1、現代生物技術概論課程要求劉柱生物系2012.03.04授課方式 授課方式以PowerPoint講板為主；1課堂教學2課外教學 多種渠道的師生交流； 科學報告會；1 平時成績（20分）1)考勤（10 分)2) 課堂回答問題（10分）考試分數的組成2 科學報告會（30分）3考查或考試（50分）科學報告會參考題目4人左右組成小組，講解英文文獻。主要內容：一、現代生物技術概述及應用二、細胞工程概述三、基因工程技術四、基因克隆的一些方法 生物技術（Biotechnology）和生物工程（bioengineering）這兩個名詞常可通用。當“生物工程”不是指具體的工程項目，而是表示所用的技術系統時，它就等

2、同于“生物技術”了。 然而，有時一種生物工程包含不只一種生物技術，在具體概念上兩者還是有區別的。 生物工程的概念、特點 生物工程的發展歷程 生物工程的應用一、生物工程（一）生物工程的概念、組成及特點 概念：是以生命科學作為基礎，應用自然科學及工程學的原理，對生物資源（包括動物、植物和微生物）進行利用、改造并為人類提供服務的一個綜合性技術體系。 運用現代生物學理論與科學技術改造細胞的遺 傳物質，獲得具有優良品質的動物、植物或微 生物品系； 工業規模地利用現有生物體系，制備生物產品； 模擬生物體系，以生物化學代替化學工程，制備 工業產品； 發展相應的科學理論與工程技術。生物工程概念的內涵：生物工程

3、的概念、組成及特點生物工程產品包括：大宗化工產品，如乙醇、檸檬酸、葡萄糖酸等；精細化工產品，如各種氨基酸、酶制劑；醫藥產品，如各種抗生素、多種甾體激素和維生素、 常規菌苗、疫苗等；其他產品，如生物農藥、食用及藥用酵母、飼料蛋白 (單細胞蛋白)、沼氣等；現代生物技術產品，即通過重組DNA技術和細胞融合 技術等方法生產的產品，如干擾素、單克隆抗體、新 型疫苗等。 生物工程的概念、組成及特點 發酵工程 酶工程將常規菌(或動植物細胞株)作為特定遺傳物質受體，使它們獲得外來基因，成為能表達超遠緣性狀的新物種.為這有巨大潛在價值的新物種創造良好的生長與繁殖條件，進行大規模的培養主要技術范疇： 基因工程 細

4、胞工程蛋白質工程組織工程 生物醫學工程等 1、基因工程：是以分子遺傳學為理論基礎，以分子生物學和微生物學的現代方法為手段，將不同來源的基因（DNA分子），按照預先設計的藍圖，在體外構建雜種DNA分子，然后導入活細胞，以改變生物原有的遺傳特性、獲得新品種、生產新品種的過程。 特征：1)外源核酸分子能在不同的寄主生物中進行繁殖，可以跨越天然物種屏障； 2)實現很少量DNA樣品“拷貝”出大量的無污染其它DNA序列的DNA群。獲得目的基因構建基因表達載體將目的基因導入受體 細胞檢測基因是否穩定高效表達基因工程的相關技術：DNA體外重組技術：核心技術克隆技術：通過細胞的無性繁殖基因工程的應用：轉基因生物

5、：超級細菌、轉基因動物的“乳腺 制藥廠”；基因診斷與治療；基因工程藥品：如用大腸桿菌生產人工胰島素、 干擾素及疫苗等；真核基因的表達調控；2、發酵工程：指采用現代工程技術手段，在活細胞催化劑（主要是微生物細胞）作用下，為人類生產有用產品的過程。包括菌種的選育、培養基的配制、滅菌、擴大培養和接種、發酵過程和產品的分離提純等方面。 菌種的來源包括細菌、放線菌、酵母菌和霉菌四大類 供菌體生長和產物形成所用培養基的制備；培養基、發酵罐和附屬設備的滅菌；供發酵生產用的種子制備；在發酵罐中提供最佳條件，以使菌體生長和產物形成；產品的提煉和純化；生產中所產生的廢物的處理。發酵工程按獲得的產品分為四個主要類型

