1、病毒與細胞的相互作用文檔ppt現在一頁，總共五十二頁。目的要求： 1、掌握病毒的細胞培養的特點和 方法 以及病毒與細胞的相互作用機制。 2、了解病毒持續性感染的機制和干擾素的產生和作用機理 。 重點：病毒的細胞培養的特點、方法和病毒與細胞的相互作用機理 難點：病毒與細胞的相互作用機理和病毒持續性感染的機制和干擾素的產生和作用機理 現在二頁，總共五十二頁。第一節 病毒的細胞培養病毒是嚴格的細胞內寄生微生物，培養病毒必須使用細胞。根據病毒的不同選用敏感動物（動物接種）、雞胚（雞胚接種）或離體細胞進行分離培養（細胞培養）。現在三頁，總共五十二頁。一、動物接種接種后通常以動物發病、死亡作為感染的指標。

2、按病毒侵襲部位不同選擇適當的接種途徑。嗜神經病毒接種在小鼠的腦內。痘苗病毒和單純皰疹病毒接種于家兔角膜。現在四頁，總共五十二頁。動物接種的優缺點：優點：不需要復雜的儀器設備； 技術簡單； 易成功缺點：個體差異大 價格昂貴 數量有限 需要隔離畜舍現在五頁，總共五十二頁。二、雞胚接種一種比較經濟簡便的方法。現在六頁，總共五十二頁。現在七頁，總共五十二頁。雞胚接種的優缺點：優點：技術簡單、來源充沛、價格低廉、數量可大，不需特殊設備缺點：很多病毒不能適應，主要是哺乳動物的病毒。現在八頁，總共五十二頁。三、細胞培養細胞培養(cell culture)是指利用機械、酶或化學方法使動物組織或傳代細胞分散成單

3、個乃至24個細胞團懸液進行培養。 現在九頁，總共五十二頁。(一)細胞培養的優點：每個細胞生理特性基本一致，對病毒易感性相等無個體差異，準確性和重復性好嚴格執行無菌操作細胞培養本身就能顯示病毒的生長特征應用空斑技術可進行病毒的克隆化現在十頁，總共五十二頁。（二）細胞的類型根據細胞來源、染色體特征及傳代次數，可分為三種類型：1.原代細胞(primary cell)：動物組織經胰蛋白酶消化處理，使細胞分散而獲得的單個細胞，再生長于培養器皿中。大多數組織均可制備原代細胞，但生長的快慢及難易程度不一。現在十一頁，總共五十二頁。（二）細胞的類型2.二倍體細胞(diploid cell strain)：將長

4、成單層的原代細胞消化分散成單個細胞，繼續培養傳代，其染色體數與原代細胞一樣，保持其二倍染色體數目的細胞，稱為二倍體細胞。但巨噬細胞、神經細胞等體外培養時一般不分裂，很難獲得二倍體細胞株。現在十二頁，總共五十二頁。（二）細胞的類型3.傳代細胞系(diploid cell line)：能在體外持續增殖傳代的細胞，大多數由癌細胞或二倍體細胞突變而成，染色體數目不正常，為異倍體。優點：傳代及培養方便缺點：對有的分離野毒（樣本中的病毒）不敏感由于擔心致腫瘤的潛在危險，傳代細胞一般不能用于制備疫苗。常用傳代細胞系：HeLe(人子宮癌細胞)，Vero(非洲綠猴腎細胞)，BHK21(乳倉鼠腎細胞)，PK15(

5、豬腎細胞)等現在十三頁，總共五十二頁。（三）細胞培養的方法常用的有靜置培養和旋轉培養兩種1.靜置培養(stationary culture)：實驗室常用。將消化分散的細胞懸液裝瓶，5%CO2溫箱靜置培養，數天后細胞沉降并貼附在玻面上生長分裂，最后長成單層。哺乳動物和禽類的細胞培養溫度一般為37。現在十四頁，總共五十二頁。（三）細胞培養的方法2.旋轉培養(roller culture)：大規模生產疫苗。細胞在玻瓶內生長時，玻瓶不斷緩慢旋轉，細胞貼附于玻瓶四周，長成單層。基本方法與靜置培養基本相同，不同之處是培養的細胞不斷緩慢旋轉（5-10r/h）。現在十五頁，總共五十二頁。（三）細胞培養的方法另

