1、MafA基因治療糖尿病的研究進(jìn)展【摘要】糖尿病是一種嚴(yán)重危害人類(lèi)安康的疾玻1型糖尿病主要因胰島細(xì)胞破壞引起胰島素絕對(duì)缺乏，2型糖尿病患者晚期也以胰島素分泌嚴(yán)重缺乏為主，需要外源性胰島素治療。afA蛋白在胰腺中表達(dá)，是胰島素基因轉(zhuǎn)錄的有效活化劑。與Pdx-1和Beta2結(jié)合作用，afA基因發(fā)揮明顯的促胰島素生成作用。假如能利用afA基因誘導(dǎo)糖尿病患者體內(nèi)胰腺外細(xì)胞表達(dá)胰島素，替代病變的胰腺細(xì)胞，將極大的改善糖尿病患者的預(yù)后。【關(guān)鍵詞】基因，afA基因表達(dá)糖尿病糖尿病嚴(yán)重危害人類(lèi)安康，發(fā)病率呈逐年升高趨勢(shì)。1型和2型晚期糖尿病患者都存在內(nèi)源性胰島素缺乏，目前臨床上的治療不能滿足重建患者胰島細(xì)胞分泌

2、功能的需求。人們?cè)鴩L試移植胰島細(xì)胞來(lái)重建胰腺內(nèi)分泌功能，但移植排異、免疫抑制的副作用及手術(shù)并發(fā)癥等諸多因素制約了臨床的應(yīng)用和治療效果。胚胎干細(xì)胞和胰腺干細(xì)胞一度成為治療糖尿病的種子細(xì)胞，但又受到了取材不便和倫理學(xué)的限制。目前發(fā)現(xiàn)，afA基因在Pdx-1、NeurD等其他基因的結(jié)合作用下，可以誘導(dǎo)體外胰島素分泌，對(duì)糖尿病的治療有重大的意義1af蛋白的構(gòu)造和功能af蛋白屬于巨噬細(xì)胞激活因子arphage-ativatingfatr,af家族，由4個(gè)包含N末端的酸性轉(zhuǎn)錄激活區(qū)域aiditransriptinativatingdainTAD的大af蛋白afA/L-af，afB/KrEisler，-af

3、和NRL和3個(gè)包含bZIP的小af蛋白afF，afG和afK組成1-2。其中afA蛋白是胰島素基因轉(zhuǎn)錄的有效活化劑3。成年哺乳動(dòng)物體內(nèi)只有胰腺細(xì)胞表達(dá)胰島素，afA蛋白的正常表達(dá)維持胰腺構(gòu)造和功能。afA蛋白通過(guò)連接胰島基因啟動(dòng)區(qū)域的順式作用元件RIPE3b響應(yīng)由血清葡萄糖程度調(diào)節(jié)的胰島素轉(zhuǎn)錄4。afA蛋白缺乏的小鼠Pdx-1、Beta2及NeurD轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)降低，細(xì)胞與細(xì)胞的比例降低，影響胰島素分泌5。2afA基因在胰島素轉(zhuǎn)錄中的作用胰島素基因在胰腺細(xì)胞特異性表達(dá)，其轉(zhuǎn)錄受到循環(huán)中葡萄糖程度的調(diào)節(jié)。有資料報(bào)道未被鑒別出的細(xì)胞特異性核因子結(jié)合到稱為RIPE3b的保守的順式調(diào)控元件，對(duì)葡萄糖

4、調(diào)節(jié)的表達(dá)很重要5-6。RT-PR分析顯示afARNA只能在晶狀體和胰腺細(xì)胞被檢測(cè)到7。afA蛋白和afARNA受葡萄糖調(diào)節(jié)，與細(xì)胞核提取物中結(jié)合于RIPE3b元件的afA相一致。在瞬時(shí)熒光素酶分析顯示afA基因的表達(dá)增加了胰島素啟動(dòng)子活性，同時(shí)引發(fā)來(lái)自afA的顯性負(fù)相抑制7。因此，afA基因可能涉及細(xì)胞的功能和糖尿病的發(fā)病機(jī)制。用afA基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染胰島T6細(xì)胞，分析來(lái)自內(nèi)源性胰島素基因表達(dá)的研究發(fā)現(xiàn)，afA基因在T6細(xì)胞異位表達(dá)誘導(dǎo)了可檢測(cè)的低程度的胰島素2RNA，而其他可能的afA應(yīng)答基因如Pdx-1和胰島素1沒(méi)有被有效的活化1。此外，胰高血糖素的表達(dá)沒(méi)有受到afA基因的影響，說(shuō)明afA基

