1、ICS65.150DB22CCSB25吉林省地方標準DB22/TXXXX2021淡水魚腸道細菌的分離與純化Isolationandpurificationofintestinalbacteriafromfreshwaterfish點擊此處添加與國際標準一致性程度的標識（征求意見稿）（本稿完成日期：2020-06-08）2021-XX-XX發布2021-XX-XX實施吉林省市場監督管理廳發布DB22/Txxxx2019 I本文件按照GB/T1.1-2020標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規則給出的規則起草。本文件由吉林省農業農村廳提出并歸口。本文件起草主要單位：吉林農業大學。本文件

2、主要起草人：張東鳴、陳玉珂、王秋舉、郭志欣、藺麗麗、劉洪建、趙云龍、吳振超。DB22/Txxxx2019 淡水魚腸道細菌分離與純化技術規范范圍本文件規定了淡水魚腸道細菌分離與純化的原理、器械設備、準備工作、檢測程序、檢測方法、檢驗純度、保種和試驗報告等操作方法。本文件適用于淡水魚腸道細菌的分離與純化。規范性引用文件下列文件中的內容通過文中的規范性引用而構成文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件。不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB4789.28食品安全國家標準食品微生物學檢驗培養基和試劑的質量要求SN/T2632-2010微生

3、物菌種常規保藏技術規程術語和定義下列術語和定義適用于本文件。淡水魚freshwaterfish終生或部分階段生活在鹽度低于0.05%淡水中的魚類。腸道細菌intestinalbacteria分布且穩定存在于魚類腸道中的細菌，這些細菌依靠腸道生活，并且能夠幫助宿主完成多種生理生化功能。原理試樣經過處理，稀釋至適當濃度，接種在LB固體培養基上，在28C37C培養24小時后,即可分理處單個菌落;再挑取單個菌落接種在LB液體培養基中，在28C37C,培養16小時18小時后，即可獲得純化的菌種。器械設備常用儀器超凈工作臺、顯微鏡（10倍x100倍）、解剖鏡、離心機（RCF10000 xg30000 xg

4、）、高壓蒸汽滅菌鍋（滅菌壓力03kg/cm2）、醫用冰箱（4C和-80C）、電子分析天平（相對精度1/1000）、生化培養箱（具備制冷功能）、pH計、勻漿器（）、恒溫振蕩器（往復式）、移液器（100微升和1000微升）、漩渦混勻器（圓周震動）。常用工具酒精燈、剪刀（金屬）、解剖刀（金屬）、小鑷子（直頭和彎頭）、普通鑷子（金屬）、金屬接種環、玻璃涂布棒、注射器（5毫升、10毫升和20毫升）、紗布、試管架和脫脂棉。常用器皿解剖盤、無菌培養皿（直徑90毫米）、玻璃試管（25毫升）、錐形瓶（500毫升和250毫升）、量筒（100毫升、500毫升、1000毫升）、凍存管（2毫升）和離心管（1.5毫升、5

5、毫升和10毫升）。試劑和培養基75%乙醇，0.7%生理鹽水，固體和液體培養基參照附錄A執行。除非另有說明，在操作中僅用確認為分析純的試劑和蒸餾水。準備工作B5.曰J岀主器具消毒將剪刀、鑷子、解剖刀、培養皿、玻璃試管和錐形瓶等工具采用高壓蒸汽滅菌鍋高壓121C）滅菌20分鐘。制備平板培養基滅菌將LB培養基置于錐形瓶中經高壓蒸汽滅菌（121C滅菌20分鐘）后放置于提前滅菌的無菌操作臺中，待培養基溫度不燙手且未凝固時開始倒制平板。倒制平板右手拿錐形瓶，靠近酒精燈火焰，左手拔出棉塞；右手使錐形瓶瓶口迅速通過火焰殺滅瓶口細菌（此步驟重復23次），左手將培養皿打開一條稍大于瓶口的縫隙，輕輕倒入約15毫升2

6、0毫升LB培養基，將培養基上蓋半掩放置。整個倒制平板過程均在無菌操作臺中進行。平板冷卻待培養皿中培養基溫度降至室溫（可以加大無菌操作臺風速，加快培養基凝固）后，蓋上蓋子，備用。腸道細菌懸液的制備魚體解剖選取鱗片完整，體表無傷、健康的淡水魚為取樣對象。用75%的酒精棉球對魚體體表消毒后，打開腹腔，再用75%酒精棉球擦拭腸管外壁，將整個腸道取出，備用。細菌懸液的制備用約2倍體積的無菌生理鹽水將腸道內容物沖入無菌離心管中，制成細菌懸液。檢測程序細菌的分離和純化步驟見圖1。圖1淡水魚腸道細菌分離與純化步驟檢測方法細菌的分離9.1.1稀釋在無菌條件下采用無菌的生理鹽水將細菌懸液稀釋成10-3、10-4和

7、10-5倍的稀釋菌液。9.1.2接種分別取各稀釋度的稀釋菌液0.1毫升，在酒精燈外焰附近采用滅菌的涂布棒將菌液均勻涂布在LB培養基上，至液體全部被培養基吸收（每個濃度的菌液做3個重復）。9.1.3培養在培養皿上蓋表面標注樣品名稱、日期和采樣地等信息。置于恒溫培養箱中倒置28C37C培養24小時。細菌的純化9.2.1純化的條件待恒溫培養箱中的培養基上均勻的長出單個菌落時便可以進行細菌的純化培養。涂板分離在無菌條件下，挑取同一培養皿中不同顏色和不同形態的單個菌落進行涂布平板分離。純培養采用無菌的接種環將挑取的單個菌落接種于裝有液體培養基試管中，在試管上標注樣品名稱、日期和采樣地等信息,然后將試管置

8、于恒溫振蕩器中28C37C，120轉/分鐘培養16小時18小時。檢驗細菌純度培養結束后按照7的方法再進行分離培養，若新平板中長出不同顏色或不同形態的菌落，則需繼續純化，直至平板上長出相同的菌落。保種參照SN/T2632-2010中附錄D規定的低溫冷凍保藏法執行。試驗報告試驗報告內容包括：樣品名稱、來源、取樣季節、日期、取樣部位、獲得菌種數量和備注。樣品來源應清晰描述取樣的地區和生存環境。取樣部位包括：全腸、前腸、中腸和后腸。獲得菌種數量應該是大于或等于1的整數。備注欄應詳細描述樣品的保存和健康特征。詳見表1示例。表1淡水魚腸道細菌分離與純化試驗報告方式例次樣品名稱樣品來源取樣季節日期取樣部位獲得菌種數量備注1建鯉梅河口，池塘夏季8月20日全腸5活體，健康，未發病2鳙魚松原，查干湖冬季12月17日前腸12凍體3洛氏鱥柳河，池塘秋季9月26日全腸16