6、： 以獲得微生物細胞為產品的過程； 以獲得微生物酶為產品的過程； 以獲得微生物代謝產物的過程； 以微生物進行生物轉化的過程 3、酶工程：是指利用酶催化劑所具有的特異催化功能，借助工藝學手段和生物反應器裝置來生產所需的生物化工產品的過程。包括酶制劑的制備、酶的修飾與改造、酶的固定化及酶反應器等方面。主要應用于食品工業、輕工業以及醫藥工業中。 酶反應過程專一性強，轉化率高，但成本較高；發酵過程應用面廣，成本較低，但反應機理復雜，難以進行控制，產物中常含有雜質，給提取帶來困難。 、 產酶的微生物發酵或動植物細胞培養過程。胞內酶的微生物細胞破碎過程，胞外酶直接將發酵液過濾除去菌體即可。酶的分離純化過程

7、。根據酶分子與其他蛋白質之間性質的差異，例如分子的大小、溶解度的不同，用鹽析法、有機溶媒沉淀法、電滲析法、離子交換層析和電泳法等技術，將酶進行分離純化。 酶的修飾：酶蛋白側鏈基團的修飾、金屬離子置換等，以提高酶活力、穩定性，降低或消除抗原性。 酶固定在載體上的固定化過程。 酶反應器的設計和酶反應控制。對于游離酶反應，通常采用分批攪拌槽反應器；對于固定化酶反應，則常用連續柱式反應器。 酶工程的流程：4、細胞工程：應用細胞生物學的方法，有計劃地改變細胞遺傳物質并使之增殖，從而生產有用的產物或引向成體化的綜合科學技術。 細胞工程包括：細胞大量培養及控制生長、增殖并引向成體化等一系列技術、細胞融合技術

8、、細胞拆合技術、向細胞內引入高分子物質等技術。5蛋白質工程在基因工程的基礎上，結合蛋白質結晶學，計算機輔助設計和蛋白質化學等多學科的基礎知識，對蛋白質進行修飾，改造和拼接以生產出能滿足人類需要的新型蛋白質的技術。5、組織工程：由美國國家科學基金委員會于1987年正式提出和確定的，是應用細胞生物學、生物材料和工程學的原理，研究開發用于修復或改善人體病損組織或器官的結構、功能的生物活性替代物的一門科學。1970康奈爾大學 化學工程學士1974麻省理工學院化學工程博士 “Enzymatic regeneration of ATP ”19741977 哈佛醫學院博士后癌癥研究1977麻省理工學院教授研

9、究領域：生物技術、藥學、化學、醫學Langer的成就發表論文1050篇-藥物控釋;申請專利750篇; 獲得170多項獎勵其中包括2006年美國國家科學獎, Charles Stark Draper Prize ,相當于工程界的Nobel Prize; 2008 Millennium, 世界上最大的技術應用獎。Lab Members MIT (2005) 存在問題在組織缺損修復治療中，對器官組織移植有巨大需求。但在器官移植技術中，仍存在許多困難和問題，如自體組織器官移植，由于組織供區有限而存在較大局限性。嚴重的器官和組織短缺，使外源性器官移植難以實現。外源性器官移植還存在著不能克服的短期和長期免

10、疫排斥問題。曾經的麥蒂征戰多年傷痕累累按照現有醫療水平恢復的麥蒂組織工程臨床應用后麥蒂王者歸來！生物工程重點研究的內容：新型生物反應器研究開發，特別是針對重組DNA技術、細胞融合技術所獲得的新產品的投產；新型分離方法及設備的開發；各種描述生物反應過程的數學模型的建立，將有利于過程的控制和優化以及計算機的運用；生產過程控制手段的改造，重點要解決的是各種能反映反應過程變化特性參數的傳感器的研制和計算機控制系統的完善。（二）生物工程的發展歷程 生物工程是個古老而又年輕的科學，它的歷史幾乎與人類文明的發展史一樣源遠流長，可以追溯到幾千年以前。第一代生物工程：古代以非純種微生物發酵工藝為標志 8000年

