1、乳鐵蛋白及其生物學功能浙江大學飼料科學研究所 齊莉莉 許梓榮1乳鐵蛋白的來源與分布 乳鐵蛋白（lactoferrin，簡稱LF）是一種鐵結合性糖蛋白，1960年首先由Groves從牛乳中分離獲得。各種哺乳動物都能產生LF，但其濃度因物種而異。人乳中含量特別豐富，初乳中高達7 gL，常乳中為l g/L。在缺鐵母體中 LF濃度正常，而在蛋白質營養不良的母體中，LF濃度降低。牛乳中 LF含量要比人少得多，初乳中為 1 gL，隨著泌乳的進行，濃度迅速下降。山羊、馬、豬、小鼠和天竺鼠乳中LF的濃度也很低，如豬的變化范圍是12 gL（初乳）03 gL（常乳）。 LF是一種分泌性蛋白質，它不僅合成于乳腺，在

2、浸潤粘膜表面的多數主要分泌液中都可檢測到這種蛋白，如唾液、淚液、精液、氣管和鼻腔分泌物以及胰液等。LF在豬腸道中的表達部位主要在上段，從十二指腸、空腸到回腸其分泌逐漸降低。血液中的LF來自成熟的中性粒細胞的次級顆粒，一般濃度較低（約20 nmolL），這是因為肝臟能快速清除循環系統中的LF，例如人體每天要清除掉 1525 mg LF。2 乳鐵蛋白的分子結構 人和牛LF的一級結構已經確定，是一條多肽鏈，分子量為 7080 kDa，二者氨基酸順序同源性高達69。它們的Th級結構以螺旋和結構為主（7 以上），二者沿蛋白質的氨基酸順序交替排列，而且螺旋大大多于結構。LF上結合有兩條糖鏈，含量為7左右，

3、其組成包括有半乳糖、甘露糖、N一乙酰半乳糖胺、巖藻糖以及唾液酸等。 LF的立體結構是在二級結構的基礎上折疊成兩個基本相等的葉（N一葉和C一葉），每個葉再進一步形成兩個結構域和一條裂隙。裂隙是鐵結合部位，所以每個LF分子可結合兩分子 Fe3+和兩分子CO32-（也有文獻報道為HCO3-）。在每個鐵結合部位中，由4個氨基酸殘基（兩個酪氨酸、一個天冬氨酸和一個組氨酸）組成配位體螫合一分子Fe3+，這樣的裂隙結構使LF可以非常牢固地結合鐵，其結合常數高達 1020M。 CO32-連接精氨酸和Fe3+，估計有穩定鐵結合的作用。此外，X射線分析發現，Fe3+結合到 LF后引起后者的構象發生變化，即鐵進入敞

4、開的裂隙內部后，兩結構域相應閉合，使LF的分子結構更加緊密。LF的這種構象變化，解釋了鐵飽和的LF（FeLF）比脫鐵LF（ApoLF）更不易于變性和水解的原因。3 乳鐵蛋白的主要生物學功能 近十幾年來，人們對LF的生物學功能進行了廣泛的研究，LF可以與許多物質以弱鍵和可逆的方式結合，包括金屬離子、蛋白質、細胞以及DNA。LF的這種廣泛的結合能力可能是其多樣化生物學功能的基礎。3l 促進鐵吸收 LF可提高腸細胞對鐵的生物可利用性，其依據之一就是人乳中鐵的生物利用率要遠遠高于牛乳或是嬰兒配方食品中鐵的生物利用率。給貧血的小鼠飼喂FeLF或FeSO4，要達到同樣的治療效果，后者的攝入量需是前者的4倍

5、（分別為 50g和200 g鐵）（Kawakami，1988）。姜冬梅等（1999）的試驗也得出類似結果，進一步證明FeLF中的鐵比FeSO4更易吸收。 轉鐵蛋白和LF是體內運送鐵的主要蛋白質。前者主要在血液中將鐵運送到合成各種含鐵蛋白質的地方，而LF主要在腸道中運送鐵，因此對于哺乳動物從腸道中吸收鐵起重要作用。LF與鐵的親和力是轉鐵蛋白的250300倍，而且能在較廣的范圍內、pH僅22的情況下，不受損地載鐵通過胃。當LF到達腸道后，即和細胞表面的LF受體（LFR）起反應，然后LFR進入細胞內部，釋放出Fe3+。細胞對鐵的吸收有負反饋調節機制，當胞內缺鐵時細胞表面的LFR增多，增加LF與其受體

