1、LncRN頌究之IncRNA芯片分析LTLncRNA研究之IncRNA芯片分析IncRNA芯片分析L歸一化IncRNA芯片采用的歸一化的方法為 quantile normalization。2.差異 LncRNA 的篩選 IncRNA芯片中既有IncRNA的探針又有mRNA的探針，分 別做差異基因的篩選，篩選方法同表達譜的篩選方法是一致 的，參見表達譜的差異基因篩選。3.差異IncRNA的重注 釋IncRNA芯片注釋不完善，因此需要將篩選出來的IncRNA 進行重注釋。將差異IncRNA在基因組上位置上下游延伸， 以尋找IncRNA附近的有功能的基因。4.差異IncRNA靶基因的預測IncRN

2、A可能通過調控相應的 mRNA發揮功能，因此有必要預測IncRNA的靶基因。我們 提取差異IncRNA和mRNA的序列，首先用blast進行初篩, 之后用RNAplex進行進一步篩選，以預測IncRNA可能調控 的 mRNAo.差異IncRNA與靶基因共表達網絡預測出IncRNA的靶基因后，并可進一步在mRNA的數據中探尋該mRNA是否發 生表達量的變化。由此構建差異IncRNA與靶基因相互作用 網絡圖。.差異IncRNA與差異mRNA的共表達分析SBC Human IncRNA芯片能同時檢測出差異表達的IncRNA和mRNA。我們將差異IncRNA和差異mRNA在一組樣品中進行共表達 分析，

3、可以發現與某個IncRNA具有相同表達模式的mRNAo 要求：每組數據3個或3個以上生物學重復 實驗組： 對照組：7.差異IncRNA靶基因的GO analysis對IncRNA 的靶基因進行GO Ontology的生物學的分類，根據Fishers Exact Test彳導到p-value,得到IncRNA靶基因對應的顯著性 功能，從而了解IncRNA的功能0 8.差異IncRNA靶基因 的pathway analysis對IncRNA靶基因按照Pathway的主要 公共數據庫KEGG和Biocarta來進行分類，對Pathway中 的基因進行基于離散分布的顯著性分析，得到與實驗目的有 顯著聯

4、系的Pathway分類,由這些pathway對應相應的靶基 因，從而獲得該分類即導致IncRNA差異的最重要Pathwayo 9.差異IncRNA的轉錄因子的預測提取IncRNA TSS的上游 2000bp,下游500bp，利用HMM的算法根據TRANSFAC8.1 數據庫預測其轉錄因子。10.IncRNA cis作用機制研究：對 于感興趣的差異表達IncRNAs,搜索其上下游100K范圍內 的所有編碼基因，并與該IncRNAs有顯著共表達的基因取 交集。這些在基因組上臨近、且表達模式上共表達的基因很 可能被該IncRNAs所調控。11. IncRNA trans作用機制研究：計算LncRNA

5、s共表達的 編碼基因，集合與轉錄因子/染色質調控復合物的靶基因集合 的交集，利用超幾何分布計算該交集的富集程度，得到與 IncRNAs顯著相關的轉錄因子，從而識別可能與IncRNAs聯合發揮調控作用的轉錄因子 /染色質調控因子。綜述長鏈非編碼 RNA (IncRNA) IncRNA長鏈非編碼 RNA (long noncoding RNA , IncRNA )是一類不編碼蛋白的 RNA 分子， 長度在200bp以上，起初被認為是 RNA聚合酶II轉錄的 副產物，不具有生物學功能；近期的研究表明IncRNA具有保守的二級結構，可以與蛋白、DNA和RNA相互作用，參與多種生物學過程的調控，尤其在腫

6、瘤當中發揮了重要的 調控角色，如染色質修飾、轉錄激活和抑制、轉錄后調解以 及作為miRNA的誘導分子干擾基因的表達等。隨著高通量 測序技術的發展，越來越多的IncRNA被注釋，但是絕大多數的IncRNA的功能仍然不清楚，因此IncRNA 的研究是一 片非常廣闊的未知領域，具有極大的研究價值和意義。IncRNA 介紹長鏈非編碼 RNA (long non-coding RNA , IncRNA )是一類轉錄本長度超過 200nt、不編碼蛋白的 RNA。 lncRNA起初被認為是基因組轉錄的“噪音”，不具有生物學 功能。然而，近年來的研究表明lncRNA能在表觀遺傳、轉錄及轉錄后水平上調控基因表達

7、，參與了X染色體沉默、基因組印記以及染色質修飾、轉錄激活、轉錄干擾、核內運輸 等多種重要的調控過程，與人類疾病的發生、發展和防治都 有著密切聯系。為何細胞不惜耗費能量對這些非編碼RNA的表達和定位進行嚴格調控呢？這些RNA分析究竟有何功能？ RNA測序技術的發展使人們得以初窺這一神秘分子，現在IncRNA的許多相關信息都可以再新數據庫中查到，例如Broad研究所、哈佛大學和麻省理工共同開發的HumanBody Map lincRNAs catalog 。雖然近年來關于 IncRNA 的 研究進展迅猛，但是現在人們了解到的lncRNA只是冰山一角，絕大部分的lncRNA的功能仍然是不清楚的。隨著

