1、微生物檢驗十一弧菌科弧菌科一群菌體短小、彎曲成弧形或直桿狀的革蘭陰性細菌兼性厭氧，發酵葡萄糖，許多菌株生長需要2%3%氯化鈉大多數菌株氧化酶陽性具有一端單一鞭毛、運動迅速弧菌科細菌廣泛分布于自然界，以水中最為多見。其中有一些種對人類致病。弧菌科(Vibrionaceae)弧菌屬（Vibrio）氣單胞菌屬（Aeromonas）鄰單胞菌屬（Plesiomonas）發光桿菌屬（Photobacterium）發光桿菌屬主要存在于海水中，對人類不致病第一節 弧菌屬弧菌屬（Vibrio）共有36個種。其中有12個種與人類感染有關霍亂弧菌引起霍亂副溶血弧菌引起食物中毒弧菌屬與人類感染有關的弧菌屬細菌霍亂弧菌

2、O1群霍亂弧菌（V. cholerae O1 group）O139群霍亂弧菌(V. cholerae O139 group)非O1群霍亂弧菌（V. cholerae non-O1 group）副溶血性弧菌(V. parahaemolyticus)、霍利斯弧菌（V. hollisae）、擬態弧菌（V. minicus）、河弧菌（V. fluvialis）、創傷弧菌（V. vulnificus）、溶藻弧菌（V. alginolyticus）、少女弧菌（V. damsela）、麥氏弧菌（V. metschnikovii）、辛辛那提弧菌(V. cincinnatiensis)、弗尼斯弧菌（V. fur

3、nissii）、卡佳麗弧菌（V. carchariae）臨床意義主要引起人類腹瀉，也可導致腸道外感染如傷口感染、敗血癥等氧化酶均陽性除麥氏弧菌外能發酵葡萄糖，對弧菌抑制劑O/129敏感鈉離子能刺激其生長，有些菌種在無鹽條件下不能生長，稱為嗜鹽菌（halophilic bacteria）多數能在血平板或普通瓊脂平板上生長，在血平板上可呈現、或不溶血菌落。在腸道選擇性培養基上如含乳糖或肌醇的麥康凱平板，許多致病性弧菌可以生長，形成糖類不發酵的菌落一、霍亂弧菌（一）臨床意義霍亂弧菌（V. cholera）是烈性腸道傳染病霍亂的病原體目前有155個血清群其中O1群有古典（classical）和埃爾托(

4、El-Tor)兩種生物型在自然情況下，人類是霍亂弧菌的易感者自1817年以來，已發生七次世界性的霍亂大流行，均由霍亂弧菌的O1群引起前六次為霍亂弧菌的古典生物型第七次為埃爾托生物型自1992年10月起分離到新的血清群O139，現在世界各地均有流行或散發病例報告致病機制正常情況下，胃液中的胃酸可消滅食物中的霍亂弧菌但在胃酸降低時，或攝入大量的霍亂弧菌時，霍亂弧菌可以從胃進入腸道。進入腸道的霍亂弧菌通過鞭毛運動穿過腸粘膜表面的粘液層，通過菌毛定植于腸粘膜上皮細胞表面繁殖產生由染色體介導的對熱不穩定的霍亂毒素（cholera toxin, CT）而致病O1群和O139群的致病機制和過程是一樣的CT(

5、cholera toxin)結構基因是ctxAB操縱子由A和B兩個蛋白質亞單位組成A亞單位分子量為21 812Da，由240個氨基酸組成，在成熟過程中由蛋白水解酶切割成A1和A2兩部分，以二硫鍵相連A1為毒素活性單位，通過B亞單位結合細胞膜上GM1受體的通道或“內吞”進入細胞內，激活腺苷酸環化酶（cAMP酶），使細胞內cAMP大量增加。快速向細胞外分泌水和電解質，使腸腔內水、鈉潴留，導致嘔吐和腹瀉，機體陷于缺水和電解質、酸堿平衡紊亂狀態。B亞單位分子量為11 677Da，由103個氨基酸組成，為5個單體組成中空的寡聚體。與腸粘膜上皮細胞膜上的神經節苷脂GM1受體結合 其他致病物質El-Tor生