11、前蘇米爾人已掌握制作啤酒技術； 6000年前埃及人已能制作面包； 5000年前我國已掌握了釀酒技術。第二代生物工程：近代以純種微生物發酵工藝為標志 從1857年Pasteur L 發現發酵過程是微生物作用的結果，開始利用純種微生物發酵工業大規模生產抗生素、氨基酸、有機酸、酶制劑、核酸及單細胞蛋白等產品。 19世紀大規模生產乳酸、酒精、面包酵母、檸檬 酸和蛋白酶等初級代謝產物； 20世紀40年代，以獲取微生物的次級代謝產物 抗生素工業成為生物工程的支柱產業； 20世紀50年代后，隨著微生物代謝調控機制的闡 明，開始發展氨基酸、核苷酸、酶制劑等發酵工業。生物工程的發展歷程第三代生物工程：以1973

12、年建立的重組DNA技術基因 工程為標志 1973年后，細胞融合及單克隆抗體技術相繼成功，并實現了動植物細胞的大規模培養技術，同時固定化生物催化劑也得到了廣泛應用、 新型生物反應器不斷涌現，且形成了相應的產業，使生物工程迅速完成了從傳統生物技術向現代生物技術的飛躍轉變，成為真正意義上的生物工程，代表著21世紀的發展方向。 生物工程的發展歷程（三）生物工程的應用1、發酵工程：由微生物發酵大量生產各種氨基酸、抗生素、酶、核酸、有機酸、醇類制品，提供了大量藥物、食品、飼料添加劑及化工原料。 如，在制藥工業，篩選了低毒氨基酸糖苷抗生素、抗腫瘤抗生素等；在農業，研制了一大批新型無公害、高效、專一性強的殺蟲

13、劑、除莠劑、植物生長調節劑等微生物新藥。2、酶工程： 發現和制備了更豐富的生物酶；對酶催化反應的機理、工藝和應用研究達到新水平；固定化酶技術的發展使酶工程效率更高、成本更低、產品更豐富；裝有固相化酶或菌體的化學傳感器已被用來監測生成抗生素、維生素、氨基酸及生物需氧量等。生物工程的應用生物工程的應用3、基因工程：轉基因植物：抗病蟲害的轉基因作物如棉花、水稻、玉米和馬鈴薯以及抗除草劑的高粱、小麥、大豆和玉米等已形成產業規模 ；富含高色氨酸、高蛋白的轉基因玉米、含高不飽和脂肪酸的轉基因油類等高營養和特殊功能的食品已培育成功。但很多轉基因植物富含爭議。轉基因動物：將人體基因注入動物中，獲得的子代動物具

14、有人體蛋白，可從中提取人體需要的藥物蛋白；“乳腺制藥廠”；轉基因豬、魚生長加快，增加產量，轉基因羊增加產毛量。轉基因藥品：疫苗、單克隆抗體、胰島素、細胞因子等生物工程的應用4、細胞工程： 避免直接從動、植物整體提取產物所受到的資源限制及環境條件的影響，為某些珍稀植物的快速繁殖、植物的復壯等提供可行的辦法。 通過不同植物或動物細胞之間的融合，可獲得雜種細胞，培育出新的動植物雜交種。如，在美國，采用胚胎移植技術實現奶牛良種化，比傳統的雜交改良方法至少節省10年時間，已建立起高產奶牛的繁育體系和生產體系。 現代生物工程技術已在農業、醫藥、輕工業、食品、環保、海洋和能源等許多領域得到廣泛的應用。生物工

15、程的應用生物工程的發展趨勢： 新技術交織應用，育種跨越生物“界”的鴻溝。 基因工程藥物、疫苗研究與開發突飛猛進。 轉基因植物與動物取得重大突破。 闡明生物體基因組及其編碼蛋白質的結構與功能發展迅速，如人、擬南芥、斑馬魚等全基因組測序已經完成。 基因治療取得重大進展，可能革新整個疾病的預防和治療領域。 分子生物學、（蛋白質）結構生物學、計算機技術等學科結合緊密，生物信息學發展迅速。生物工程的應用二、細胞工程簡介 細胞工程的研究內容、 主要技術及其應用 細胞工程與基因工程的關系 細胞工程的主要成就 細胞工程的生物學基礎（一）細胞工程的研究內容、 主要技術及其應用 細胞工程是在細胞水平上研究、開發、

