlacOlaclacImRNA8/25/2022高進勇（b）調控蛋白類型： 阻遏蛋白（repressive protein）與操縱元件結合后能減弱或阻止所調控基因轉錄的調控蛋白。 激活蛋白（activating protein）與操縱元件結合后能增強或啟動所調控基因轉錄的調控蛋白。8/25/2022高進勇(3)

17、操縱基因(operator gene )通過與調節基因編碼的阻遏子結合或脫離而控制結構基因的轉錄與否的核苷酸序列。位于結構基因附近，本身不能轉錄成mRNA。lacZlacYlacAPlacIPlacOlaclacI8/25/2022高進勇4、啟動子(promoter) 是指能被RNA聚合酶識別、結合并啟動基因轉錄的一段DNA序列。（1）-10序列- Pribnow盒：TATAAT；（2）-35bp序列：TTGACA操縱子至少有一個啟動子，一般在第一個結構基因5上游，控制整個結構基因群的轉錄8/25/2022高進勇5、終止子（terminator） 是給予RNA聚合酶轉錄終止信號的DNA序列（1

18、）不依賴因子的終止子 （2）依賴因子的終止子在一個操縱元中至少在結構基因群最后一個基因的后面有一個終止子 8/25/2022高進勇lacZlacYlacAPlacIPlacOlaclacI(二)乳糖操縱子（1）組成：5種元件由1個調節基因，3個結構基因、控制元件、啟動子和終止子組成。8/25/2022高進勇8/25/2022高進勇1、結構基因（1）lacZ：編碼 -半乳糖苷酶 （使乳糖水解）（2）lacY：編碼 -半乳糖苷透過酶 （使 -半乳糖苷透過細胞壁、質膜進入細胞內）（3）lacA：編碼 -半乳糖苷乙酰轉移酶 （將乙酰基轉移到 -半乳糖苷上）2、啟動子： Plac：控制 lacZ, la

19、cY, lacA；多順反子的mRNA3、終止子8/25/2022高進勇4、調節基因lacI：編碼阻遏蛋白（repressive protein）亞基 四聚體存在時具有活性，與 Olac具有 很強的親和力。lacZlacYlacAPlacIPlacOlaclacI8/25/2022高進勇5、控制元件 Olac （1）28bp的回文結構，可形成十字形結構 （2）這種結構正好與由四個相同亞基組成的阻遏蛋白相匹配。8/25/2022高進勇lac操縱子主要成分分析8/25/2022高進勇-50-30-1010130-20-4020lacZlacYlacAPlacIPlacOlaclacImRNA（三）乳

20、糖操縱子的負調控培養基不含乳糖 lacZ、 lacY 、 lacA低表達8/25/2022高進勇（三）乳糖操縱子的負調控1、阻遏蛋白與操縱元件結合2、阻礙了RNA聚合酶與啟動子Plac的結合 3、轉錄不能進行4、lacZ， lacY 、lacA低表達8/25/2022高進勇lacZlacYlacAPlacIPlacOlaclacImRNA Inducer（異構乳糖）lactose分解lactose（四）乳糖操縱子與負控誘導系統培養基含乳糖 -lacZ 等高表達8/25/2022高進勇（四）乳糖操縱子與負控誘導系統1、阻遏蛋白與異構乳糖結合2、阻遏蛋白構象變化，不能與操縱子序列結合3、RNA聚合

21、酶與lac啟動子結合4、lacZ， lacY ， lacA的轉錄可順利進行8/25/2022高進勇7. 2. 1 酶的誘導lac體系受調控的證據一般情況下，lac+基因型大腸桿菌細胞內-半乳糖苷酶和透過酶的濃度很低，每個細胞只有12個酶分子。但是，在乳糖培養基上酶的濃度很快達到細胞總蛋白量的6%或7%，超過105個酶分子/細胞。8/25/2022高進勇在無葡萄糖有乳糖的培養基中，lac+細菌中將同時合成-半乳糖苷酶和透過酶。用32P標記的mRNA與模板DNA進行定量分子雜交，表明培養基中加入乳糖12分鐘后，編碼-半乳糖苷酶和透過酶的lac mRNA量就迅速增加，去掉乳糖后，lac mRNA量立