8、研究 的推進，各類lncRNA的大量發現，lncRNA的研究作為RNA 研究的新領域，已經成為一個非常吸引人的方向，有待廣大 科學家去探尋。lncRNA研究當前面臨的一個主要挑戰是， 研究工具還在不斷開發和改進中，而lncRNA研究中非常關鍵的一步就是發現與特定疾病相關的lncRNA o現階段，基因芯片技術發展趨于成熟穩定，在此平臺上，通過設計不同 檢測lncRNA探針篩選lncRNA是一種準確快捷的方法。lncRNA 特征lncRNA 通常較長，具有 mRNA 樣結構，有些 具有poly(A)尾巴，有些沒有poly(A)尾巴，分化過程中有動 態的表達與不同的剪接方式，與編碼基因相比，lncR

9、NA表達量更低。冰 組織特異性：不同組織之間的lncRNA表達量不同。X時空特異性：同一組織或器官的不同生長階段，其 中的lncRNA表達量也會變化。X lncRNA啟動子同樣可以 結合轉錄因子，如 Oct3/4 , Nanog , CREB, Sp1 , c-myc , Sox2與p53，局部染色質組蛋白同樣具有特征性的修飾方式 與結構特征。派大多數的lncRNA在組織分化發育過程中， 都具有明顯的時空表達特異性，如有人針對小鼠的1300個IncRNA進行研究，發現在腦組織中的不同部位，IncRNA具有不同的表達模式。派在腫瘤與其他疾病中有特征性的表達 方式。IncRNA的亞細胞位置上也呈多

10、樣化，在細胞核、 細胞質和細胞器均有分布，甚至某些IncRNA具有獨特的亞細胞位置，有可能是全新的亞細胞構成。IncRNA功能IncRNA可從染色質重塑、轉錄調控及轉錄后 加工等多種層面實現對基因表達的調控：a） IncRNA通過招募染色質重塑復合物至特定的基因組位點使其發生催化活 性。如 HOTAIR21 , Xist、RepA 和 Kcnqotl 招募 Polycomb complex 至HoxD 位點，使得 X染色體或 Kcnq1功能域的 組蛋白H3第27位賴氨酸發生3甲基化（me3K27 ）,誘導 異染色質形成，從而抑制該區域基因表達。b） lncRNA通過多種機制進行轉錄水平調控。l

11、ncRNA結合到基因cyclin D1上，招募RNA結合蛋白TLS來調控蛋白CBP和p300的組 蛋白乙酰轉移酶活性，進而抑制cyclin D1轉錄。c）超保守增強子轉錄由lncRNA-Evf2 ,該lncRNA能激活轉錄因子 DLX2 ,進而調控基因 Dlx6轉錄。d） DHFR次要啟動子區域 轉錄由的lncRNA與該基因主要啟動子區域結合形成三聚 體，抑制轉錄因子TFIID結合，從而使基因DHFR發生沉默。 e）反義lncRNA能夠與剪接體（splicesome ）中鋅指同源 mRNA Zeb2的5剪切位點結合，使內含子未被剪切掉，而 該內含子序列中保留有內部核糖體進入位點（IRE位點），

12、翻 譯過程中識別并結合該位點，導致 Zeb2基因表達和翻譯, IncRNA分子機制隨著IncRNA功能逐步顯現，具與靶點的作用機制成為進一步的熱點。早期認為原位調控是LncRNA作用的唯一機制，它通過招募形成染色質修飾復合物而沉默 鄰近基因轉錄，例如 IGF2R反義RNA（antisense of IGF2RRNA ,AIR）、XIST 等。而 Hox 基因反義基因間 RNA（Hox antisense intergenic RNA , HOTAIR）的發現提示 LncRNA 可能存在遠程調控。同源異型基因（homeotic genes , HOX）在細胞增殖與定向分化中起關鍵作用，人類Hox

13、基因簇約含100個ncRNA 基因，其中 HOTAIR定位于HOXC基因座 12q13.13 o HOTAIR的5端可招募結合多梳蛋白抑制復合物 2（polycomb repressive complex2 , PRC2）,借助 PRC2 上 三個H3K27甲基化酶 EZH2、SUZ12和EED,使另一基因座 HOXD上長約40kb的序列轉錄沉默，從而在乳腺上皮細胞 內使細胞內轉錄傾向于胚胎成纖維細胞樣表型。超過20%的LncRNA能夠通過結合PRC2或其他類似復合物發揮作用， 提示LncRNA的遠程調控機制在生物體內廣泛存在。其作用機制如下圖所示，主要包括以下幾種情況：1）在編碼蛋白基因的上游啟動子區（橘色）轉錄，從而干擾鄰近蛋白編碼基因（藍色）的表達（如醉母SER3基因）；2）抑制RNA聚合酶n,或介導染色質重構和組蛋白修飾，而 影響基因（藍色）表達；3） lncRNA （紫色）與編碼蛋白基因的