5、因不干預(yù)細(xì)胞濃縮的afB介導(dǎo)的激活作用。并且還發(fā)現(xiàn)afA基因缺乏小鼠的胰島素1和胰島素2轉(zhuǎn)錄均顯著減少4。Kajihara等8發(fā)現(xiàn)磷酸化與afA基因最大的激活活性有很大的關(guān)系，資料顯示磷酸化后afA基因的轉(zhuǎn)錄活性和/或在細(xì)胞外信號(hào)的穩(wěn)定性發(fā)生很大變化。Jeffrey等9提出了afA基因第三區(qū)的概念，認(rèn)為在大鼠、小鼠和人的afA基因第五側(cè)翼區(qū)已經(jīng)有6個(gè)領(lǐng)域的作用被確認(rèn)，然而只有位于小鼠afA基因核苷酸-8118和-7750之間的第三區(qū)有才能獨(dú)立表達(dá)胰腺選擇性細(xì)胞系的報(bào)告基因。在哺乳動(dòng)物中，第三區(qū)是最保守的區(qū)域。用于第三區(qū)的因子可以直接使afA基因轉(zhuǎn)錄至細(xì)胞。Jeffrey等9認(rèn)為，掌握第三區(qū)介導(dǎo)

6、的活化，有助于深入認(rèn)知那些特殊的或者是新的轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)節(jié)afA基因的轉(zhuǎn)錄和胰腺發(fā)育過(guò)程中的作用，從而理解胰島素缺乏和糖尿病的遺傳缺陷。3afA基因缺乏時(shí)胰島素分泌的調(diào)節(jié)和機(jī)制已有研究證實(shí)轉(zhuǎn)錄因子afA是胰島素分泌和胰島構(gòu)造維護(hù)的一個(gè)重要的調(diào)節(jié)因子10。胰島素的轉(zhuǎn)錄在afA基因缺乏小鼠中明顯減少，但在胰腺中卻顯示正常程度，主要是因?yàn)閍fA基因作為轉(zhuǎn)錄因子與胰島素基因的促進(jìn)因子相關(guān)聯(lián)，afA基因可以通過(guò)調(diào)節(jié)胰島素基因的轉(zhuǎn)錄來(lái)調(diào)節(jié)血清葡萄糖程度11-15。這些結(jié)果說(shuō)明，afA基因是體內(nèi)的胰島素轉(zhuǎn)錄重要的調(diào)節(jié)因子。與同種類(lèi)型正常胰腺相比，afA-/-的胰腺中胰島素程度并沒(méi)有明顯的減少，這種矛盾的觀點(diǎn)可

7、以用兩種假設(shè)來(lái)解釋。異常的葡萄糖刺激胰島素分泌glusestiulatedinsulinserEIn，GSIS系統(tǒng)是一種可能，因?yàn)閍fA基因缺乏小鼠的GSIS系統(tǒng)是受損的，使得胰島素的分泌減少，而受損的GSIS系統(tǒng)對(duì)afA-/-胰腺穩(wěn)定期的胰島素程度卻沒(méi)有明顯的影響。另外一種可能就是對(duì)胰島素合成調(diào)節(jié)的過(guò)轉(zhuǎn)錄。Lerux等16報(bào)道，即使胰島素2轉(zhuǎn)錄的量沒(méi)有變化，在胰島素1缺乏的小鼠體內(nèi)，胰島素2的量仍較正常小鼠增加，推測(cè)胰島素合成調(diào)節(jié)中存在過(guò)轉(zhuǎn)錄。afA基因缺乏對(duì)胚胎時(shí)期胰島的生長(zhǎng)沒(méi)有直接的影響，這與Pdx-1和Beta2突變導(dǎo)致的結(jié)果形成了鮮明的比照。Pdx-1和Beta2對(duì)于體外的胰島素基因