22、即下降。8/25/2022高進勇 lac體系的“開-關”特性 加入乳糖以后，1min內出現lac mRNA，稍后即產生-半乳糖苷酶和透過酶。當移去乳糖后， lac mRNA總量立即下降，兩種酶活性卻由于蛋白質半衰期較長而在相當長時期內維持恒定。8/25/2022高進勇實驗室常用兩種乳糖類似物異丙基巰基半乳糖苷（IPTG）和巰甲基半乳糖苷（TMG），在酶活性分析中常用發色底物O-硝基半乳糖苷（ONPG）。因為它們都不是半乳糖苷酶的底物，所以又稱為安慰性誘導物（ gratuitous inducer）。8/25/2022高進勇8/25/2022高進勇用35S標記大腸桿菌細胞（培養基中沒有半乳糖），

23、將這些帶有放射性的細菌轉移到不含35S的培養基中，加入誘導物后-半乳糖苷酶便開始合成。分離純化-半乳糖苷酶，發現這種酶無35S標記，說明這種酶是加入誘導物后新合成的。8/25/2022高進勇7. 2. 2 操縱子模型及其影響因子Jacob和Monod認為誘導酶（他們當時稱為適應酶）現象是個基因調控問題，而且可以用實驗方法進行研究，他們通過大量實驗及分析，建立了現在已經被人們廣泛接受的乳糖操縱子的控制模型。8/25/2022高進勇 lac操縱子調控模型8/25/2022高進勇A. Z、Y、A基因產物由同一條多順反子mRNA分子所編碼。B. 該mRNA分子的啟動區（P）位于阻遏基因（I）與操縱區（

24、O）之間，不能單獨起始半乳糖苷酶和透過酶基因的高效表達。C. 操縱區是DNA上的一小段序列（僅為26bp），是阻遏物的結合位點。8/25/2022高進勇D. 當阻遏物與操縱區相結合時，lac mRNA的轉錄起始受到抑制。E. 誘導物通過與阻遏物結合，改變其三維構象，使之不能與操縱區相結合，誘發lac mRNA的合成。8/25/2022高進勇培養基中有無誘導物對lac mRNA及-半乳糖苷酶活性的影響8/25/2022高進勇阻遏物lac I基因產物及功能lac操縱子阻遏物mRNA是由弱啟動子控制下永久型合成的，該阻遏蛋白有4個相同的亞基，每個亞基均含有347個氨基酸殘基，并能與1分子IPTG結合

25、，每個細胞中有510個阻遏物分子。8/25/2022高進勇-半乳糖苷酶在乳糖代謝中的作用是把前者分解成葡萄糖及半乳糖。如果將葡萄糖和乳糖同時加入培養基中，大腸桿菌在耗盡外源葡萄糖之前不會誘發lac操縱子。8/25/2022高進勇當葡萄糖和乳糖同時存在于培養基中時，lac 啟動子表達受阻，沒有-半乳糖苷酶活性；當葡萄糖消耗以后(圖中箭頭處)，細胞內cAMP濃度增加， -半乳糖苷酶活性增加，一度停止生長的細胞又恢復分裂。8/25/2022高進勇某大腸桿菌突變體，它不能將葡萄糖-6-磷酸轉化為下一步代謝中間物，該細菌的lac基因能在葡萄糖存在時被誘導合成。所以，不是葡萄糖而是它的某些降解產物抑制la

26、c mRNA的合成，科學上把葡萄糖的這種效應稱之為代謝物阻遏效應（catabolite repression）。8/25/2022高進勇 cAMP與代謝物激活蛋白cAMP是在腺苷酸環化酶的作用下由ATP轉變而來的，在真核生物的激素調節過程中也起著十分重要的作用。將細菌放在含葡萄糖的培養基中培養，cAMP的濃度就低；如果培養基中只有甘油或乳糖等不進行糖酵解途徑的碳源，cAMP的濃度就會很高。8/25/2022高進勇環腺苷酸化學式8/25/2022高進勇 大腸桿菌中的代謝物激活蛋白，由Crp基因編碼，能與cAMP形成復合物。CRP和cAMP都是合成lac mRNA所必需的，cAMP-CRP是一個不

