1、流動相緩沖液 / 溶劑選擇, 梯度優(yōu)化, 流速選擇脫氣，流速穩(wěn)定, 流動相制備 柱高柱效, 二級作用力, 柱間變異, 溫度控制檢測靈敏度, 選擇性, 溫度波動影響樣品提取方法選擇, 樣品溶劑選擇, 氧氣影響儀器性能, 穩(wěn)定性, 耐用性, 易操作性綜合評估分析技術(shù)的穩(wěn)定性,可靠性, 定量準(zhǔn)確性HPLC如何得到好的結(jié)果 第1頁，共41頁。 流動相 溶劑混和率及其制備 (1)下面的兩種配制一樣嗎?水 / 乙醇= 1/1 (v/v)50%(v/v) 乙醇水溶液* 混和有機(jī)溶劑時注意體積變化混和液的密度不是兩種溶劑密度的簡單相加.25C 時，50mL 水和50ml乙醇混和, 最終體積為96ml.第2頁，

2、共41頁。水/乙醇=1/1 (v/v)分別量取500ml水和乙醇, 然后混和混和體積不是 1L.50%(v/v) 乙醇水溶液.加500ml乙醇于1L的容量瓶中, 加水至刻度.水的比例更高.1LWaterEthanolEthanolWater 流動相 溶劑混和率及其制備 (2)第3頁，共41頁。流動相 A: 20mM 磷酸 (Na) 緩沖液 / 乙腈= 9 / 1 (v/v)流動相 B: 10%(v/v) 乙腈/ 20mM 磷酸緩沖液 12331AB 2Peaks 1: acetaminophen 2: dihydrocodeine 3: caffeine0246810minColumn:Shi

3、m-Pack VP-ODS (150mmL. x 4.6mmI.D.)Flow rate:1mL/minTemp.:40CDetection:UV-VIS (210nm) 流動相 溶劑混和率及其制備 (3)第4頁，共41頁。配制: 20mM 磷酸緩沖液 (pH2.5) 流動相 緩沖液比例及其制備 (1)A : “20mM” 表示 磷酸濃度 加10mmol 磷酸和 10mmol 磷酸二氫鈉, 溶解于 1L水中 B : “20mM” 表示 鈉濃度 溶解 20mmol 磷酸二氫鈉于1L 水中, 加磷酸調(diào) pH 至 2.5C : “20mM” 表示 磷酸和鈉的濃度, 用高氯酸調(diào)節(jié)pH 溶解20mmol

4、 磷酸二氫鈉于 1L 水中,用高氯酸調(diào)節(jié)pH 至 2.5第5頁，共41頁。Column:Shim-Pack VP-ODS (150mmL. x 4.6mmI.D.)Flow rate:1mL/minTemp.:40CDetection:UV-VIS (210nm)流動相 A: 磷酸濃度為 20mM流動相 B: 鈉濃度為 20mM流動相 C: 磷酸，鈉濃度均為 20mM, 用高氯酸調(diào)節(jié)pH 流動相 緩沖液比例及其制備 (2)min12331AB 2Peaks 1: acetaminophen 2: dihydrocodeine 3: caffeine0246810C31,2不一樣的解釋Dihyr

5、ocodeine 出峰位置不一樣第6頁，共41頁。流動相緩沖能力弱pKa 與流動相pH相近的酸和堿的峰形變差. Column: STR ODS-II (150mmL. x 4.6mm I.D.)Mobile : 20mM buffer solution (pH 4.5)phase / acetonitrile (3/1, v/v)Flow rate: 1mL/minTemp.: 40CDetection: UV-VIS (240nm)左圖: 檸檬酸緩沖液pH( 4.5) 作流動相右圖: 磷酸緩沖液 (pH 4.5) 作流動相 流動相 pH 緩沖能力和 峰形第7頁，共41頁。 吸光度 HPLC

6、級的乙腈在 UV低波長有很低的吸收 HPLC級的乙腈適用于 UV低波長下高靈敏度的分析! 柱壓 乙腈更低. 相同流速下, 引起的柱壓更低. 洗脫能力 乙腈更強(qiáng). 一些化合物甲醇容易洗脫. ( 胡蘿卜素,膽固醇) 選擇性 不同. 峰形 不同. 聚合物基底的柱子, 乙腈更好. 流動相脫氣效率 與水混和時要注意甲醇 發(fā)熱 氣體溢出 乙腈 吸熱 氣體溶解 流動相 甲醇和乙腈的不同 第8頁，共41頁。保留時間改變峰面積改變 定量錯誤!對絕對量響應(yīng)的檢測器 流速不影響峰面積.對濃度響應(yīng)的檢測器 流速影響峰面積.*幾乎所有的 LC 檢測器均為濃度型檢測器 流動相 流速變化的影響 (1)第9頁，共41頁。1.