6、外為滿足某些特定需要可采取懸浮培養和微載體培養兩種1.懸浮培養(suspension culture)：攪拌使細胞處于懸浮狀態，并不斷補充營養和矯正PH值，使之生長或存活，適用于不需要貼壁生長的細胞系。如NS-1（一種骨髓瘤細胞系）1.微載體培養(microcarrier culture)：在懸浮培養的基礎上，結合微載體的培養技術，微載體直徑在100-200m的微粒，對細胞無毒，細胞附著其上生長成單層，由于單位體積表面積大，所獲得的細胞數多。對規模化細胞生產和疫苗生產有較大吸引力。現在十六頁，總共五十二頁。第二節 病毒與細胞的相互作用殺細胞感染非殺細胞感染 引致持續感染，對細胞代謝無影響。產生

7、干擾素 現在十七頁，總共五十二頁。病毒的種類千差萬別，宿主的細胞的種類也多達200多種，病毒與宿主細胞之間的作用的表現形式各異。一、病毒與細胞相互作用的類型 病毒感染可分為殺細胞及非殺細胞兩大類。并非所有的病毒感染都能產生和釋放子代病毒顆粒。宿主細胞感染病毒發生的變化可能是細胞死亡或細胞轉化，也可能是病毒非生產性感染，或稱頓挫感染。現在十八頁，總共五十二頁。某些種類的細胞是允許性的，可讓病毒完成復制過程；而另一些則阻斷了病毒的復制過程的某個環節，此類細胞稱為非允許性的。病毒感染允許性及非允許性細胞均可產生細胞的病理變化。現在十九頁，總共五十二頁。最重要的非生產性的病毒與細胞的相互作用是持續感染

8、。持續感染（persistent infection）：是指持續長時間的感染。在感染過程中不形成感染性的病毒顆粒，可能是病毒的基因組被整合到宿主細胞DNA內，或以附加體形式存在。潛伏感染的細胞在某些情況下并不釋放病毒顆粒，在被激活的情況下則可變為生產性的。現在二十頁，總共五十二頁。 二、病毒引致的殺細胞變化(一)細胞病變(cytopathic effect,CPE)由病毒感染導致的細胞損傷。CPE能在光學顯微鏡下觀察。現在二十一頁，總共五十二頁。50%組織細胞感染量（TCID50）能夠使半數組織細胞在一定條件下發生細胞病變的病毒量。用于判定病毒的毒力。現在二十二頁，總共五十二頁。細胞病變的表現

9、因病毒與細胞的種類而異，有多種形式細胞圓縮：如痘病毒和呼腸孤病毒等；細胞聚合：如腺病毒； 形成合胞體：細胞融合形成，如副粘病毒和皰疹病毒； 細胞腫大：包涵體：有些病毒可能形成。現在二十三頁，總共五十二頁。CPE細胞腫大細胞圓縮 形成合胞體現在二十四頁，總共五十二頁。正常細胞CPECPE觀察現在二十五頁，總共五十二頁。CPE觀察正常單層A72細胞接種犬冠狀病毒（CCV）后形成合胞體的的單層A72細胞現在二十六頁，總共五十二頁。細胞折光性，變圓，局部全層，死亡脫落，如：腸道病毒。現在二十七頁，總共五十二頁。細胞聚集成叢，似葡萄串狀，細胞間常有細絲狀間橋連接，細胞變圓或膨大，如：腺病毒。現在二十八頁

10、，總共五十二頁。細胞融合形成多核的巨細胞，稱為“合胞體”，如副粘、牛白血病病毒等。 現在二十九頁，總共五十二頁。胞漿內有空泡形成，如：猴病毒SV40、呼腸孤病毒等。 現在三十頁，總共五十二頁。(1)病毒對宿主細胞膜的影響一些具有有融合活性的表面蛋白的有囊膜病毒能夠啟動細胞之間的融合，形成多核細胞如合胞體病毒。現在三十一頁，總共五十二頁。合胞體（syncytia）：是病毒感染后導致感染細胞及相鄰細胞細胞膜融合的產物，表現為若干細胞的相鄰細胞膜消失，成為多核巨細胞。 現在三十二頁，總共五十二頁。(2)病毒對細胞骨架的影響許多病毒的感染會導致細胞骨架纖維系統（細胞骨架由維絲、中介絲及維管組成）的瓦解