27、同于阻遏物的正調控因子，而lac操縱子的功能是在這兩個相互獨立的調控體系作用下實現的。8/25/2022高進勇gal，lac和ara操縱子上游啟動子區與CRP-cAMP結合位點的相對位置分析8/25/2022高進勇半乳糖、麥芽糖、阿拉伯糖、山梨醇等在降解過程中均轉化成葡萄糖或糖酵解途徑中的其他中間產物，這些糖代謝中有關的酶都是由可誘導操縱子控制的，被稱為降解物敏感型操縱子(catabolitesensitive operon)，由cAMP-CRP調控。8/25/2022高進勇大腸桿菌lac操縱子啟動區CRP-cAMP及-35區，-10區序列分析。8/25/2022高進勇cAMP-CRP復合物與

28、啟動子區的結合是lac mRNA合成起始所必需的，因為這個復合物結合于啟動子上游，能使DNA雙螺旋發生彎曲，有利于形成穩定的開放型啟動子-RNA聚合酶結構。阻遏物則是一個抗解鏈蛋白，阻止形成開放結構，從而抑制RNA聚合酶的功能。8/25/2022高進勇CRP-cAMP 與上游DNA位點結合后造成模板DNA沿對稱序列中央發生90的彎曲8/25/2022高進勇附：葡萄糖水平CRP的關系 CRP只有與cAMP結合才有活性，而cAMP 受葡萄糖水平的控制。 葡萄糖含量高- cAMP水平低 葡萄糖含量低- cAMP水平高8/25/2022高進勇7. 2. 3 lac操縱子的調控區域P、O區P區（即啟動子

29、區）一般是從I基因結束到mRNA轉錄起始位點下游5-10bp，而O區（即阻遏物結合區）位于-7+28位，該區的堿基序列有對稱性，其對稱軸在+11位堿基對。8/25/2022高進勇不同操縱子啟動區及O區相對位置的比較。8/25/2022高進勇7. 3 色氨酸操縱子與負控阻遏系統色氨酸是構成蛋白質的組分，一般的環境難以給細菌提供足夠的色氨酸，細菌要生存繁殖通常需要自己經過許多步驟合成色氨酸。一旦環境能夠提供色氨酸時，細菌就會充分利用外界的色氨酸、減少或停止合成色氨酸，以減輕自己的負擔。細菌所以能做到這點是因為有色氨酸操縱子(trp operon)的調控。8/25/2022高進勇大腸桿菌中trp操縱

30、子8/25/2022高進勇7.3.1 色氨酸操縱子的結構8/25/2022高進勇7.3.2. 阻遏蛋白的負調控 合成色氨酸所需酶類的基因E、D、C、B、A等頭尾相接串連排列組成結構基因群，受其上游的啟動子Ptrp和操縱子O的調控，調控基因trpR的位置遠離P-O-結構基因群，在自身的啟動子作用下，以組成性方式低水平表達分子量為47000的調控蛋白R，R并沒有與O結合的活性，當環境能提供足夠濃度的色氨酸時，R與色氨酸結合后構象變化而活化，就能夠與O特異性親和結合，阻遏結構基因的轉錄。8/25/2022高進勇 因此色氨酸操縱子屬于一種負性調控的、可阻遏的操縱子（repressible operon

31、），即這操縱子通常是開放轉錄的，有效應物（色氨酸為阻遏劑）作用時則阻遏關閉轉錄。細菌不少生物合成系統的操縱子都屬于這種類型，其調控可使細菌處在生存繁殖最經濟最節省的狀態。8/25/2022高進勇當缺乏色氨酸時,該操縱子開放表達阻遏物當存在色氨酸時，該操縱子關閉8/25/2022高進勇7.3.3. 弱化子及其作用 實驗觀察表明：當色氨酸達到一定濃度、但還沒有高到能夠活化R使其起阻遏作用的程度時，產生色氨酸合成酶類的量已經明顯降低，而且產生的酶量與色氨酸濃度呈負相關。仔細研究發現這種調控現象與色氨酸操縱子特殊的結構有關。8/25/2022高進勇在色氨酸操縱子PO與第一個結構基因trpE之間有162