6、物型能產生不耐熱溶血素和血凝素不耐熱溶血素具有溶血活性、細胞毒、心臟毒和致死毒性El-Tor生物型的溶血特性可發生變異血凝素能凝集雞紅細胞能被D-甘露糖抑制（二）生物學特性 1.形態 新從患者標本中分離出的細菌革蘭染色陰性，弧形或逗點狀在患者“米泔水”樣便中，可呈頭尾相接的“魚群”樣排列菌體一端有鞭毛，懸滴觀察時呈“穿梭”樣運動有普通菌毛和性菌毛O139群有莢膜2. 抗原成分不耐熱的H抗原為共同抗原耐熱的O抗原具有群特異性和型特異性，是霍亂弧菌分群和分型的基礎分型根據O抗原的不同，現有155個血清群O1群、O139群引起霍亂O139血清群的抗原編碼基因中出現了36kb的新基因缺少了O1群高分子

7、量的O抗原側鏈與O1群抗血清無交叉反應，但可與O22血清群和O155血清群產生交叉反應，遺傳學特征和毒力基因與O1群相似。O2群O138群血清群可引起人類的胃腸炎，不引起霍亂流行，稱之為非O1群霍亂弧菌。以往也稱不凝集弧菌或非霍亂弧菌O1群霍亂弧菌的O抗原由A、B、C三種抗原因子組成通過不同組合可形成三個型別由AB組成小川型(Ogawa)AC組成稻葉型(Inaba)ABC組成彥島型(Hikojima)彥島型的抗原性不穩定，各型之間可以相互轉換。以小川型和稻葉型為常見流行型別3. 培養特性營養要求不高，在普通瓊脂上生長良好兼性厭氧。1644均可生長，以37為適宜具耐堿性，在pH6.810.2范圍

8、均可生長在pH8.29.0的堿性胨水或堿性平板上生長迅速，其他雜菌被抑制生長在pH8.5的堿性胨水中經3546h增菌后可在液體表面大量繁殖形成菌膜常用的選擇性培養基硫代硫酸鹽-枸櫞酸鹽-膽鹽-蔗糖 (Thiosufale-citrate-salts-sucrose, TCBS)瓊脂平板霍亂弧菌發酵蔗糖產酸，菌落呈黃色含亞碲酸鉀的選擇平板有4號瓊脂、慶大霉素瓊脂生長并將培養基中的碲離子還原成元素碲,形成灰褐色菌落中心能在無鹽培養基上生長在血瓊脂平板上菌落較大, El-Tor生物型可形成溶血環在含明膠的培養基上O139群霍亂弧菌可形成不透明的淺灰色菌落，周圍有一圈不透明帶，此菌落涂片觀察可發現莢膜

9、4生化反應 氧化酶陽性發酵蔗糖，動力陽性賴氨酸、鳥氨酸脫羧酶陽性，精氨酸雙水解酶陰性可以在無鹽培養基上生長在含有高于6%氯化鈉的培養基上不能生長特 征 古典生物型 El-Tor生物型 羊紅細胞溶血 D 雞紅細胞凝集 +V-P 試驗 +多粘菌素B敏感試驗 + 組噬菌體裂解 +組噬菌體裂解 +抵抗力可在河水、井水及海水中存活20天左右對熱、干燥和光敏感；10012min即死亡怕酸耐堿，在正常胃酸中僅能生存4min對常用消毒劑敏感，0.5ppm氯15min能殺死對慶大霉素耐藥（三）微生物檢驗1檢驗程序2.標本采集和運送 霍亂是烈性傳染病，凡在流行季節和地區有腹瀉癥狀的患者均應快速準確作出病原學診斷在