7、009729145912886547n-butylparaben1.009826520872626362n-propylparaben1.009627710872744605ethylparaben1.009539382133901107methylparabenB/AB (0.99mL/min)A (1.00mL/min)面積比峰面積Column: Shim-Pack VP-ODS (150mm L. x 4.6mm I.D.)Mobile phase: methanol / water = 6/4 (v/v)Flow rate: A ; 1.00mL/min B ; 0.99mL/minT

8、emperature: 40CDetection: UV-VIS (260nm) 流動相 流速變化的影響 (2)第10頁，共41頁。兩臺泵進(jìn)行混和時ABA : 一臺泵輸送預(yù)先混和好溶劑B : 兩臺泵分別輸送兩種溶劑并混和Peaks 1: methylparaben 2: ethylparaben 3: propylparaben123 流動相 高壓梯度時流速變化的影響 (1)保留時間和預(yù)先混和好的溶劑不同第11頁，共41頁。1.01330752593035538n-butylparaben1.01327971802761054n-propylparaben1.01329225562885602

9、ethylparaben1.01341518764100127methylparabenB/ABA面積比峰面積Column: Shim-Pack VP-ODS (150mmL. x 4.6mm I.D.)Mobile phase: methanol / water (6/4, vol/vol)Flow rate: 1.00mL/minTemperature: 40CDetection: UV-VIS (260nm) 流動相 高壓梯度時流速變化的影響 (1)A : 一臺泵輸送預(yù)先混和好溶劑B : 兩臺泵分別輸送兩種溶劑并混和第12頁，共41頁。氣泡出現(xiàn)的原因當(dāng)溶解的空氣超過空氣的溶解度時. 原因

10、: 溶劑溫度升高, 壓力降低, 溶劑混和等.氣泡可能引起的問題流動相, 泵保留時間波動, 流動相流量不穩(wěn)定柱峰變形, 柱效降低檢測器產(chǎn)生噪聲解決方法: 離線和在線脫氣 然而, 問題不僅由于氣泡引起, 而且由于溶解的空氣引起. 流動相 流動相中的氣泡引起的問題第13頁，共41頁。熒光檢測器氧氣引起熒光猝滅 改變峰面積 吸光型檢測器改變背景吸收 基線波動 (特別是在梯度洗脫時)氧氣吸收峰出現(xiàn)示差折光檢測器基線波動 流動相 流動相中的空氣對檢測器的影響第14頁，共41頁。 Degassed Not degassed* 熒光檢測器分析bisphenol A脫氣 : 氦脫氣 流動相 熒光檢測中脫氣的影響

11、 (1)流動相脫氣可能影響熒光檢測的靈敏度. 第15頁，共41頁。脫氣時間對氣液半透膜 脫氣效果的影響. 0123450102030405060脫氣開始時間 (min)Peak Area Value (106)Degasser OFFDegasser ONColumn : Shim-Pack VP-ODS (150mm L x 4.6mm I.D.)Mobile Phase: acetonitrile/H2O = 4/1 (v/v)Flow rate : 1mL/minTemperature : 40CAnalyte : PyreneDetection: Fluorescence (Ex 31

12、0nm, Em 390nm)Degassing:Gas-liq. separation membrane 流動相 熒光檢測中脫氣的影響 (2)第16頁，共41頁。甲醇吸收光譜圖如果溶解的氧氣濃度高， 有機(jī)溶劑的吸光度液也高. 在短波長區(qū)影響更為明顯. 流動相 UV 檢測器的背景變化飽和空氣脫氣第17頁，共41頁。進(jìn)流動相引起出峰!? 流動相 溶解的空氣引起UV檢測器的出峰Detection: UV- 210nm流動相和樣品溶劑中溶解氣體量不同引起出峰流動相脫氣流動相沒脫氣Oxygen bubblingAir saturationHe bubblingOxygen bubblingAir sat