32、bp的一段前導區（leading sequence，L），實驗證明當色氨酸有一定濃度時，RNA聚合酶的轉錄會終止在這里。 這段序列中含有編碼由14個氨基酸組成的短肽的開放閱讀框，其序列中有2個色氨酸相連，在此開放閱讀框前有核糖體識別結合位點（RBS）序列，提示這段短開放閱讀框在轉錄后是能被翻譯的。8/25/2022高進勇前導序列 trp L (leader sequence) :在trp mRNA 5端trpE基因的起始密碼前一個長162bp的mRNA片段。起著隨色氨酸濃度升高降低轉錄的作用；弱化子(attenuator) ：也稱內部終止子， DNA中可導致轉錄過早終止的一段核甘酸序列（123

33、-150bp）。弱化作用(attenuation) ：弱化子控制RNA聚合酶通讀弱化子能力的調控機制。8/25/2022高進勇弱化子8/25/2022高進勇 mRNA前導區序列分析 trp前導區的堿基序列已經全部測定， 發現完整的前導序列可分為1、2、3、4區域，這四個區域的片段能以兩種不同的方式進行堿基配對。8/25/2022高進勇色氨酸操縱子的轉錄與翻譯調控8/25/2022高進勇 有時以1-2和3-4配對，有時只以2-3方式互補配對。核糖體經過前導區繼續翻譯的能力控制著這兩種結構的轉換，它決定mRNA是否形成終止所需的結構。前導序列的終止區與一般的轉錄終止位點特點相同，具有成串的 U和潛

34、在的能形成莖環的二重對稱結構。8/25/2022高進勇 通過RNaseT1降解實驗（此酶不水解配對的RNA）表明純化的trp前導序列中只有1-2和3-4的配對方式。由此定位的3-4配對區正好位于終止密碼子識別區，當這個區域發生破壞自我堿基突變，有利于轉錄的繼續進行。 8/25/2022高進勇 轉錄的弱化理論認為，mRNA轉錄的終止是通過前導肽基因的翻譯來調節的，在前導肽基因中有兩個相鄰的色氨酸密碼子，在翻譯時對tRNATrp的濃度十分敏感。當培養基中色氨酸的濃度很低時，負載有色氨酸的tRNATrp也少，由此推斷，翻譯通過兩個相鄰色氨酸密碼子的速度就會很慢，當4區被轉錄完成時，核糖體才進行到1區

35、（或停留在兩個相鄰的色氨酸密碼子處），8/25/2022高進勇 這時的前導區結構是2-3配對，不形成3-4配對的終止結構，所以轉錄可繼續進行，直到將色氨酸操縱子中的結構基因全部轉錄完畢為止。測定結果發現，在缺乏色氨酸時所有的RNA聚合酶都能經過弱化子繼續參與轉錄。加上取消阻遏增加的約70倍的表達，總表達量可增加約700倍。8/25/2022高進勇8/25/2022高進勇色氨酸濃度低時1、tRNAtrp-色氨酸供給不足，核糖體遇到色氨酸密碼子時就停頓2、在4區轉錄未完成時，2區和3區就形成發夾結構3、3區和4區不能形成發夾結構（終止信號），導致轉錄通讀；RNA聚合酶繼續沿DNA移動，完成結構基因

36、的轉錄8/25/2022高進勇 當培養基中色氨酸濃度高時，核糖體可順利通過兩個相鄰的色氨酸密碼子，在4區被轉錄之前，核糖體就到達2區，這樣使2-3不能配對，3-4區可以自由配對形成莖-環式的終止子結構，使得只有約10的RNA聚合酶能繼續參與色氨酸操縱子結構基因的轉錄。8/25/2022高進勇色氨酸操縱子衰減作用機制8/25/2022高進勇色氨酸濃度高時1、tRNAtrp-色氨酸供給充足，核糖體迅速通過色氨酸密碼子到達2區2、3區和4區形成發夾結構（終止信號）3、衰減作用發生，轉錄終止，RNA聚合酶釋放，不能完成結構基因的轉錄8/25/2022高進勇 由此可見，弱化子對RNA聚合酶轉錄的終止依賴