16、利用各類細胞的工程。 細胞水平上的生命活動，是連接著分子水平上的各種生物大分子和個體水平上的各種器官系統的綜合生命活動。 圍繞著生命活動這個中心，分子水平上研究的是DNA的復制與轉錄、RNA的翻譯、蛋白質執行各種生命活動；細胞水平的是細胞增殖、分化、死亡；而個體水平上則是遺傳和發育。 研究內容： 細胞工程的發展建立在細胞融合的基礎上，人們可以根據需要，經過科學設計，在細胞水平上改造生物的遺傳物質。細胞工程的研究內容、 主要技術及其應用主要技術方法？細胞培養：是將生物體內的某一組織分散成單個細胞，接種在人工配制的培養基上，然后在適當的條件下（如一定的光照、溫度和pH值等）進行培養技術。由于單個細

17、胞的培養難度大一些，目前多采用組織培養技術。如通過植物器官（根尖、莖尖、花藥等）的離體培養，生成新植株（試管苗）。從而快速、大量繁殖一些有價值的植物。細胞融合：指在外力（誘導劑或促融劑）作用下，兩個或兩個以上的異源（種、屬間）細胞或原生質體相互接觸，從而發生膜融合、胞質融合和核融合并形成雜種細胞的現象，也稱為細胞雜交；如取材為體細胞則稱為體細胞雜交。細胞凝集膜粘連，融合成多核細胞核融合成單核的雜種細胞滅活的仙臺病毒、硫酸二乙酯等促融劑融合細胞拆合：將完整細胞的細胞核和細胞質用特殊的方法分離開來，如把細胞核從細胞質中吸取出來，或用紫外線等-，然后再把分離的不同細胞的細胞核和胞質重新組合起來，培育

18、成新的細胞或新的生物體。細胞重組：將細胞融合技術與細胞拆合技術結合，在融合介質誘導下，使胞質體（去核的細胞結構）與完整細胞合并，重新構成胞質雜種細胞的過程。細胞重組的方式： 胞質體與完整細胞重組形成胞質雜種； 微細胞（只含有少數染色體與薄層細胞質、細胞膜的結構）與完整細胞重組形成微細胞異核體； 胞質體與核體重新組合形成重組細胞。向細胞內引入高分子物質：把蛋白質、核酸等有生物活性的高分子物質或細胞器，應用磷酸鈣、脂質體、紅細胞血影、仙臺病毒及直接的顯微注射等方法引入細胞內，觀察該類物質進入細胞后所發生的變化及起的作用等。 不涉及應用DNA體外重組技術構建質粒來轉移基因，不屬于基因工程。細胞工程的

19、興起： 在植物學界，早在1902年德國的植物學家哈泊蘭德就 預言植物細胞的全能性，之后得到了一系列實驗的證實。 在動物學界，1907年美國哈里森采用蓋玻璃片懸滴培養 蛙胚神經組織，存活了數周并觀察到細胞的生長現象， 從而開創動物細胞培養的先河。 微生物繁殖快、世代時間短、單倍體期較長，在較短 時間內能生長出大量相對同源的種群，便于遺傳育種。 1964-1967年，植物細胞“全能性”學說證實后，經離體 組織、細胞或花藥、花粉培養獲得單倍體植株，使得 高等植物像微生物一樣在大發酵罐中生產各種植物的 代謝產物成為可能，如纖維素酶、果膠酶等酶制劑的 大量生產。 20世紀60年代初，Cocking 等用