6、的結合（Mikogami，1995）。如果在攝入鐵時結合使用LF不僅可以降低有效鐵的使用量，而且LF螫合鐵以后避免了游離鐵對腸道的直接刺激作用。32 抗菌作用 在LF的諸多生物學功能當中，其抗菌活性最引人注目，該活性有兩種機制：321 抑菌作用 除乳酸桿菌外幾乎所有的細菌都需要鐵來維持生長，ApoLF通過與需鐵細菌爭奪可利用鐵而起到抑菌作用。母乳喂養的嬰兒和哺乳仔畜腸道中需鐵細菌減少，使乳酸桿菌能在其中集群，進而引起腸道pH下降，由此阻止了大腸桿菌的生長，減少傳染性胃腸炎的發生率。LF的抑菌效果受多種因素影響。LF的鐵含量對抑菌作用起決定作用，當LF被鐵飽和后，其抑菌特性就會消失；碳酸鹽可明顯

7、增強LF的抑菌能力，而檸檬酸鹽會減弱其抑菌效果；LF的抑菌效果與pH密切相關，pH74時效果明顯優于pH 68，pH 6時基本無抑菌作用； LF對溶菌酶的活性有協同作用，溶菌酶首先對細菌胞壁進行溶解，LF使胞壁溶解完全或不完全的細菌粘連在一起而產生協同抑菌作用；與LF結合的抗體（如SIgA）亦可促進LF的抑菌作用。322 滅菌作用 LF還可直接與細菌細胞壁結合造成胞壁損傷，該作用可能和其與鈣、鎂的結合有關，或者是LF導致釋放G-菌外層膜中的脂多糖而改變了滲透性的結果（Ellison等，1990）。LF滅菌作用的基礎可能是該蛋白與微生物細胞的結合功能。研究發現，某些細菌可以表達具有LFR作用的外

8、膜蛋白質，使LF結合在細菌的胞膜上。LF的滅菌區不同于鐵結合區，現已被確定和純化，并把含有該滅菌區的肽片斷命名為乳鐵多肽素（Lactoferricin，簡稱Lfcin）。體外用豬胃蛋白酶分別水解人、牛、豬的LF，可獲得相應的Lfcin。Lfcin都有1個由二硫鍵形成的環狀物，該環狀物由18個氨基酸組成，即人Lfcin由LF殘基20到37構成，牛Lfcin由殘基19 到 36構成。Lfcin具有比LF更強烈和更廣譜的滅菌活性。例如牛Lfcin對大腸桿菌O111或金黃色葡萄球菌的最低抑制濃度是LF的十分之一。已報道的牛Lfcin抗菌范圍包括許多G+和G-病原菌，例如大腸桿菌、腸炎沙門氏菌、綠膿桿菌

9、、金黃色葡萄球菌、產氣莢膜梭菌等。然而Lfcin不作用于雙歧桿菌等對人體有益的細菌。此外，還發現牛Lfcin具有滅真菌作用，可以直接與其細胞結合，以致命的方式殺死白色假絲酵母和絲狀真菌。為了驗證LF對腸道菌叢的影響，用含有052LF的牛乳飼養小白鼠，結果發現小白鼠消化道中的大腸桿菌繁殖受到抑制，這種腸道內的抑菌作用，抑制了腸道細菌向臟器的侵入。用添加LF調制奶粉哺育嬰兒，其糞便中雙歧桿菌明顯增多，糞便的pH降低，溶菌酶活性和有機酸含量呈上升趨勢。33 免疫調節活性 LF通過抑制巨噬細胞產生集落刺激因子（CSF）而抑制粒-單系祖細胞，這種抑制作用與分子中的鐵飽和程度有關，鐵完全飽和的LF抑制作用

10、最強。實驗觀察到，LF濃度為10-16mol/L就有抑制粒-單系祖細胞生長的活性。Apo-LF的抑制活力大為減低。細菌脂多糖、鋰鹽、類固醇性激素都可拮抗LF對粒-單系祖細胞的抑制作用，當這些物質存在時，LF抑制巨噬細胞釋放CSF的能力明顯降低。LF對抗體生成、T細胞成熟、NK細胞活性、某些細胞因子生成及前列腺素生成等都有調節作用。如可促進中性粒細胞或巨噬細胞的吞噬作用和滅菌作用，對NK細胞的活化和淋巴細胞、中性粒細胞的增殖具有調節作用，但其確切機制有待研究。34 抗感染活性 LF在炎癥中的作用在許多試驗中都已得到證實。在機體受到感染時，吞噬細胞受到刺激合成并釋放大量IL-l，在IL-1的作用下

