1、從土壤里分離及鑒定細菌的實驗方案1實驗材料：新鮮土壤。a）培養基：滅菌的牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基；高氏一號培養基；馬鈴薯蔗糖培養基；細菌半固體培養基；淀粉培養基；葡萄糖酵解培養基；乳糖酵解培 養基；LB培養基b）試劑：草酸銨結品紫染液、番紅復染液等各種染料以及盧戈氏碘液、95%乙醇、5%孔雀綠水溶液、無菌水等c）儀器：有玻璃珠100ml三角瓶（1）、培養皿（50套）、試管（20支）、移液 管（3支）、燒杯、玻璃棒、載玻片、蓋玻片、光學顯微鏡、涂布棒、U 型管、德漢氏小管、酒精燈、漏斗、接種環、濾紙、棉塞、牛皮紙、無 菌操作臺、滅菌鍋、紗布，電子天平、記號筆，火材等相關培養基的配方:相關培養基的配

2、方表牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基牛肉膏3g蛋白胨10g瓊脂15-20g水1000mlNaCl 5gPH 7. 47. 6高氏一號培養基可溶性淀粉20g瓊脂1520g水1000 mlNaCl 0. 5gKNO3 1g .K2HPO4-3H2O 0. 5g MgSO4- 7H2O 0. 5g FeSO4-7H2O 0. 01g馬鈴薯蔗 糖培養基葡萄 糖20g馬鈴薯200g瓊脂1520g水1000 ml細菌半固體培養基肉膏蛋白胨液體培養基瓊脂0.35-0.4PH 7.6淀粉培養 基牛肉膏5g蛋白胨10g瓊脂1520g水1000 mlNaCl 5g可溶性淀粉2g葡萄糖酵解培養基蛋白胨水培養基1000ml1.

3、6%漠甲酚紫乙醇溶液1-2mlPH 7.6乳糖酵解培養基牛肉膏3g蛋白豚10g1.6%漠甲酚紫乙醇溶液1-2ml水 1000mlNaCl 5g乳糖5gLB培養基酵母膏5g蛋白豚10g水 1000mlNaCl 10gPH 7.01.1實驗總流程依次各偵1LB培養基1 土壤取樣:2制備土壤稀釋液：稱取土壤1g,放入99mL無菌水的三角瓶中，振蕩20min,即為稀釋10-2的土壤懸液。另取裝有9mL無菌水試管5支，用記號筆分別編上10-3、10-4、10-5、10-6。取已稀 釋成10-2的土壤液，振蕩后靜止0.5min，用無菌吸管吸取1mL 土壤懸液加入10-3的無菌 水的試管中，并在試管內輕輕吹

4、吸數次，使之充分混勻，即成10-3 土壤稀釋液。同法依次 連續稀釋至10-4、10-5、10-6,10-7 土壤稀釋液。在土壤稀釋過程中，需換用不同的吸管（或槍頭）3倒平板富集培養3.1按照配方分別在三種培養基上富集培養，每一個稀釋梯度每一個培養做三個平行實驗。 其如下表：10-410-510-610-710-8牛肉膏蛋白豚瓊脂培養基ABC高氏一號培 養基ABC馬鈴薯蔗糖培養基ABC3.2吸取稀釋液取一吸管，以無菌操作法分別吸取10-4、10-5、10-6,10-7 土壤稀釋液0.1mL，加在已 制好的平板培養基上。3.3涂板用玻璃刮鏟將稀釋液在培養機上充分混勻鋪平，倒置于恒溫箱培養。3.4計

5、算出每克土壤中細菌的數量。細菌數=某一培養皿內真菌的菌落數X該培養皿接種液的稀釋倍數即得4分離4.1配置LB培養基4.2劃線4.2.1連續劃線法將挑取有樣品的接種環在平板培養基表面作連續劃線。完畢后，倒置于28300C溫室培養。4.2.2分區劃線法用接種環以無菌操作挑取土壤稀釋液1環，先在培養基的一邊作第一次平行劃線34條， 再轉動培養皿約600C角，并將接種環上剩余物燒掉，待冷卻后通過第一次劃線部分作第二 次劃線會，同法依次作第三次和第四次劃線。劃線完畢，蓋上皿蓋，倒置于溫室培養。10-410-510-610-710-8連續劃線法ABC分區劃線法ABC4.4斜面培養將分離好的菌接種到斜面培養