8、表達(dá)同樣重要，這些因子的缺乏會(huì)導(dǎo)致活體內(nèi)胰島發(fā)育的異常。Kataka等11報(bào)道afA基因在胰島細(xì)胞中的最初表達(dá)是在胚胎發(fā)育第13.5天。但是在這一時(shí)期并沒(méi)有檢測(cè)到Nkx6.1無(wú)效突變體，推測(cè)afA基因處于Nkx6.1的下游14。研究說(shuō)明，afA基因缺乏小鼠的胰島對(duì)葡萄糖、精氨酸和氯化鉀不能給予相應(yīng)的應(yīng)答。GSIS包括離子型和非離子型兩條刺激通路。離子型的葡萄糖刺激通路K+ATP通道關(guān)閉，膜去極化，電壓調(diào)控的L型a2+通道激活，a2+流入，細(xì)胞質(zhì)中a2+增多對(duì)細(xì)胞胰島素的分泌發(fā)揮了主要作用。非離子型葡萄糖刺激通路也有重要的生理學(xué)意義K+ATP通道依賴性葡萄糖活動(dòng)。細(xì)胞中AP蛋白激酶A途徑的激活可

9、以刺激胰島素的分泌，其發(fā)活力制是GLP-1增加了a2+的流入，從而促進(jìn)了末端胰島素的分泌17。精氨酸和氯化鉀在葡萄糖存在的情況下也可以促進(jìn)胰島素的分泌，兩者可以直接使細(xì)胞膜去極化，激活a2+通道，刺激胰島素分泌。afA基因缺乏小鼠和胰島異常對(duì)于葡萄糖、精氨酸和氯化鉀的無(wú)應(yīng)答，說(shuō)明離子型和非離子型通道都受到影響。Saaras等6研究證實(shí)，Pdx-1的表達(dá)受到細(xì)胞中的afA基因的調(diào)節(jié)，因此可以用Pdx-1的減量調(diào)節(jié)來(lái)解釋在afA基因缺乏小鼠中觀察到的異常的GSIS系統(tǒng)。4afA和Pdx-1或Beta2等轉(zhuǎn)錄因子產(chǎn)生協(xié)同激活作用內(nèi)源性胰島素轉(zhuǎn)錄的激活作用主要由分別結(jié)合到A3-201-196bp、1-

10、126-101bp和E1-100-91bp的Pdx-1、afA和Beta2來(lái)控制18。afA基因只在成人胰島的細(xì)胞中表達(dá)，而Pdx-1和Beta2不局限于細(xì)胞，還可存在于細(xì)胞的亞型。資料顯示，afA基因似乎是由1介導(dǎo)激活作用的主要調(diào)節(jié)劑；Pdx-1和Beta2因子控制由葡萄糖調(diào)節(jié)的胰島素基因的轉(zhuǎn)錄，同樣是細(xì)胞功能的主要調(diào)節(jié)劑19。afA基因單獨(dú)作用對(duì)胰島素的轉(zhuǎn)錄影響不大，但與Pdx-1、Beta2三者結(jié)合，那么能顯著促胰島素生成。胰島素基因的細(xì)胞的限制性表達(dá)是afA、Pdx-1和Beta2這3個(gè)轉(zhuǎn)錄因子協(xié)同作用的結(jié)果。afA基因和Pdx-1、Beta2之間直接的協(xié)同作用通過(guò)各自的順式作用因子和

11、或共同激活作用增強(qiáng)了跨因子之間的親和力，從而穩(wěn)定了DNA蛋白質(zhì)復(fù)合物20。然而三者之間活性的協(xié)同作用并不是很明了。Nishiura等21發(fā)現(xiàn)，afA基因缺乏小鼠會(huì)開(kāi)展成年齡依賴型糖尿玻這種小鼠出生時(shí)胰島形態(tài)構(gòu)造是正常的，隨著年齡增長(zhǎng)，其GSIS和胰島形態(tài)構(gòu)造逐漸異常。胰島素和葡萄糖轉(zhuǎn)錄子2GLUT2，一種細(xì)胞內(nèi)葡萄糖傳感系統(tǒng)的重要組成局部在afA基因缺乏小鼠的胰島中的表達(dá)降低。提示afA基因不僅影響胰島素的轉(zhuǎn)錄，對(duì)胰島中細(xì)胞的擴(kuò)散與存在也有關(guān)鍵作用22。轉(zhuǎn)貼于論文聯(lián)盟.ll.afA基因?qū)?xì)胞的作用可以通過(guò)在細(xì)胞和非細(xì)胞中的過(guò)表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)5,23。afA基因可以對(duì)涉及細(xì)胞功能如胰島素的合成和分泌和