10、發病早期，盡量在使用抗菌藥物之前采集標本取患者“米泔水”樣便，亦可采取嘔吐物或尸體腸內容物，或采取肛門拭子標本應避免接觸消毒液采取的標本最好就地接種堿性胨水增菌不能及時接種者可用棉簽挑取標本或將肛門拭子直接插入卡布運送培養基中送檢標本裝在密封，不易破碎的容器中，置室溫由專人輸送甘油鹽水保存液不適合于弧菌的運送3.標本直接檢查涂片染色鏡檢取標本直接涂片，固定染色。油鏡觀察有無“魚群”樣排列的革蘭陰性弧菌動力和制動試驗直接取“米泔水”樣便，制成懸滴(或壓滴)標本后，在暗視野或相差顯微鏡下直接觀察呈穿梭樣運動的細菌。同法重新制備另一標本涂片，在懸液中加入1滴不含防腐劑的霍亂多價診斷血清(效價1：64

11、)。可見最初呈穿梭狀運動的細菌停止運動并發生凝集，則為制動試驗陽性。可推定為霍亂弧菌存在快速診斷通過直接熒光抗體染色和抗O1群抗原的單克隆抗體凝集試驗，能夠快速診斷霍亂弧菌感染霍亂毒素的測定用改良的ELISA法，將純化的GM1包被，以俘獲標本中的CT。或采用乳膠凝集測定CT，有較高的靈敏度和特異性4.分離、培養與鑒定將標本直接接種于堿性胨水，或將運送培養基的表層接種于堿性胨水中3568 h后，轉種TCBS瓊脂平板、4號瓊脂平板或慶大霉素瓊脂平板，351218h觀察菌落形態在TCBS上形成黃色，4號瓊脂或慶大霉素瓊脂平板上呈灰褐色中心的菌落，均為可疑菌落用O1群和O139群霍亂弧菌多價和單價抗血

12、清進行凝集結合菌落特征和菌體形態，作出初步報告鑒定將血清凝集確定的菌落進一步純培養，依據全面生化反應，血清學分群及分型進行最后鑒定符合霍亂弧菌的菌株尚需區分古典生物型和El-Tor生物型對病原性弧菌的主要鑒定試驗為賴氨酸脫羧酶、鳥氨酸脫羧酶和精氨酸雙水解酶霍亂弧菌和擬態弧菌可在無鹽普通肉湯和普通瓊脂平板上生長，而其他弧菌則不能 用于霍亂弧菌的鑒別試驗霍亂紅試驗霍亂弧菌有色氨酸酶和硝酸鹽還原能力。霍亂弧菌和其他弧菌均有此種反應粘絲試驗（String Test）弧菌屬細菌除副溶血性弧菌部分菌株外，均有此反應O/129敏感試驗 O/129（2，4Diamino6，7Diisopropylpterid

13、ine，2，4二氨基6，7二異丙基喋啶）10g及150g紙片周圍出現任何大小的抑菌環均為敏感。O1群和非O1群霍亂弧菌均敏感。但已有對O/129耐藥的菌株出現。用此試驗作鑒定時，需特別謹慎。需結合其他試驗結果如耐鹽生長試驗等綜合考慮5.抗體檢測可用于霍亂的回顧性診斷和培養不能確定的霍亂病例的輔助診斷在感染發生后的10天內，特異性的殺菌抗體和抗毒素抗體升高二、副溶血性弧菌Vibrio parahaemolyticus（一）臨床意義具有嗜鹽性（halophilic）存在于近海的海水、海底的沉淀物、魚蝦類和貝殼及鹽漬加工的海產品中主要引起食物中毒和急性腹瀉是我國沿海地區及海島食物中毒的最常見病原菌胃

14、腸炎臨床表現有：惡心、嘔吐、腹痛、低熱、寒戰等。腹瀉呈水樣便，偶爾血性，恢復較快，病程23天，通常為自限性還可引起傷口感染和菌血癥致病物質通過菌毛的粘附毒素耐熱直接溶血素（Thermostable direct hemolysin, TDH）分子量為21 000，有2個亞單位組成，能耐受10010min不被破壞溶血毒性，TDH對人和兔紅細胞的溶血性較高，對馬紅細胞不溶血細胞毒性，對多種培養細胞如Hela細胞、FL細胞、L細胞及鼠心肌細胞有細胞毒性心臟毒性，可導致心電圖異常表現如ST-T改變、房室傳導阻滯、室顫或心跳驟停及心肌損傷腸毒性，使腸粘膜的毛細血管通透性增高，向腸腔分泌亢進其結構基因td

