1、染色質免疫沉淀Chromatinimmunoprecipitation基因型決定表型破壞了基因型也就改變了表型diploidcontrol亠盧KZMil、.gmd但是，也有一些無法解釋的現象在相應的基因堿基序列沒有發生變化的情況下，一些生物體的表型卻發生了改變。什么是表觀遺傳學?Iokecpiourchromosomes*g*zxl3FD*JA占wrappedpmiemaUlHucofm.LtiClMTtCii$THCSTUOrOrThmOLECULISTHATOnTROLTHECODE.Theydeterminewhen.v/HfkE.am&howmiruorouronai$used.fwn

2、tlxMesuvecMgpackck)Mt5ojhcr.themoiediucharrodgwHubDHA.TmnumWhe*ijfnaltfrein.gco*letthehHio*CTifHVMfFXtfectMcmrei4theDhU映PlfK7puriWlDMAUlingPCRorp0mryo1IntwrfinucMHKnkt4WEwrwooingOHA.irriQ3W-W如irigmcth.加rrnjpping&lhproim-mAinMrjieikm.CmanlMhpmfinawrthDKft.DyKtlngf&UfCAIH他!mkHWjg實驗目的學習掌握染色質免疫沉淀技術的基本原理

3、與關鍵的操作步驟。2.實驗原理使DNA與其結合蛋白交聯超聲波處理，使染色質斷裂為小片段解交聯得到基因片段使用特定抗體，免疫沉淀得到靶片段PCR、測序或基因芯片分析所的基因片段的屬性實驗流程一、交聯及染色質DNA剪切條件的優化1.準備一瓶接近長滿的HeLa細胞，向培養液中加入37%的甲醛至終濃度為1%,輕輕搖勻，在37C孵育10分鐘。甲醛的作用細胞的用量交聯條件對實驗結果的影響棄培養液，用預冷至4C帶蛋白酶抑制劑PMSF的1XPBS洗細胞兩次，刮細胞到一個2ml離心管，2000rpm,4C離心4min收集細胞。甲醛的作用在各種交聯試劑中，甲醛（HCHO）的應用最為廣泛。甲醛的濃度、作用時間及交聯

4、的溫度等均可能影響交聯的程度。甲醛可以通過賴氨酸、精氨酸和組氨酸以及那些DNA的氨基和亞氨基基團之間的交聯，高效地在體內交聯蛋白質-DNA、蛋白質-RNA以及蛋白質-蛋白質，形成生物復合體，防止細胞內組分的重新分布。除此之外，HCHO可以忠實地保留染色質結構，而且在溫和條件下交聯很容易逆轉。通常交聯所用的甲醛終濃度為1%,在12-37C作用30mino但是如果反應溫度超過30C,本底就可能增加。因此，當必須在高溫進行交聯時，則應減少作用時間或甲醛濃度。過度交聯將影響細胞的裂解，并且在超聲處理時不能獲得理想長度的DNA片段及影響DNA的溶解。對于特別容易進行交聯的目的蛋白質（例如，組蛋白）需減少

5、交聯時間或甲醛濃度。甲醛的交聯反應可被加入的甘氨酸終止。細胞的用量通常2.5X10*細胞足夠進行4次免疫沉淀。因此，一般為了保證用量,采取培養多瓶細胞，胰酶消化，收集在50ml離心管中，培養液重懸，計數。（一般分裝1x107細胞于個EP管，用于免疫沉淀反應）。交聯條件對實驗結果的影響對于不同的細胞類型，甲醛的濃度、交聯的長度或者交聯的溫度都需要調整。如果交聯不充分，會導致不完全固定，則DNA片段的平均長度會小于500bp。交聯過度時細胞染色質難以用超聲波破碎，就算延長超聲波作用時間也會導致重要原料的丟失。交聯時間如果過短，則交聯不完全，產生假陰性，交聯時間通常為5分鐘到1個小時，具體時間根據實

