1、Word - 6 -核酸適體技術(shù)在食品安全分析中的應(yīng)用 摘 要 核酸適體（Aptamer）是經(jīng)體外篩選技術(shù)（SELEX）篩選出的能特異結(jié)合蛋白質(zhì)或另外小分子物質(zhì)的寡聚核苷酸片段，對(duì)可結(jié)合的配體有嚴(yán)格的識(shí)別本事和高度的親和力。經(jīng)過(guò)十幾年的進(jìn)展，SELEX技術(shù)已經(jīng)成為一種重要的討論手段和工具，被廣泛應(yīng)用到分子生物學(xué)、基因組學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域。高通量篩選的技術(shù)特征與Aptamer精確識(shí)別、易體外合成與修飾等特性，使得Aptamer在分析化學(xué)與生物醫(yī)藥討論方面具有廣大的應(yīng)用前景。本文對(duì)提升篩選效率和效果為任務(wù)的核酸適體篩選技術(shù)新發(fā)展、核酸適體技術(shù)在食品平安分析中的應(yīng)用舉行了回顧，展望了核酸適體在食品平

2、安分析上的應(yīng)用前景。 關(guān)鍵詞 核酸適體； 指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化； 食品平安； 殘留分析;有機(jī)小分子，評(píng)述 2022-12-26收稿；2022-03-20接受 本文系廈門市科技方案項(xiàng)目（No.3502Z20222022）；福建省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（No.2022J0107）；國(guó)家質(zhì)檢總局科技方案項(xiàng)目（No.2022IK150）；國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)討論進(jìn)展方案（973）項(xiàng)目（No.2022CB732400）資助 * E-mail:Z;X 1 引 言 1953年，DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的提出，是現(xiàn)代分子生物學(xué)出生的里程碑1,2。自此對(duì)于核酸生物大分子的討論進(jìn)入了一個(gè)嶄新的時(shí)代。1990年，兩個(gè)自立的討論團(tuán)隊(duì)分離在

3、Nature3和Science4上發(fā)表有關(guān)體外篩選特定靶物質(zhì)結(jié)合性核酸的討論論文，并命名此種核酸為Aptamer，它由拉丁語(yǔ)aptus（意為“匹配”）和希臘語(yǔ)詞綴meros組成，中文譯為“適體”、“適配子“或“核酸適體”。核酸適體的篩選技術(shù)被稱為“配體指數(shù)富集系統(tǒng)進(jìn)化”（Systematic evolution of ligands by exponential eichment, SELEX）4，它是以組合化學(xué)技術(shù)、PCR技術(shù)以及基因克隆測(cè)序技術(shù)等為基礎(chǔ)的整合技術(shù)。隨著近年來(lái)現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的迅速進(jìn)展，SELEX技術(shù)也不斷創(chuàng)新，浮現(xiàn)了許多具有不同應(yīng)用目的的核酸適體篩選辦法5, 6。這些辦法

4、極大地增進(jìn)了核酸適體科學(xué)的迅速進(jìn)展。經(jīng)受了20年，核酸適體科學(xué)日漸成熟，在生物學(xué)和醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用已受到廣泛關(guān)注，如分子識(shí)別7,8、藥物篩選7,8、靶點(diǎn)鑒定8,9、基因表述調(diào)控9、醫(yī)學(xué)成像9、臨床診斷9,10及疾病治療10等。不僅如此，核酸適體作為一種靶物質(zhì)結(jié)合分子，在分析科學(xué)領(lǐng)域也呈現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛力，特殊是在小分子化物的分別分析中具有其獨(dú)特的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)。 食品平安問(wèn)題在21世紀(jì)已經(jīng)成為全世界關(guān)注的重大問(wèn)題，對(duì)消費(fèi)者的身體健康產(chǎn)生了重大的影響。因?yàn)槭称贩N類豐盛，食品中檢測(cè)的有毒有害物質(zhì)種類和組分繁多，需要檢測(cè)的物質(zhì)質(zhì)量極低，樣品中待檢物的濃度通常為 SymbolmA g和ng級(jí)，甚至pg 級(jí)。除此

5、之外，許多檢測(cè)物除需檢測(cè)物質(zhì)本身，還涉及其衍生物和降解物測(cè)定。因此食品檢測(cè)要求檢測(cè)辦法越發(fā)精確、迅速、便利。核酸適體具有靶分子廣、特異性強(qiáng)、敏捷度高、檢測(cè)成本低、平安牢靠等優(yōu)點(diǎn)，在食品平安檢測(cè)中有著良好的應(yīng)用前景。本文對(duì)SELEX技術(shù)原理、核酸適體篩選技術(shù)及在食品平安分析中的應(yīng)用發(fā)展舉行了綜述。 2 SELEX技術(shù)的基本原理 SELEX技術(shù)的總體思路是從利用組合化學(xué)原理設(shè)計(jì)合成的隨機(jī)寡核苷酸庫(kù)（約10151018 種核酸分子）中， 經(jīng)多輪篩選和指數(shù)富集， 終于得到任務(wù)核酸適體11。作為核酸適體的篩選技術(shù)，SELEX過(guò)程起始于組合化學(xué)合成的隨機(jī)寡核苷酸庫(kù)（RNA或DNA）。庫(kù)中核酸分子的結(jié)構(gòu)特征