12、葡萄糖代謝的其他基因包括激素原轉(zhuǎn)化酶、K離子通道的亞基Kir6.2和SUR1、胰高血糖素樣肽1受體、GLUT2、葡萄糖激酶和丙酮酸羧化酶進(jìn)展調(diào)節(jié)。afA基因同樣調(diào)節(jié)Pdx-1、Beta2和Nkx6.1等其他細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)。因此在維持細(xì)胞功能方面，afA是關(guān)鍵基因。有觀點(diǎn)認(rèn)為非細(xì)胞如肝臟細(xì)胞中的afA，Pdx-1和Beta2表達(dá)的同聲傳譯誘導(dǎo)內(nèi)源性胰島素基因和其他細(xì)胞特殊基因如葡萄糖激酶、K離子通道的亞基Kir6.2和SUR1一些研究說(shuō)明，afA、Pdx-1和Beta2可能成為治療糖尿病不錯(cuò)的潛在的靶基因5，24。5afA基因?qū)σ认偻饧?xì)胞表達(dá)胰島素的誘導(dǎo)afA基因的作用使人們對(duì)其能否誘導(dǎo)胰島

13、外細(xì)胞表達(dá)胰島素充滿興趣。Hideaki等25在鏈脲酶素誘導(dǎo)的糖尿病鼠模型中發(fā)現(xiàn)，腺病毒轉(zhuǎn)染的Pdx-1、Beta2/NeurD和afA可以誘導(dǎo)胰島素啟動(dòng)子的活性，并且在肝臟胰島素基因表達(dá)中發(fā)揮強(qiáng)的協(xié)同作用，但未觀察afA基因單獨(dú)作用的結(jié)果。Nura等26研究了afA基因單獨(dú)作用于體內(nèi)腸上皮細(xì)胞誘導(dǎo)胰島素表達(dá)的情況，結(jié)果顯示單獨(dú)表達(dá)afA基因可以使鼠腸細(xì)胞分化為胰腺生成細(xì)胞。他們還發(fā)現(xiàn)afA基因可以誘導(dǎo)包括GLP-1和GIP生成細(xì)胞等15種不同腸內(nèi)分泌細(xì)胞產(chǎn)生胰島素。腺病毒轉(zhuǎn)染的afA基因治療的糖尿病鼠體內(nèi)，10%腸內(nèi)分泌細(xì)胞產(chǎn)生的胰島素程度與空腸內(nèi)GLP-1或GIP生成細(xì)胞產(chǎn)生胰島素的程度相

14、當(dāng)。6結(jié)語(yǔ)在Pdx-1、NeurD等因子的結(jié)合作用下，afA基因?qū)w內(nèi)胰島素程度的調(diào)控發(fā)揮關(guān)鍵作用。糖尿病小鼠模型經(jīng)過(guò)腺病毒轉(zhuǎn)染afA基因，靶器官可以分泌胰島素，使血糖下降，為利用afA基因治療糖尿病提供了動(dòng)物實(shí)驗(yàn)根據(jù)。體內(nèi)的肝臟、肌肉、腦下垂體、造血干細(xì)胞和胃腸細(xì)胞都是胰島素生成細(xì)胞再生的靶器官，為基因治療提供了廣闊的空間。利用afA基因誘導(dǎo)胰島外細(xì)胞產(chǎn)生胰島素有可能成為治療各型糖尿病的新途徑。【參考文獻(xiàn)】1BenkhelifaS.PrvtS.Leq,etal.afA,anveleberftheafprt-ngenefaily,displaysdevelppentalregulatinand

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