37、于前導肽翻譯中核糖體所處的位置，而細胞中色氨酸存在與否，決定了mRNA 轉錄的弱化子結構，使弱化子中1、2、3、4區域呈現競爭性配對，從而產生弱化效應，這是色氨酸操縱子第二水平調控的機制。應該指出，色氨酸含量變化對阻遏過程和弱化過程的作用方向是相同的。前者主要控制操縱子基因表達的啟動，而后者主要決定轉錄和翻譯是否能繼續進行下去。8/25/2022高進勇弱化子作用8/25/2022高進勇8/25/2022高進勇8/25/2022高進勇為什么需要阻遏體系？ 當大量Trp 存在時，阻遏系統起作用。阻抑蛋白與之結合，阻止先導mRNA合成。為什么需要弱化系統？ 當trp濃度低時，阻抑蛋白從有活性變為無活

38、性，速度極慢，不能很快引發trp 合成。因此需要一個能快速作出反應的系統，以保持培養基中適當的Trp水平。8/25/2022高進勇 兩個調控系統，避免浪費提高效率； 阻遏系統 高水平trp時，不轉錄 低水平trp時，轉錄至前導序列 弱化系統 細調 原核生物細致的精細調控機制，增強原核生物對環境的適應性8/25/2022高進勇衰減作用和負控阻遏的關系1、負控阻遏系統和衰減作用同樣對色氨酸水平應答2、衰減作用使色氨酸操縱子結構基因的轉錄被 抑制了10倍（細調）；3、色氨酸阻遏蛋白的阻遏作用使轉錄被抑制了70倍（粗調）；4、色氨酸水平對色氨酸操縱子結構基因的表達施加了700倍的調節效果。8/25/2

39、022高進勇7.4 轉錄水平上的其他調控方式 轉錄過程涉及轉錄機器附著于DNA，識別啟動子序列，起始RNA的合成，延伸和終止。轉錄的任何一步都受到調控，其中某些步驟是主要的調控點，比如RNA轉錄的起始相對延伸和終止來說。自然選擇使得生物的調控策略達到最優化。轉錄過程的調節是生物基因表達調節最有效的方式。8/25/2022高進勇7.4.1 因子的調節作用 不同的 因子可以獨立地起作用。但是，為了保證細胞準確響應不同的環境信號變化， 因子之間常常交互作用構成網絡調控模式。使得原核基因的表達穩定而平衡。 因子本身的活性受到蛋白水解酶的調控，也能被同源的抗因了失活。這些抗因子能夠與特定的 因子結合，阻

40、止它們與RNA聚合酶的組裝。8/25/2022高進勇F的兩種存在形式8/25/2022高進勇7.4.2 轉錄調控因子的作用 能夠與基因的啟動子區相結合，對基因的轉錄起激活或抑制作用的DNA結合蛋白被稱為轉錄調控因子。大腸桿菌基因組中有300多個基因編碼這樣的蛋白質，它們大多數是序列特異性的DNA 結合蛋白，能夠與特定的啟動子結合。有些能夠調控大量基因的表達，而有些僅調控一兩個基因的表達。8/25/2022高進勇7.4.3 抗終止因子的調節作用 抗終止因子是能夠在特定位點阻止轉錄終止的一類蛋白質。當這些蛋白質存在時，RNA聚合酶能夠越過終止子，繼續轉錄DNA。這種基因表達調控機制主要見于噬菌體和

41、少數細菌中。在RNA聚合酶到達終止子之前與RNA聚合酶結合、因為在終止子上游存在抗終止作用的信號序列，只有與抗終止因子相結合的RNA聚合酶才能順利通過具有莖環結構的終止子，使轉錄繼續進行。8/25/2022高進勇抗終止子通讀作用(a)開始轉錄 (b)缺少抗終止因子 (c)存在抗終止因子8/25/2022高進勇 參與大腸桿菌抗終止作用的蛋白是NusA蛋白。轉錄起始不久，因子從RNA聚合酶上解離下來， NusA 蛋白就結合到了核心RNA聚合酶上。 NusA 的結合增加了RN A聚合酶在終止子發夾結構處暫停的過程，從而促進抗終止子作用的發生。8/25/2022高進勇NusA 和 因子不能同時結合到R