6、是：兩端為固定序列，中間為隨機(jī)序列。隨機(jī)序列（區(qū)）給予每個(gè)核酸分子不同的空間結(jié)構(gòu)，打算著隨機(jī)寡核苷酸庫(kù)的庫(kù)容量及多樣性。理論上， 假如寡核苷酸中的隨機(jī)序列由n個(gè)堿基組成，庫(kù)容量則為4n。若再考慮人為塑造的修飾文庫(kù)，隨機(jī)序列的多樣性則更為豐盛6,12。SELEX技術(shù)是分子進(jìn)化工程技術(shù)的一種，技術(shù)流程包含了類似于達(dá)爾文進(jìn)化理論的3個(gè)過(guò)程：自發(fā)突變、自然挑選和大量增殖13。 SELEX篩選核酸適體的基本過(guò)程如圖1所示6。主要包括以下幾個(gè)步驟1416：（1）運(yùn)用分子生物學(xué)技術(shù)，人工設(shè)計(jì)并合成容量浩大的（10151018）單鏈隨機(jī)寡核苷酸（DNA或RNA）序列的文庫(kù)， 圖1 SELEX基本過(guò)程 Fig.

7、1 In vitro selection of target-specific aptamers using systematic evolution of ligants by exponential eichment （SELEX） technique 其中隨機(jī)寡核苷酸序列長(zhǎng)度普通在1560個(gè)堿基之間，隨機(jī)序列兩端固定在用于PCR擴(kuò)增及另外酶學(xué)反應(yīng)相關(guān)引物的結(jié)合位點(diǎn)。隨機(jī)文庫(kù)在特定緩沖體系下與靶分子溫育；（2）利用特定分別辦法如離心法、濾膜法、磁珠法、毛細(xì)管電泳法、柱層析等實(shí)現(xiàn)與靶分子結(jié)合的核酸序列和非結(jié)合的核酸序列間的分別；（3）對(duì)分別出的結(jié)合核酸序列舉行反篩選，進(jìn)一步排解掉非特異性結(jié)合

8、的核酸序列；（4）對(duì)得到的特異性結(jié)合的核酸序列舉行PCR擴(kuò)增，形成次一級(jí)核酸庫(kù)，通過(guò)生成的次一級(jí)核酸庫(kù)重復(fù)步驟（2）和（3），隨著每一輪篩選條件的不斷提升,與靶任務(wù)高度特異結(jié)合的DNA或RNA分子呈指數(shù)增長(zhǎng)。而親和力低的序列逐步被淘汰，直到得到核酸文庫(kù)對(duì)靶分子的解離常數(shù)達(dá)到任務(wù)值；（5）對(duì)所得到的核酸序列舉行克隆測(cè)序，鑒定測(cè)定序列與其靶分子結(jié)合的特異性和親和力。 第6期徐敦明等： 核酸適體技術(shù)在食品平安分析中的應(yīng)用 3 核酸適體篩選技術(shù) SELEX技術(shù)的特征是將分子的進(jìn)化過(guò)程轉(zhuǎn)移到體外舉行，但是在核酸適體的實(shí)際篩選中，SELEX往往受到篩選環(huán)境及技術(shù)本身限制，影響篩選效果和篩選效率。近年來(lái)，

9、討論人員在傳統(tǒng)SELEX基礎(chǔ)上，進(jìn)展出許多適合不同目的的新型SELEX技術(shù)。這些SELEX技術(shù)的浮現(xiàn)，極大地推進(jìn)了核酸適體技術(shù)在各學(xué)科領(lǐng)域中的應(yīng)用和進(jìn)展。 3.1 毛細(xì)管電泳SELEX（Capillary electrophoresis SELEX, CE-SELEX） SELEX技術(shù)中靶分子結(jié)合核酸與游離核酸的分別至關(guān)重要，是限制經(jīng)典SELEX 技術(shù)進(jìn)展的一個(gè)難點(diǎn)。Mendonsa和Bowser（2022）按照核酸適體與靶分子結(jié)合可以使其構(gòu)象和質(zhì)量轉(zhuǎn)變并導(dǎo)致其電泳行為顯著變化的特性，通過(guò)毛細(xì)管電泳勝利地將上述兩種不同狀態(tài)的核酸分子有效分別17。毛細(xì)管電泳技術(shù)（CE）的應(yīng)用對(duì)于提升SELEX的篩選效率具有重要的意義。由于毛細(xì)管電泳能迅速、高效地從未結(jié)合的DNA文庫(kù)中分別出靶分子-核酸適體復(fù)合物，因此通過(guò)CE-SELEX 辦法僅需24輪篩選就可得到靶分子的特異核酸適體。Drabovich 等（2022）按照ECEEM（Equilibrium capillary electrophoresis of equilibrium mixtures）的特點(diǎn)，通過(guò)不同親和力核酸適體的遷移率差異，收集不同時(shí)相的平衡混合物，僅3輪篩選就得到識(shí)別MutS 蛋白的核酸適體18