6、驗而定。3.用500卩1預熱至室溫帶有蛋白酶抑制劑的SDS裂解液重懸并裂解細能71冰浴10分鐘;4超聲波處理剪切染色質DNA,使其形成300-1000bp即大約相當于25個核小體長度的片段;超聲條件對實驗的影響及超聲注意事項設置超聲破碎的條件酶消化與超聲消化相比較的區別超聲條件對實驗的影響及超聲注意事項超聲波是使用機械力斷裂染色質，容易引起升溫或產生泡沫，這都會引起蛋白質變性，進而影響Chip的效率。所以在超聲波斷裂染色質時，要在冰上進行，且要設計時斷時續的超聲程序，保證低溫。另外，超聲探頭要盡量深入管中，但不接觸管底或側壁，以免產生泡沫。總超聲時間也不要太長，以免蛋白降解。設置超聲破碎的條件

7、超聲處理的條件通常可以設置為10秒每次，共3-4次，功率為50W時設置為最大功率的30%,采用2mm超聲頭。不同的超聲處理儀器的設置不太一樣，摸索超聲條件時，可以先固定其他條件，先確定每次超聲多長時間不會導致明顯發熱，然后摸索不同的超聲次數。直至找到比較合適的超聲次數可以使大部分基因組DNA斷裂成200JOOObp大小。需要注意的是每次的超聲體積和細胞用量宜固定，否則就不能使用一個相對比較固定的超聲條件用于后續實驗。酶消化與超聲消化相比較的區別MicrococcalNuclease可以將染色質切成一到幾個核小體，比超聲波處理的結果更精致，更均一。另外，酶反應的條件比較溫和，對DNA和DNA蛋白

8、復合物的損傷較小，而且蛋白不易變性。酶處理染色質適用于新鮮的細胞或組織樣品和冰凍樣品。在研究組蛋白時，經常采用沒經過甲醛固定的NativeChIP(N-ChIP)的研究方法。因為N-ChIP沒經過甲醛固定，超聲波處理會打斷組蛋白和DNA的結合，所以只能選擇酶處理染色質的方法。對于甲醛固定的樣品，一般選擇超聲波處理方法。也有研究人員使用酶處理的方法研究甲醛固定較溫和的樣品。MiUipore公司有商品化的MicrococcalNuclease處理的ChIP試劑盒(EZ-Enzyme)提供。一用Enzyme和sonication處理結果比較EnzymeU2OSTD超聲處理的條件需要優化，各實驗組可采

9、用不同的超聲波處理條件，比較剪切效果。按以下步驟操作比較各種條件下的剪切效果：實驗組12345678超聲次數3691136911超聲功率15W15W15W15W25W25W25W25Wa.將超聲處理過的樣品離心收集上清（4C13000rpm離心10分鐘），加入lOjil0.5MEDTA、20jilIMTris-HClpH65、2gl20mg/ml蛋白酶K,45C孵育05l小時；.2%瓊脂糖b.酚/氯仿抽提一次，乙醇沉淀并重溶于20pl的ddH2O凝膠電泳檢查。酚/氯仿抽提步驟按照1:1體積比加酚/氯仿充分混勻后離心，取上層水相1!至新管，加入1/10體積3MNacl,2倍體積無水乙醇，大轉數離

10、心5min0二、免疫沉淀染色質DNA片段5.將超聲處理過的樣品在4C13000rpm離心10分鐘收集上清，10倍稀釋，將其移入一新的2mlEP管中；6.按照每2ml稀釋后液體加入75卩1的比例加入蛋白A瓊脂糖/鮭精DNA（50%混懸液），4C搖動30分鐘，預處理，短暫離心（700-1000rpm4C,小于1分鐘），收集上清液;Beads的選擇Input的設置7.向2ml上清液中加入適量的抗乙酰化組蛋白H3的抗體（20|il）,4C搖）抗體的選擇動過夜，陰性對照組不加抗體同樣搖動過夜;對照的設置Beads的選擇利用目的蛋白質的特異抗體通過抗原抗體反應形成DNA蛋白質-抗體復合物，然后使用Agar