11、，中性粒細胞釋放 LF并與 Fe3+結合，結合鐵的LF再被巨噬細胞所獲取，造成血鐵過低，血鐵降低使致病菌生長繁殖受到抑制。Lima（1986）發現，LF可增強單核細胞對微生物的吞噬和對胞內寄生菌的殺傷作用。LF雖木能增強中性粒細胞對微生物的吞噬作用，但可通過兩條不同的作用機制增強其胞內滅菌活性：l）ApoLF可通過對鐵離子的結合，抑制被吞噬細菌在腦內生長，從而促進中性粒細胞對細菌的殺傷；2）在胞內吞噬溶酶體中的酸性環境條件下，螫合鐵離子的LF可通過提供游離鐵離子催化自由基生成的方式，對吞噬溶酶體內的微生物產生殺傷作用。此外，LF還具有促進多形核白細胞粘附的作用，它能使多形核白細胞粘附于血管內皮

12、細胞，從而有利于白細胞對血管外炎癥部位的滲出。所以，有人把LF視為抗炎癥因子。35 抗氧化功能 較早以前就有人報道，在pH值為74的NaCl溶液中，飽和度為20的LF抑制了牛腦磷脂脂質體的抗壞血酸鐵鹽催化的磷脂過氧化反應。LF還降低吞噬細胞OH產生的可能，從而抑制了單核細胞膜的鐵催化自動氧化反應。因此，可認為LF的抗氧化機制主要是螫合了易引起氧化的鐵離子。 游離的Fe3+常常參與自由基反應，將O2-氧化為O2和 Fe2+，Fe2+又將 H2O2還原為OH、OH-和 Fe3+，最終完成了由 O2-和 H2O2生成 OH、O2和OH-的反應。中性粒細胞、單核細胞和巨噬細胞等是通過O2-將侵入機體的

13、病原菌殺死的，而聚集在炎癥或受感染部位的 Fe3+和 Fe2+會催化上述自由基反應，導致機體出現過多的氧自由基。但當游離鐵結合在LF上，就不容易參與自由基反應了。4 乳鐵蛋白的制備 人們自1960年以來就嘗試采用各種方法制備LF，例如采用色譜法、超濾法、鹽析法以及酸沉淀法等從人或牛乳中分離純化LF。其中，超濾法是日本學者島崎敬一提出的分離LF的新方法，操作簡便，費用低廉，易形成工業化規模生產，是生產食品用LF最具實現工業化生產的方法之一。目前，隨著分離精制技術不斷完善，已在工業規模上開發成功從干酪乳清和脫脂乳中制備純度高達95以上的LF，其生產技術要點是組合使用膜技術和色譜分離技術。 由于LF

14、的天然來源有限，所以大規模的工業化生產將依賴于基因工程。Liang等（1993）報道了人LF在啤酒酵母中的表達，通過將克隆的cDNA置于酵母螫合素啟動子的調控下，人LF成功地在酵母細胞中合成，然后通過酵母轉化酶分泌信號序列將重組人LF分泌至細胞外，產率為1520 mg/L。米曲霉是公認安全類細菌，飼料工業中使用的很多酶就是用這種菌生產的。按細胞外蛋白質的產量來說，米曲霉是最高產的。Conneely（1992）介紹了采用生物技術用曲霉菌生產LF的基本原理。Ward等（1992）把合成LF的遺傳信息轉移到曲霉菌中，然后在適宜條件下進行培養，從而實現了LF的優化生產，這是通過發酵大量生產LF的重大突破。美國Genpharm公司通過轉基因動物來生產LF。1990年他們采用新的試管法，在荷蘭生產了世界上第1頭雄性轉基因乳牛，并希望通過人工繁殖生產大量攜帶產生人LF基因的乳牛，以實現LF的大量生產。5 乳鐵蛋白的應用前景 基于LF廣泛的生物學功能，其應用前景非常廣闊。LF及其多肽衍生物可用作高效補鐵劑、防腐劑、抗氧化劑、抗真菌劑、免疫促進劑、抗腫瘤劑等。早在1988年，