15、h也存在于其他致病性弧菌當中耐熱直接溶血素相關溶血素（Thermostable direct hemolysin related hemolysin, TRH），生物學特性與TDH相似（二）生物學特性1. 形態革蘭陰性桿菌，有鞭毛（極單毛），無莢膜，無芽胞2. 抗原結構 耐熱的菌體（O）抗原，具有群特征性，副溶血性弧菌的O抗原有13種鞭毛抗原，不耐熱，無型特異性3培養特性 營養要求不高在無鹽培養基上不能生長，最適合生長的氯化鈉濃度為3.5%，超過8%不能生長最適pH為7.78.0，但pH9.5時仍能生長，最適生長溫度為3037在堿性胨水中經69h增菌可形成菌膜培養特性TCBS瓊脂平板: 0.5

16、2.0mm大小，蔗糖不發酵而呈藍綠色菌落普通血平板: 不溶血或只產生溶血從腹瀉患者中分離到的菌株95%以上在我妻（wagatsuma）瓊脂上產生溶血現象，稱為神奈川現象（Kanagawa phenomenon, KP）嗜鹽性選擇平板: 較大，圓形，隆起，稍渾濁，半透明或不透 明，無粘性SS平板: 扁平，無色半透明，蠟滴狀菌落，有辛辣味，不易 刮下，48h后牢固粘著培養基上，部分菌株不能生長麥康凱平板: 部分菌株不生長伊紅美蘭瓊脂和中國蘭瓊脂培養基不能用于本菌的初次分離抵抗力抵抗力弱不耐熱，90 1min即被殺死淡水中不超過2日，但海水中能存活47天以上耐堿怕酸，1%醋酸或50%食醋中1min死

17、亡 （三）微生物檢驗1. 檢驗程序 微生物檢驗 2. 標本采集: 可采集患者的糞便，肛門拭子和可疑食物。應及時接種，或置堿性胨水或卡-布運送培養基中送檢3.分離培養與鑒定 (1)增菌培養標本接種1%NaCl堿性胨水或4%NaCl蛋白胨水 中進行選擇性增菌 (2)分離培養標本直接接種或增菌后接種TCBS平板或嗜鹽菌 選擇平板TCBS平板：綠色或藍綠色菌落，不透明，直徑 12mm微突起菌落嗜鹽菌選擇性平板：較大、圓形、隆起，稍混 濁、半透明或不透明、無粘性菌落（3）鑒定氧化酶陽性，O/129（150g）敏感發酵葡萄糖、麥芽糖、甘露醇產酸，不發酵蔗糖、乳糖。吲哚試驗陽性大部分菌株脲酶陰性，V-P陰性

18、NaCl生長試驗在不含NaCl和含10%的蛋白胨水中不生長，在3%和7%NaCl 蛋白胨水中生長賴氨酸脫羧酶、鳥氨酸脫羧酶陽性，精氨酸雙水解酶陰性神奈川現象陽性毒素測定用免疫學方法測定TDH和TRH。用基因探針和PCR方法直接測定毒素基因tdh或trh三、其他弧菌 除霍亂弧菌和副溶血弧菌外，以下弧菌也對人類致病。1.擬態弧菌（V.minicus） 過去認為是蔗糖不發酵的霍亂弧菌與非O1群霍亂弧菌相似與幾種非O1群霍亂弧菌O抗原有交叉反應常引起胃腸炎，偶爾可見傷口感染或菌血癥少數菌株可產生CT、TDH等毒素。但不引起暴發流行2.創傷弧菌（V.vulnificus）1976年首次被認識。在致病性弧