13、urationHe bubbling第18頁，共41頁。放大 流動相 溶解空氣引起的RID檢測器出峰Column : SCR-101CMobile phase : Water Flow rate : 0.5mL/minTemperature : 85CDetection : RID detectorDegasser : Gas-liq. Membrane Separ. (DGU-14A)Sample : 0.5% mannitol流動相和樣品溶劑中溶解氣體量不同引起出峰.第19頁，共41頁。一般, 環(huán)境溫度影響光譜圖的形狀. 波長高溫下的光譜圖由于溫度變化引起的吸光度差異低溫下的光譜圖吸光度

14、檢測 UV 檢測器池溫度的影響 (1)第20頁，共41頁。不控制溫度時峰面積比較 (34C)0.9680.985p-toluic acid0.9860.991Benzoic acid0.9910.994Phenol50C40C與 34C時的峰面積比Column : Shim-Pack VP-ODS (150mm L. x 4.6mm I.D.)Mobile phase : 10mM acetic acid (sodium) buffer solution (pH 4.5) / Methanol = 7/3, (v/v)Flow rate : 1mL/minTemperature : 40CDe

15、tection : UV-VIS (260nm) 檢測 UV 檢測器池溫度的影響 (2)第21頁，共41頁。無溫度控制 (RF-10AXLsuper)2025C面積降低了13.5%2025C面積降低了2.2% 檢測 池溫度對熒光檢測器的影響 (1)正常情況下, 溫度越高, 熒光靈敏度越低. 氮蒽分析結(jié)果(溫度對熒光靈敏度的影響)無溫度控制 (RF-10AXL)第22頁，共41頁。0.779110171185514LEU0.7711266831457340ILE0.777900131026839MET0.7812260421565440VAL0.78138426177078CYS0.771203

16、5291558560ALA0.7919249002440772GLY0.86436522505373PRO0.7710177681315462GLU0.7712042731570743SER0.7711439251478447THR0.7811657571500427ASP40C20C面積比A40/A20峰面積面積比A40/A20峰面積40C20C0.768391831105530ARG0.69336837487433LYS0.7914316651819675HIS0.769958321315479PHE0.748509761156850TYR儀器:Shimadzu 氨基酸分析系統(tǒng) (用OPA

17、作柱后衍生)檢測:RF-10AXL Super (Ex 350nm, Em 450nm) (池溫度 ; 20C, 40C) 檢測 池溫度對熒光檢測器的影響 (2)第23頁，共41頁。Bisphenol A 在各種溶劑中的熒光光譜 (激發(fā)波長 270nm, 使用背景校正) 檢測 溶劑對熒光靈敏度的影響甲醇乙腈波長第24頁，共41頁。不冷卻時, 抗壞血酸逐漸降解. 柱 :SCR-101N (250mmL. x 7.9mm I.D.)流動相 :10mM 草酸鈉緩沖液 (pH 3.8) ，含有 1mM EDTA2Na 流速: 1mL/min溫度 : 40C檢測: UV-VIS (245nm)抗壞血酸峰

18、面積的變化 樣品 冷卻可以防止樣品降解冷卻未冷卻第25頁，共41頁。 樣品 樣品溶劑對峰形的影響 (1)流路方向 甲醇溶劑被分析物流路方向 水溶劑被分析物*水 /甲醇作流動相的反相色譜不同樣品溶劑對理論塔板數(shù)的 影響. 水溶劑甲醇/ H2O甲醇溶劑樣品: 10ul 咖啡因柱:Shim-pack CLC-ODS (150mmL. x 6mm I.D.)流動相:甲醇 / H2O =3/7流速: 1mL/min溫度 : 室溫.檢測: 270nm理論塔板數(shù)進(jìn)樣體積第26頁，共41頁。左圖. : 樣品溶劑 水 / 乙腈 = 3/1 (v/v)右圖.: 樣品溶劑 - 乙腈Column : STR ODS-

19、II (150mm L. x 4.6mm I.D.)Mobile : 20mM citric acid (sodium) bufferPhase : solution (pH 4.5) / acetonitile = 3/1 ( v/v)Flow rate : 1mL/minTemp. : 40CDetection : UV-VIS (240nm) 樣品 樣品溶劑對峰形的影響 (2)如果樣品溶劑比流動相強(qiáng) , 峰形惡化. 第27頁，共41頁。提高分析的準(zhǔn)確度離線前處理很難保證完全一致, 可能降低準(zhǔn)確度簡化操作離線處理需要很強(qiáng)的技能提高處理效率晚上也能進(jìn)行自動前處理, 可以極大的提高處理效率 樣

