1、Good is good, but better carries it.精益求精，善益求善。westernblot失敗經驗總結westernblot失敗經驗總結1我做了很久的WB，最大的一個難點感覺在于樣品制備上！蛋白的降解有些時候是你想象不到的，可能出奇的糟糕，也可能完全沒事如果單獨做WB的話，感覺以“快速徹底裂解，先變性后保存”的原則比較有效，盡量選擇足夠強的裂解液，甚至直接給loadingbuffer裂解，然后取出部分蛋白定量，其余加入loadingbuffer100度充分變性，再分裝保存。有些時候比蛋白酶抑制劑更有效。另一個感覺就是樣品中目的蛋白的量，限于WB的檢測下限問題，一般目的蛋

2、白量最好別低于1ng（雖然ECL法下限是0.1ng，即100pg），最好在10ng以上為好。這就要求在做WB之前必須充分考慮目的蛋白的可能豐度，最好充分的準備工作然后再設計細胞量或者組織量，千萬別把樣品搞稀了，否則就不好辦了。最后，還是多看文獻，在做某個蛋白之前最好看看別人是如何做的，有什么特殊要求，內參如何選等等。westernblot失敗經驗總結2我就跑膠和轉膜談一點兒自己的體會1、跑膠電泳Buffer重復利用的時候要注意，不能混濁，有時候能用個34次，有時候第二次都不行了，事先前預電泳一下，看看氣泡的均勻度；Buffer一定要淹過梳子孔，否則就會發現今天的蛋白不會跑；跑的時候先用低電壓跑

3、過濃縮膠，再換高電壓跑分離膠，不要追求速度，慢慢跑條帶會分離的更好，特別是對于高分子量的目的蛋白；2、轉膜我用的是濕轉，Buffer一定要預冷，最好提前一天配好放4度；濾紙不要大過PVDF膜，防止短路；膠在負極，膜靠近正極，放入Tank前檢查一遍會使你免以體會放反的痛心疾首；膜要標記好正反面；轉膜過程中，經常過去看看，防止意外，如電泳儀接觸不好。心得總蛋白提取（胞膜，胞漿，胞核）：組織勻漿后,15000g,4度,20分鐘后,取上清.Buffer:NP40750ul,脫氧膽酸鈉0.5克,SDS0.1克,加1*PBS至100ml.再加入PMSF(7.4mg/ml)0.1ml.(現用現加)7.4mg

4、/mlPMSP異丙醇溶液:取AmgPMSF加A/7.4ml異丙醇.工廠-20度儲存組織膜蛋白提取：所在操作冰上進行（1）取組織，用PBS沖洗干凈組織上的血液.加入10mlBufferA,用剪刀盡可能剪碎組織,于冰上充分勻漿。每次30秒,重復3-5次.（2）離心機1000rpm，4離心10min后，所得上清液轉入超速HYPERLINK/consumables/list.asp?sortid=7&typeid=88t_blank離心管。(去掉大塊組織及結締組織)（3）100000g，4離心1hr,棄去上清.(此為胞漿蛋白,若只提取胞漿蛋白,可用10000rpm,4度,30分鐘離心，取上清即可)。沉

5、淀用適量的BufferB重懸，4度過夜后，分裝至EP管，Eppendorf臺式離心機10000rpm，4離心30min。（4）收集所得上清液即為膜組份。BufferA：0.32M蔗糖，5mMTris-HCl（PH7.5），120mMKCl，1mMEDTA,1mMEGTA,0.2mMPMSF,1ug/mlLeupeptin,1ug/mlPepstatinA,1ug/mlAprotinin。冰上預冷。BufferB20mMHEPES（PH7.5），10%甘油，2%TritonX-100,1mMEDTA,1mMEGTA,0.2mM，PMSF,1ug/mlLeupeptin,1ug/mlPepstat

6、inA,1ug/mlAprotinin。冰上預冷。所得蛋白分裝EP管（每管約50ul），取一管測蛋白濃度，其它放入-70度深凍冰箱保存。如果要定量的話，最好能立即根據濃度，加入上樣緩沖，煮沸，4度保存。反復凍融蛋白會降解，濃度不準。考馬斯亮蘭測蛋白濃度：考馬斯亮蘭配方：G2500.4克,95%乙醇100ml,85%磷酸200ml,加水至2000ml,過濾后使用。BSA標準液：0.5mg/mlBSA,雙蒸水配制。配制標準液(濃度分別為0，10，20，30，40，50ug/ul)：1234536G2503ml3ml3ml3ml3ml3ml0.5mg/mlBSA20ul40ul60ul80ul100