19、菌中，該菌引起的疾病最為嚴重，引起的菌血癥和傷口感染的病程進展非常快而致命。發酵水楊酸和ONPG陽性感染通常發生在氣溫較高季節，通過生食牡蠣等海產品，侵入腸粘膜淋巴結和門靜脈，侵入血流導致菌血癥，死亡率50%青年人好發，特別是酒精性肝功能損傷或免疫缺陷人，與轉鐵蛋白有關引起創口感染，導致蜂窩織炎，偶爾可侵入血流導致菌血癥而死亡。致病機理尚不明確，但產生的膠原酶、蛋白酶和細胞毒素可造成組織嚴重損害3.溶藻弧菌（V.alginolyticus）最常見于外耳、中耳感染患者，也常見 于傷口感染是弧菌屬細菌中耐鹽性最強的致病菌4.河弧菌（V.fluvialis） 最早從腹瀉患者中分離到，全世界均有引起腹

20、瀉的報道1981年被命名，之前被歸類為F群霍亂弧菌 或CDC EF6群5.弗尼斯弧菌（V.furnissii）該菌很少從糞便中分離到，致病性？最近報告從腹瀉患者中分離到，提示有一定臨床意義6.霍利斯弧菌（V.hollisae） 可引起腹瀉、創口感染及菌血癥通過食用海產品和接觸海水而感染通常所有的霍利斯弧菌均攜帶TDH基因7.其他弧菌麥氏弧菌（V.metschnikovii）氧化酶陰性，引起個別患者菌血癥和霍亂樣腸炎可從海產品、鳥類、河水以及污水中分離到只需微量的鈉鹽即可生長辛辛那提弧菌（V.cincinnatinesis）有引起菌血癥和腦膜炎的報告卡佳麗弧菌（V.carchariae）有引起傷

21、口感染的報告臨床意義臨床標本中分離的病原性弧菌都應認為有臨床意義特別是從糞便標本中分離到霍亂弧菌O1群、O139群和副溶血性弧菌從任何臨床標本分離到創傷弧菌，均應通知臨床醫師，并根據我國傳染病防治法有關規定及時作傳染病報告，并將報告和菌種一起報送到各級法定部門。返回氣單胞菌屬和鄰單胞菌屬氧化酶陽性，端鞭毛、革蘭陰性桿菌、兼性厭氧根據表型特征，伯杰系統細菌學手冊（第一版）將 其歸為弧菌科。根據基因特征，MacDonell和Colwell建議設立氣單胞菌科，而鄰單胞菌與腸桿菌科中的變形桿菌屬有 更密切的關系。一、氣單胞菌屬（一）分類與命名氣單胞菌屬原有四個種：親水氣單胞菌（A.hydropila）

22、豚鼠氣單胞菌（A.caviac）溫和氣單胞菌（A.sobria）殺鮭氣單胞菌（A.salnonicida）殺鮭亞種（A.salnonicida subsp.salnomicida）不產色亞種（A.salnonicida subsp.achroniogenes）殺日本鮭亞種（A.salnomicida subsp.masoucida）分類與命名根據DNA雜交結果分14個基因種或DNA雜交群(DNA hybridiyation groups, HGs)，有幾個新種名被提出，但很多DNA雜交群尚未命名殺鮭氣單胞菌為嗜冷菌，存在于海水中引起魚類等感染，不引起人類感染。臨床意義引起腸道內感染常見5歲以下

23、兒童和成人，夏季腹瀉的第二、三位病原菌臨床癥狀從溫和腹瀉到嚴重痢疾樣腹瀉，成人呈慢性化主要致病物質為溶血毒素和細胞毒素等腸道外感染主要皮膚和軟組織感染，主要由親水氣單胞菌和維隆氣單 胞菌引起90%以上菌血癥由親水氣單胞菌和維隆氣單胞菌引起，通 常發生在免疫低下人群引起眼部感染、腦膜炎、肺炎、胸膜炎、骨髓炎、關節炎、腹膜炎、膽囊炎、下腔性靜脈炎和尿道感染生物學特征形態革蘭陰性直桿菌，有時呈球桿狀；除殺鮭氣單胞菌外均有動力培養特性 營養要求不高，普通培養基上可生長TCBS培養基不生長，在045范圍內均可生長根據生長溫度不同可分為嗜冷菌群(psychrophilic group) 35以下生長，37不生長嗜中溫菌群（mesophilic group）1042之間生長生化特性 氧化酶和觸酶陽性，發酵葡萄糖和其他碳水