11、osebeads或Magnabeads沉淀此復合物，特異性地富集與目的蛋白結合的DNA片段。再經過多次洗滌，除去非特異結合的染色質后,用SDS+NaHCOs洗脫免疫沉淀復合物。Magnabeads是近年來出現的一種新型beads,它使用方便，不像Agarosebeads那樣容易破裂，所以在操作過程中更簡單，而且免去了離心的步驟，節省不少時間。Millipore公司最新推出的MagnaChIP試劑盒就是采用這種Magnabeads免疫共沉淀和染色質免疫沉淀input設置在進行免疫沉淀步驟前的樣品ImmunopedpibtetargetprotelnAJNAcomptexesT(anscn|ii(

12、nFxtorslysecellsIsolatechiomatlnuoonjnatedaitbodySenKate：shear(hromatln染色質免疫沉淀抗體的選擇CHIPValidatedHisiuftebSpecificTranscriptionFactorGeneralTMnscriptioftFactorsRNApdllActiveGeneCrres-linkbtecomplex對照的設置IIIChip實驗至少應設立3種對照：未經免疫沉淀的超聲處理樣本（input）；陽性對照。一般用組蛋白抗體或anti-RNAPolymeraseII抗體這些比較保守的在所有細胞中都能結合基因的蛋白的

13、抗體；陰性對照。即用一種無關抗體（或相應動物的免疫前血清），與抗目的蛋白質抗體同時分別與交聯染色質樣本進行免疫沉淀反應；選擇不與目的蛋白質結合的基因組區域作對照，即“基因組對照”。另外，還應根據對ChIP的不同的特殊應用設立不同的實驗對照。例如，試圖檢測目的蛋白質是否與某一推測的結合位點結合，則必須將此位點突變后作為對照；又如，欲測定突變細胞株中目的蛋白質與基因組DNA結合情況時，必須用野生型細胞株作對照等。8加60jil蛋白A瓊脂糖/鮭精DNA（50%混懸液），4C搖1小時;9.短暫離心（700-1000rpm,4C,小于1分鐘）收集沉淀，分別用低鹽免疫復合物洗液、高鹽免疫復合物洗液、LiC

14、l免疫復合物洗液洗滌沉淀各一次，每種液體每次用lml,搖動35分鐘后短暫離心收集沉淀。然后用同樣的方法用TE緩沖液洗滌沉淀兩次三、PCR鑒定結合于乙酰化組蛋白H3的DNA片段10.向上步所得沉淀中加入250卩1洗脫液（1%SDS,0.1MNaHCO3）,農蕩，室溫孵育15分鐘，離心收集上清；11加入10gl0.5MEDTAv20glIMTris-HClpH6.5v和2pl20mg/ml蛋白酶K,45C孵育0.5l小時;12酚/氯仿抽提一次，乙醇沉淀并重溶于20卩1的ddH2O中，取沖1作模板，按以下配方加樣，PCR擴增實驗組和對照組以及Input組的GAPDH啟動子序列，擴增條件95C1分鐘，95C30秒、55C30秒、72C30秒、30個循環，72C5分鐘，1.5%瓊脂糖電泳檢查結果。此步DNA純化可以選擇適當的DNA純化試劑盒PCR的策略PCR的策略引物的選擇取決于實驗目的。如若鑒定目的蛋白質特異結合的位點,除了必須設計一對能使擴增片段跨過該位點的引物外，至少還應設計一對擴增的DNA序列中沒有目的蛋白質結合位點的對照引物。對于平均長度為500bp的DNA分子，它的大部分片段長度是500-1000bp,以至遠離真正的結合位點lOOObp處的DNA序列很可能被抗體共沉淀下來。所以，對照引物擴增的DNA區域與實驗引物擴增的DNA區域