7、ulddH2O100ul80ul60ul40ul20ul待測蛋白配液：每管3mlG250，2ul樣品，98ulddH2O。（若加入樣品后，液體沒有變藍色，則可再加2ul樣品，ddH2O減為96ul，標準液濃度可適當擴大。）紫外分光光度計，595nm，用1號管調零，制出標準曲線,標準方程及R值（R值應大于0.99,否則操作誤差較大）,測量待測蛋白OD值，算出蛋白濃度。（若加入2ul樣品，則濃度值需除2，方為真正濃度；若加4ul樣品，則除4）聚丙烯酰胺電泳：1自來水，洗滌劑清洗玻璃板，用ddH2O沖洗干凈，立放于盒子內，60度烤箱烘干備用。2配膠：凝膠儲備液（30%Acr/Bise）：丙烯酰胺29

8、克，雙體甲叉雙丙烯酰胺1克，加水至100ml。（有說要棕色瓶保存，3個月換新的，30%的丙烯酰胺如有沉淀，最好棄掉）10%APS：0.1克過硫酸銨，加ddH2O至1ml.(4度保存,一周內使用)，本人都是配新鮮的用。10%SDS:1克SDS,10mlddH2O.(不溶時,可加熱50度左右助溶.)TEMED:原液即可.0.5MTris-HCl(PH6.8)；1.5MTris-HCl(PH8.8):9.0855克Tris,加入ddH2O溶解后,用HCL調PH至8.8,加ddH2O到50ML配膠的濃度和方法書上都有，不詳細說了！本人做的是70KD和17KD的分子量，分別配了10%和12%的分離膠，4

9、%的濃縮膠。搖動溶液充分混合（不要過于劇烈以免引入過多地氧氣）灌入2/3的分離膠后（估計距梳子底1CM）應立即用ddH2O封膠。等到能看清水和膠的分界線，則可配濃縮膠。用面巾紙吸干水后，注入濃縮膠，至頂。插入梳子，不要有氣泡。藍色字體是從別人貼子上看到的這些小孔的孔徑隨“雙丙烯酰胺丙烯酰胺”比率的增加而變小，比率接近1：20時孔徑達到最小值。SDS聚丙烯酰胺凝膠大多按“雙丙烯酰胺丙烯酰胺”為1：29配制，試驗表明它能分離大小相差只有3%的蛋白質。分離膠及濃縮膠均可事先配好（除AP及TEMED外），過濾后作為儲存液避光存放于4，可至少存放1個月，臨用前取出室溫平衡（否則凝膠過程產生的熱量會使低溫

10、時溶解于儲存液中的氣體析出而導致氣泡，有條件者可真空抽吸3分鐘），加入10%AP（0.70.8:100,分離膠濃度越高AP濃度越低，15%的分離膠可用到0.5:100）及TEMED（分離膠用0.4:1000,15%的可用到0.3:1000，濃縮膠用0.8：1000）PAGE配膠的HYPERLINK/reagent/t_blank試劑和配方比例對電泳結果的質量當然有決定性的影響，這個配膠的比例，在分子HYPERLINK/Search.asp?Field=Title&ClassID=&keyword=克隆克隆上有詳細的論述。容易忽視的問題主要在于過硫酸銨（AP）一定要新鮮最好用小指管配AP（寫日期

11、）保存在-20度，超過2周的AP扔掉算了，或者已經反復打開使用多次的AP都別用。膠濃度10%時可用0.1%的SDS封，濃度10%時用水飽和的異丁醇或異戊醇，也可以用0.1%的SDS），封膠后切記，勿動。如用醇封膠需用大量清水及ddH2O沖洗干凈，然后加少量0.1%的SDS，目的是通過降低張力清除殘留水滴。等濃縮膠凝的時間，就可以配蛋白了。按照想要的濃度加入LOADINGBUFFER配制。本人按每孔總體積20ul,終濃度1*RSB，含50ug蛋白混合樣品，不足的體積用1*PBS補足。短暫離心后，沸水中煮5分鐘，放室溫，用時再短暫離心。例如.50ug/20ul，做2.5孔,即50ul，125ug1

12、234蛋白濃度1033ug/ul1391ug/ul1487ug/ul1903ug/ul所需體積12.1ul9ul8.4ul6.6ul5*RSB10ul10ul10ul10ul1*PBS27.9ul31ul31.6ul33.4ul5*RSB:1.89克Tris-HCL(PH6.8),5克SDS,0.125克溴酚藍,25ML甘油.(很粘稠)Beta-巰基乙醇用時現加,按25%比例.10*PBS:Nacl4.25克,Na2HPO4.12H2O15.4g,NaH2PO42H2O1.4g,調PH到7.2-7.4,加ddH2O到500ML約30分鐘左右,取下梳子,將膠板放入電泳槽內,加入1*電泳緩沖液,沖

