1、貼壁培養細胞表面形貌的掃描電鏡觀察【實驗目的】了解掃描電鏡生物樣品制備的基本過程了解掃描電鏡的基本操作【實驗原理】掃描電鏡的電子學系統電子槍組成部分為聚光鏡和物鏡等。由電子槍發射的電子束經聚光鏡和物鏡的匯聚作用形成了極細的電子束照射樣品。在掃描線圈的作用下，入射電子束在樣品表面作柵狀掃描。由入射電子和樣品相互作用所產生的二次電子經樣品上方的光電倍增管檢測并輸出一電信號。該電信號由視頻放大器放大后輸入顯像管的柵極，用來調制其亮度。由于顯像管上某點的亮度由樣品上對應點所產生的二次電子信號調制，所以在顯像管上可以顯示樣品的表面形貌的圖像。二次電子像的分辨力近似等于入射電子束斑直徑，二次電子像景深大，

2、像的立體感強。二次電子像的反差由樣品的表面形貌所決定。樣品臨界點干燥的原理：臨界點干燥可以避免干燥過程中樣品表面形貌受到破壞。當液體和氣體二相體系的溫度和壓力增加時，氣體的密度逐漸增高，而液體的密度逐漸降低。待溫度和壓力增加至特定值時，氣體和液體二相的密度相等，兩相之間的界面消失，表面張力等于零，該體系處于臨界點。此后繼續增大壓力，體系中氣體不會轉變成液體從而可以達到干燥樣品的目的。【實驗儀器、材料、試劑及用品】一儀器：掃描電鏡(HITACHIS-4800)、臨界點干燥儀(HITACHIHCP-2)、離子濺射鍍膜儀(EIKOIB-3)二材料：貼壁培養細胞(HeLa細胞和CHO細胞)三試劑：2.

3、5%戊二醛溶液、磷酸緩沖液、乙酸異戊酯、乙醇、雙蒸水等四用品：培養皿、蓋玻片、鑷子、移液器、雙面膠帶、掃描電鏡樣品臺等【實驗步驟】1取材：用0.1M磷酸緩沖液洗凈(兩次)2固定：用2.5%戊二醛溶液室溫于通風廚固定1小時。固定完后用0.1M磷酸緩沖液和蒸餾水充分洗凈。脫水：洗凈后用30%,50%,70%,80%,90%,95%,100%,100%乙醇逐漸上升脫水。每級各10分鐘左右。干燥：進行自然干燥。噴鍍：將已干燥好的樣品用導電膠粘于金屬的樣臺上,再一起置于真空噴鍍儀真空罩中,進行噴鍍金鉑合金鍍層。掃描電鏡觀察。實驗結果】1.HeLa細胞與CHO細胞比較HeLa細胞表面具有豐富的微絨毛，形狀

4、近似球星CHO細胞表面具有微絨毛，有些呈橢圓形，有些長圓形。2.自然干燥和臨界點干燥細胞觀察比較下面為自然干燥后觀察的細胞，與上面的臨界點干燥后細胞比較后可以看出自然干燥的細胞結構嚴重破壞，很難觀察其真實結構；而臨界點干燥后觀察的細胞結構清楚。思考題】為什么選擇CO2作為臨界點干燥的工作介質？在自然干燥時，液體的蒸汽壓大于空氣的蒸汽壓，由于表面張力的作用，細胞受外界液體往下的拉力，易破壞細胞表面的形貌，所觀察到的二次電子圖像就不能真實地反映出樣品表面的形態信息。而在CO2的臨界條件（31C和7.4MPa）下，液體的蒸汽壓等于氣體的蒸汽壓,液體表面張力為0,細胞表面較好地保存其原始形態，所以選擇CO2作為臨界點干燥的工作介質。生物樣品在掃描電鏡觀察前，為什么要進行金屬噴鍍處理？掃描電鏡的原理是通過高能電子入射樣品原子激發產生二次電子，通過收集二次電子的信息成像