20、品 自動樣品前處理的優(yōu)點(diǎn) 第28頁，共41頁。 樣品 HPLC柱切換系統(tǒng) 血樣直接進(jìn)樣 (Co-Sense for BA) 泵分析柱自動進(jìn)樣反相內(nèi)表面預(yù)處理柱Shim-Pack MAYI-ODS泵檢測器流動相流動相稀釋流路多聚體，例如蛋白 藥物膜藥物和內(nèi)表面示意圖第29頁，共41頁。08.517Time (min)蛋白異丙基腎上腺素進(jìn)樣體積 : 100L流動相 (進(jìn)樣路) : 0.1% 磷酸 /乙腈 = 95/5 (v/v)檢測 : 異丙基腎上腺素；275nm 血漿基質(zhì)；280nm 樣品 用 Co-Sense對生物樣品分析進(jìn)行自動樣品前處理 添加了異丙基腎上腺素的血漿分析第30頁，共41頁。血

21、漿中分別添加 2mg/mL ketoprofen 和naproxen 的回收率比較(50mL進(jìn)樣.)手動預(yù)處理(添加乙腈)用Co-Sense進(jìn)行自動預(yù)處理 樣品 不同預(yù)處理方法的回收率比較第31頁，共41頁。原因: 由于離子作用力或 配位異構(gòu)力引起的對 金屬離子的吸附(離子或者堿性化合物) 清除吸附的化合物 （洗針）控制吸附產(chǎn)生 （使針惰性化）原因: 由于樹脂氫鍵力引起的吸附 (脂溶性化合物)使用有機(jī)溶劑清洗轉(zhuǎn)子密封槽改變轉(zhuǎn)子密封材料來降低吸附 樣品過載的原因及控制使用自動進(jìn)樣器時交叉污染的原因及控制手段第32頁，共41頁。清洗此表面是重要的針清洗狀態(tài)進(jìn)樣狀態(tài)樣品環(huán)泵柱洗針口針針密封 樣品 洗

22、針機(jī)理 (全量進(jìn)樣)第33頁，共41頁。若控制由于離子作用力或 配位異構(gòu)力引起的對 金屬離子的吸附(離子或者堿性化合物) 酸化.大濃度的配位離子作離子對試劑. (例如) 100mM 高氯酸水溶液 / 甲醇(或乙腈)由于疏水作用力引起的化合物吸附 ( 樹脂型化合物)有機(jī)溶劑清洗.* (例如) 100% 甲醇, 乙腈, THF等. 樣品 洗針溶劑的選擇第34頁，共41頁。被分析物 : 氯乙醇 (堿基化合物)進(jìn) 2L 的標(biāo)準(zhǔn)溶液 (含有 1.2mg/ml 溶解化合物的流動相), 連續(xù)注射 2L 的流動相, 比較面積. 柱 ：Shim-pack VP-ODS (150mmL.x 2.0mm I.D.)

23、流動相 ：含有100mMNaClO4的 10mM 磷酸緩沖液 (pH 2.6) / 乙腈 = 55 / 45 (v/v)流速：0.2mL/min溫度：40C檢測：UV (260nm，using semi micro cell) 樣品 降低由于堿性物質(zhì)引起的交叉污染 (1)0.04250.0004251W/O Wash0.07300.0007301W/ Wash空白標(biāo)準(zhǔn)溶液交叉污染%相對峰面積針密封:SUS清洗液:流動相洗針程序 :在洗針口浸洗 3 sec.吸樣品液.在洗針口浸洗 3 sec.進(jìn)樣.第35頁，共41頁。不同惰性化SUS針密封方法的比較0.00230.0000231特富龍涂層0.04250.0004251SUS0.00090.0000091特殊的金屬涂層0.00210.0000211PEEK 涂層BlankStandard Solution交叉污染 %相對面積浸入洗液 3 sec. 其他條件同上頁相同. 樣品 降低由于堿性物質(zhì)引起的交叉污染 (2)第36頁，共41頁。進(jìn) 2L 流動相的色譜圖 樣品 降低由于堿性物質(zhì)引起的交叉污染 (3)在分析氯乙醇時 (堿基化合物),通過浸洗