42、NA聚合酶上。只要RNA聚合酶結合在DNA上， NusA就不會從RNA聚合酶上解離，而因子可以取代游離RNA聚合酶上的NusA ，因此，在轉錄起始和終止的過程中RNA聚合酶分別受到因子和NusA的調控。8/25/2022高進勇7. 5 轉錄后調控7. 5. 1 翻譯起始的調控遺傳信息的翻譯起始于mRNA上的核糖體結合位點（RBS）-起始密子AUG上游的一段非翻譯區。在RBS中有SD序列，與核糖體16S rRNA的3端互補配對，促使核糖體與mRNA相結合。RBS的結合強度取決于SD序列的結構及與AUG之間的距離。SD與AUG之間相距一般以410核苷酸為佳，9核苷酸最佳。8/25/2022高進勇R

43、BS8/25/2022高進勇SD sequenceAUG10basesUAAGGAGGU:complementary with 16s rRNA58/25/2022高進勇翻譯一個順反子需要二級結構的改變，而這種二級結構的改變又依賴于前一個順反子的翻譯。mRNA上有多個核糖體存在時，第一個順反子的翻譯會破壞mRNA原有的二級結構，使核糖體能夠與下一個順反子的翻譯起始區域結合。7.5.2 mRNA的二級結構對翻譯起始的調控8/25/2022高進勇8/25/2022高進勇7.5.3 調節蛋白的調控作用 細菌中有些mRNA結合蛋白可激活靶基因的翻譯。大腸桿菌BipA蛋白就其有依賴于核糖體的ATP酶活性

44、，能夠激活轉錄調控蛋fis mRNA的翻譯，是fis蛋白質合成所必需的。8/25/2022高進勇 相反，mRNA特異性抑制蛋白則通過與核糖體競爭性結合mRNA分子來抑制翻譯的起始。大腸桿菌中核糖體蛋白就存在翻譯抑制現象。rRNA基因正常的轉錄和翻譯將產生核糖體蛋白，由于這些蛋白與rRNA分子的親和力較強，只要細胞有足夠的rRNA分子，核糖體蛋白就不會結合到自身mRNA分子上。當細胞中缺乏足夠的mRNA分子時，核糖體蛋白只能結合到自身mRNA分子上，導致該mRNA的RBS位點被封閉，蛋白質合成停止。8/25/2022高進勇核糖體蛋白對自身mRNA翻譯的抑制作用8/25/2022高進勇7.5.4

45、反義RNA的調節作用反義RNA是指與mRNA互補的RNA分子, 也包括與其它RNA互補的RNA分子。由于核糖體不能翻譯雙鏈的RNA，所以反義RNA與mRNA特異性的互補結合, 即抑制了該mRNA的翻譯。通過反義RNA控制mRNA的翻譯是原核生物基因表達調控的一種方式，最早是在E.coli 的產腸桿菌素的Col E1質粒中發現的,許多實驗證明在真核生物中也存在反義RNA。 8/25/2022高進勇 RNA調節是原核生物基因表達轉錄后調節的另一種重要機制。細菌響應環境壓力(氧化壓力、滲透壓、溫度等)的改變，會產生一些非編碼的小RNA分子，能與mRNA中的特定序列配對并改變所配對mRNA分子的構象，

46、導致翻澤過程被開啟或者關閉。也可能導致目標mRNA分子的快速降解。8/25/2022高進勇反義RNA調控的可能機制1、和靶核苷酸序列形成雙鏈區，直接阻礙其翻譯的起始。2、在靶分子的部分區域形成雙鏈區，易成為內切酶的底物，使與其結合的mRNA變得不穩定3、反義RNA也可與轉錄物結合并裝扮成一個終止子，使轉錄提前結束8/25/2022高進勇7.5.5 稀有密碼子對翻譯的影響實驗證據RNA引物由dnaG基因編碼的引物酶催化合成dnaG、rpoD及rpsU屬于大腸桿菌基因組上的同一個操縱子。基因轉錄出來的三個蛋白相應的mRNA拷貝數大體相同，由于翻譯的調控使得蛋白的拷貝數發生了很大的變化。8/25/2022高進勇8/25/2022高進勇由于細胞內對應于稀有密碼子的tRNA較少，高頻率使用這些密碼子的基因翻譯過程容易受阻，影響了蛋白質合成的總量。8/25/2022高進勇許多調控蛋白如LacI、AraC、TrpR等在細胞內含量很低，這些基因中密碼子的使用頻率與dnaG相似。科學家