6、基上培養保存5鑒定5.1細菌菌的基本形態及運動性鑒定a）簡單染色步驟涂片取一塊載玻片，在上邊用膠頭滴管加半滴無菌水，用接種環無菌操作將沾 有菌的接種環置于載玻片上的無菌水種涂抹，待看到微弱的渾濁即可；（注 意取菌不要太多）干燥與固定涂菌面朝上，通過火焰以干燥并固定菌物，固定過程應使載玻片通過火焰2-3次，注意溫度的控制，過熱的溫度會將細菌殺死，溫度以手背感覺微 微發燙為標準；染色將載玻片平放于載波片支架上，滴加結品紫染液覆蓋涂菌部位即可，染色 1.5min水洗傾去染液，將載玻片的涂菌面朝下，自來水沖洗，水流不宜太急、太大， 全洗出水無色為止；V.干燥用吸水紙吸去多余水分后自然干燥；vi.鏡檢將

7、制備好的樣片置于顯微鏡下進行觀察，先低倍觀察，再高倍觀察，并找 出適當的視野后，將高倍鏡轉出，在涂片上加香柏油，用油鏡觀察細菌的 形態。b）革蘭氏染色步驟涂片先在載玻片一側用記號筆標記間隔的四個區域，在另一側四個區域的位置 分別滴加半滴無菌水。分別取四種活躍生長期菌種（大腸桿菌，金黃色葡 萄球菌，枯草桿菌和一種自選菌）按常規方法涂片（不宜過厚），用酒精 燈按照簡單染色中所述干燥和固定的方法對四種菌進行干燥和固定。初染滴加草酸銨結品紫染液使之覆蓋涂菌部位，染色1.5min后水洗；媒染先用盧戈氏碘液沖去殘留水跡，再用碘液覆蓋1min后水洗；脫色先用乙醇沖去水跡，然后用95%乙醇覆蓋脫去色素，脫色約

8、30s，立即用 水沖洗；復染先用番紅洗去水跡，然后滴加番紅復染1.5min后水洗；鏡檢將制備好的樣片置于顯微鏡下進行觀察，先低倍觀察，再高倍觀察，并找 出適當的視野后，將高倍鏡轉出，在涂片上加香柏油，用油鏡觀察細菌。 分別以大腸桿菌與金黃色葡萄球菌所染顏色作為對照，來判斷枯草桿菌以 及另一種自選菌的染色結果。c）半固體穿刺法觀察細菌運動性配制培養基配制半固體牛肉膏蛋白胨培養基，分裝于4支試管內，110度滅菌20-30 分鐘，正立于燒杯中冷卻全室溫；在無菌操作臺上右手握接種針，以針挑取菌苔.垂直刺入半固體瓊脂培養的中心直至接近（但勿觸及）試管底，然后循原路退出。如圖所示：5.2細菌菌的生理生化試

9、驗a）淀粉水解試驗培養基制備配制淀粉培養基，滅菌后將冷卻至50 r左右，無菌操作制成平板；接種用記號筆將平板劃成四部分，將所鑒定的菌種在不同位置點種。（注：由于 四種菌對淀粉的水解程度不同，為防止由于接種量過大導致四種菌對應區域水解 部位發生重疊，宜采用點種的方式，如下圖）。接種完成后貼好標簽；培養將上述已接種的平板倒置于30r培養箱中培養48小時。b）葡萄糖發酵試驗培養基配制將配制好的葡萄糖發酵培養基分裝于試管中同時向每只試管中加入一支德 漢氏小管后放入滅菌鍋中進行濕熱滅菌，冷卻全室溫。接種用記號筆在各試管上分別標明發酵培養基名稱和所接種的菌名。取盛有葡萄 糖發酵培養基的試管2支，接種鑒定菌

10、，另一支作為對照。培養將上述已接種的試管置于30r培養箱中培養48小時。c）乳糖發酵試驗培養基配制將配制好的乳糖發酵培養基分裝于試管中同時向每只試管中加入一支德漢 氏小管后放入滅菌鍋中進行濕熱滅菌，冷卻全室溫。接種用記號筆在各試管上分別標明發酵培養基名稱和所接種的菌名。取盛有乳糖 發酵培養基的試管2支，接種鑒定菌，另一支作為對照。培養將上述已接種的試管置于30r培養箱中培養48小時。d）甲基紅試驗i. 培養基的配制將配制好的蛋白胨水培養基分裝于試管中后放入滅菌鍋中進行濕熱滅菌，冷 卻全室溫。ii. 接種用記號筆在各試管上標明所接種的菌名。取盛有蛋白胨水培養基的試管2 支，接種鑒定的菌種。培養將上述已接種的試