11、 。由于細胞骨架在維持細胞形態中起一定作用，所以病毒引起細胞骨架的改變是受染細胞結構變化的原因之一。 現在三十三頁，總共五十二頁。 病毒引致的細胞凋亡和壞死細胞的死亡則是因病毒感染引起了細胞的生理性死亡所致，亦即程序性死亡，或稱為凋亡(apoptosis)。凋亡與壞死的細胞有不同的形態變化，凋亡細胞的染色質濃縮、邊緣化。內源性核酸內切酶被激活，將細胞DNA降解成180-200dp的片段，可在瓊脂糖凝膠電泳時出現特征性的電泳帶，稱之為“梯帶”。壞死的細胞沒有內切酶激活所致的變化。凋亡是宿主細胞的重要防御機制，細胞壞死總是在病毒復制完成之后發生。現在三十四頁，總共五十二頁。 病毒引起的細胞調亡現在

12、三十五頁，總共五十二頁。空斑試驗將適當濃度的病毒懸液加入單層細胞培養中，當病毒吸附細胞后，再覆蓋一層融化的瓊脂。病毒在細胞內復制后產生局限性病灶，病灶逐漸擴大，肉眼也能看見，此即空斑試驗。現在三十六頁，總共五十二頁。現在三十七頁，總共五十二頁。CELLS空斑是由一個感染性病毒粒子復制形成的，類似于細菌的菌落，稱為空斑形成單位(Plaque-forming unit，PFU)。病毒懸液中的感染性病毒量以每毫升含有的PFU來表示。現在三十八頁，總共五十二頁。現在三十九頁，總共五十二頁。現在四十頁，總共五十二頁。空斑試驗的用途：1. 測定病毒數量2. 純化病毒 單個空斑作懸液，梯度稀釋后再作空斑，可

13、獲得病毒克隆。3. 鑒定病毒 不同病毒的空斑具有不同的特征。現在四十一頁，總共五十二頁。三、包涵體(inclusion body)定義：是某些病毒感染細胞產生的特征性的形態變化，在普通光學顯微鏡下可見胞漿或胞核內出現的呈嗜酸性或嗜堿性染色、大小數量不等的圓形或不規則形的團塊狀結構，稱為包涵體。現在四十二頁，總共五十二頁。包涵體的性質病毒成分的蓄積，如狂犬病毒的Negri氏體大量晶格樣排列的病毒顆粒組成，如腺病毒的包涵體細胞變性的產物，不含病毒，如皰疹病毒的包涵體現在四十三頁，總共五十二頁。意義診斷（涂片或組織切片）某些病毒的診斷依據發現包涵體即可確診狂犬病，小腦或大腦海馬角有內基氏小體（圓形或

14、卵圓形的嗜酸性小體）C漿內；喉氣管炎C核內。副流感病毒型，C漿內、核內都有。現在四十四頁，總共五十二頁。現在四十五頁，總共五十二頁。現在四十六頁，總共五十二頁。狂犬病毒包涵體（Negri body）現在四十七頁，總共五十二頁。能產生包涵體的重要的畜禽病毒現在四十八頁，總共五十二頁。四、病毒引致的非殺細胞變化非殺細胞病毒的感染通常引致持續感染，對細胞的新陳代謝并無大礙，但同時還會產生并釋放子代病毒顆粒。持續感染的細胞大多能繼續生長并分裂。大多持續感染的細胞發生慢性漸進性變化，最終死亡。現在四十九頁，總共五十二頁。五、細胞抗病毒的RNA干擾RNA干擾(RNA interference，RNAi)是指細胞利用內源或外源的小分子雙股RNA片段，特異性地降解同源基因的mRNA，從而導致靶基因轉錄后的基因沉默 (post tra