20、酶溶解植物細胞壁， 制備了大量有活力的原生質體，為原生質體實驗系統 奠定了基礎。 1958年，岡田善雄發現紫外線滅活的仙臺病毒可引起 艾氏腹水瘤細胞彼此融合；1965年，Harris & Warkins 成功地將人細胞和鼠細胞融合在一起，證實動物界中 細胞融合沒有種和屬的界限。 20世界70年代，科學家嘗試用各種化學誘變劑誘導原生 質體融合，自1974年發現用聚乙二醇（PEG）和Ca 2+ 能顯著提高植物原生質體的融合效率，PEG現已擴展應 用到動物、真菌、酵母及細菌、放線菌、霉菌等多種微 生物種間、屬間原生質體融合技術中。 20世紀70年代初，誕生了細胞拆合工程，去核細胞和核 移植實驗長期依

21、賴于顯微外科手術進行。1967年，Carter 發現細胞松弛素B （CB）能誘發體外培養的小鼠L 細胞 的排核作用；1972年，Prescott 首次應用離心技術結合 CB 成功分離哺乳類細胞的胞質體，為研究細胞核、質 關系及細胞質基因的轉移開創了新途徑。 20世界80年代，細胞重組工程得到了發展。1982年， Perenczy 首先在真菌中使核與原生質體融合成重組細胞 取得成功，成為育種的一種新途徑， 最近20年，細胞工程技術與基因工程技術緊密結合起來， 使動物胚胎移植技術進入實用化階段；培育出抗病毒、 抗除草劑、抗蟲害、高蛋白的各種農作物品種，培養出 攜帶人的生長激素基因的豬和魚，得到了轉

22、基因鼠、兔、 綿羊、豬、牛等，并從這些動物的血液、乳汁中得到有 醫用價值的蛋白質和各種細胞因子等。 最具代表性的游戲是美國耶魯大學教授克萊白特L馬格特和羅伯特M彼德斯的杰作。 他們在黑毛鼠、白毛鼠、黃毛鼠的受精卵分裂成8個細胞時用特制的吸管把8細胞胚吸出輸卵管，然后用一種酶將包裹在各個胚胎上的粘液溶解，再把這三種鼠的8細胞胚放在同 一溶液中使之組裝成一個具有24個細胞的“組裝胚”。馬格特和彼德斯把“組裝胚”移 植到一只老鼠的子宮內。不久，一只奇怪的組裝鼠問世了，這只組裝鼠全身披著黃、白、 黑三種不同顏色的皮毛。 英國和美國還“組裝”了綿羊和山羊的嵌合體綿山羊。 1978年英國采用胚胎工程技術成

23、功培育出世界首例試管嬰兒 試管嬰兒是“體外受精和胚胎移植”的簡稱。它通過手術將女性的成熟卵子取出，然后與精子于試管中受精，在培養4天后，再把這個受精卵移植到女子的子宮里安胎，發育為胎兒。試管嬰兒是由英國醫生帕特里克斯特普托發明的，主要用來治療有排卵功能而輸卵管堵塞引起的女性不育癥。 世界上第一個試管嬰兒路易斯布朗（女）于1978年7月25日誕生在英國的曼徹斯特。目前全世界已有幾千名試管嬰兒誕生，我國第一個試管嬰兒于1988年3月10日誕生。克隆即無性繁殖系，是指從一個共同的祖先，通過無性繁殖的方法產生出來的一群遺傳特性相同的分子、細胞或個體。克隆動物一般是指通過無性繁殖形成動物后代。 克隆動物

24、：動物細胞的全能性：低等動物的魚、兩棲類等，從2細胞到囊胚期的細胞都具有全能性，高等動物從胚胎2細胞到64細胞以及內細胞團的胚胎細胞也具有發育的全能性 細胞工程的研究內容、 主要技術及其應用 1997年 “多莉羊” 多莉羊是由多塞特母綿羊成體提供乳腺細胞的細胞核，由黑面母綿羊排出未受精的卵細胞，并摘去細胞核，在電脈沖作用下進行二者細胞融合，由此形成的胚胎細胞植入到另一只黑面母綿羊子宮中發育，最后產下多莉羊。 它存活了8年，表形特征同核供體多塞特母綿羊完全一樣，并能夠繁殖，可能具有早衰現象。 多莉羊克隆成功，表明動物體細胞克隆獲得成功，將為醫學界帶來巨大機遇，同時，也在倫理界引來道德的譴責聲。

25、2001年英國克隆豬： 總部設在蘇格蘭的英國PPL醫療公司稱，已經克隆出了5頭幼豬，它們身上沒有人體會排斥的基因，從而解決了豬器官移植時常常出現的排異現象。 2005年10月意大利媒體報道，幾周前14只克隆小豬仔降生于意大利著名的克雷莫納繁殖技術研究中心，目前的健康狀態良好。為動物-人類的異種器官移植的早日實現帶來了更大的希望。細胞工程的研究內容、 主要技術及其應用細胞工程的主要技術及其應用： 細胞融合技術、細胞拆合技術、胚胎移植技術和細胞組織培養技術（二）細胞工程與基因工程的關系 細胞工程與基因工程相互滲透（三）細胞工程的主要成就 細胞工程所要求的技術條件、實驗設備及試劑、經費等均比基因工程

26、要求的低一些。利用細胞工程技術，可以大量培養細胞組織乃至完整個體。 1、植物細胞工程方面 植物細胞培養：理論基礎為植物細胞全能性（2）無病毒植物的培育（3）提取原料（4）人工種子（5）轉基因植物的培育（1）試管苗的快速繁殖：如從一個嫩枝莖尖可育出10萬株蘋果苗，僅需1年零4個月便可開花結果。離體的植物器官、組織或細胞愈傷組織根、芽植物體外植體脫分化植物激素：細胞分裂素、生長素再分化植物組織培養：植物組織培養條件： 含有全部營養成分的培養基、一定的溫度、空氣、無菌環境、適合的PH、適時光照等。區分幾個概念： 分化：在個體發育中，相同細胞的后代在形態、結構和生理功能上發生差異的過程，具有普遍性、持

27、久性、穩定性和不可逆性。分化的結果是形成不同的組織器官，幫助個體完成正常的生長發育。 脫分化（去分化）：由高度分化的植物器官、組織或細胞產生愈傷組織的過程。脫分化有利于細胞全能性的表達。動物細胞的卵細胞有幫助動物細胞核脫分化的作用。 再分化：愈傷組織經過培養，又重新分化成根或芽等器官的過程。由于愈傷組織是由已經分化的植物器官、組織或細胞脫分化產生的，所以把這次分化叫再分化。 植物體細胞雜交： 運用遠緣雜交與染色體工程技術培育成具優良性狀的 新品種，如“小偃六號”小麥新品種具抗病、抗旱、抗 干熱風等特性，目前已推廣到全國。不足：在糧食作物、經濟作物上開展較少。打破了不同種生物間的生殖隔離限制，大

28、大擴展了可用于雜交的親本組合范圍。植物體細胞雜交的過程：植物A細胞植物B細胞去壁原生質體A原生質體B原生質體融合融合體再生壁雜種細胞細胞分裂愈傷組織雜種植株去壁的常用方法：酶解法（纖維素酶、果膠酶等） 原生質體融合方法：物理法：離心、振動、電刺激等 化學法：聚乙二醇（PEG） 植物體細胞雜交和多倍體育種： 植物體細胞雜交 多倍體育種 相同點都采用一定的方法，通過改變細胞或植株染色體數目來改變生物性狀，獲得新品種染色體 方法原理 不同點原生質體融合和 組織培養染色體數目變異獲得雜種植株秋水仙素加倍，同種不一定加倍，不同種植物體細胞雜交與雜交育種：相同點不同點植物體細胞雜交雜交育種原理雜交性質染色體變化親本來源育種年限基因重組原生質體融合和 組織培養有性雜交無性雜交與親代相同與親代不同不一定同種，種間雜種同種，種內雜種1-2年4-5年通過改變細胞內遺傳物質，達到改變植物體性狀的目的，培育出符合人們要求的新品種細胞工程的主要成就2、動物細胞工程方面 最突出成就就是胚胎移植，使牲畜快速實現良種化。 如從母牛的一個胚胎獲得多頭小牛，可將胚胎一分為