13、洗加樣孔.微量進樣器逐個加樣,空泳道加入1*RSB.兩膠板之間的電泳液要滿.接好正負極,開始電泳,可先小電壓,約50V,大約跑過濃縮膠后再改為100V.觀察MARKER的情況,適時終止電泳.建議說目的帶要跑到分離膠的2/3處比較好,但本人一直都在上1/3處,結果也還可以.預染MARKER很重要,開始選了一個國產的,總是跑不好,后來換成NEB的,效果很好,而且也不貴,范圍也比較廣,把我要的7.,42.17全都包括在內.如果濃縮膠跑的好的話,幾個孔的蛋白會跑成一條直線.注意加樣時間要盡量短，以免樣品擴散，為避免邊緣效應，可在未加樣的孔中加入等量的樣品緩沖液未聚合的丙烯酰胺具有神經毒性,操作時應該戴

14、手套防護.梳子插入濃縮膠時,應確保沒有氣泡,可將梳子稍微傾斜插入以減少氣泡的產生,梳子拔出來時應該小心,不要破壞加樣孔,如有加樣孔上的凝膠歪斜可用枕頭插入加樣孔中糾正但要避免枕頭刺入膠內.10*電泳緩沖液:Tris7.58克,甘氨酸36克,SDS2.5克,ddH2O定容到250ML.不好溶,可用攪拌器.可重復使用,每次加一些新的進去.但本人每次都是配新的,也不麻煩.轉膜跑完電泳后,取出膠,可以一塊做考馬思亮藍R250染色約30分鐘,脫色液脫色,看看蛋白條帶跑的如何,上樣量如何.另一塊可用做轉膜.放入轉移緩沖液中搖30分鐘左右（有次著急只晃了10分鐘，結果也挺好的）。開始用的PVDF膜,0.45

15、um,用國產的MARKER后,總是染的不清楚,而且無論時間長短,最后一塊濾紙都會被染色.后來換了NEB后,PVDF也不容易上色(可能和PVDF的質量有關,我買的雖然也是MILLIPORE,但好像比較便宜20CM*10CM才50塊錢).麗春紅染色也很少能看清條帶,后來發現,染色后用甲醇洗,比較容易看出來,但是很難洗掉紅色，不知道有沒有影響。后來換成NC膜，0.22um，效果挺好的，MARKER易染上，麗春紅也易著色，還一洗就掉。能比較清楚的了解轉膜效果。不同轉膜儀和電源轉膜的條件不同，我用的是BIO-RAD的半干轉（電壓不過25V的那款），電源是BIO-RAD的PC200，70KD的我轉50分鐘

16、，20V，17KD的轉20V，30分鐘左右，條件不是很穩定，有時半路打開蓋子看看MARKER轉的情況，但膜和膠的位置一定不能竄。也有人說用恒流，說1.2-2MA/CM2我看了一下，我的膠大約都是5*3左右大的，20V一般電流會是60-30MA之間，要是這樣算的話,最高就30MA,我不太清楚.如果用PVDF膜，先用甲醇浸泡一段時間，我一般是5分鐘，但也有人說不過30秒，不清楚。換了NC膜就直接放入轉移緩沖液中的，晃30分鐘左右。濾紙開始是買的那種專用濾紙，上面三張，下面三張，后來有人說這種濾紙是做濕轉用的，應當用那種比較厚的，上下各一張，我也不知道，后來就換成普通濾紙了，上下大約各15張左右，有

17、時著急還反復用過，效果也還可以，估計問題不大。因為這款半干轉膜儀說明書上說不會短路，所以一般濾紙膜膠.他們之間一定不要有氣泡.。膜上要做好標記，識別正反面和上下,切個小角是常用的方法,有MARKER也方便記.轉膜后的膠可用考染看看轉膜情況.考馬斯亮藍R250:R2500.25克,甲醇50ML,冰乙酸40ML,加水到100ML.脫色液:乙酸50ML,甲醇225ML(可用乙醇),ddH2O500ML10*麗春紅(20ML):2%麗春紅(0.4克),30%三氯乙酸(6克),30%磺基水楊酸(6克).用時加入9倍的ddH2O10*轉膜緩沖液:70KD分子量:Tris29克,甘氨酸14.5克,SDS1.

18、85克,加水到500ML.用時取10ML,加20ML甲醇,加70ML雙蒸水17KD分子量:Tris29克,甘氨酸14.5克,加水到500ML.用時取10ML,加50ML甲醇,加40ML雙蒸水封閉用5%的封閉液(伊利的高鈣脫脂),室溫,搖床1小時.5%封閉液:1克脫脂奶粉,20ML洗膜液.洗膜液:10*PBS50ML,450MLddH2O,0.5MLTWEEN-20HYPERLINK/antibody/t_blank抗體孵育將膜上的封閉液洗去(輕輕晃晃就可)一抗:用雜交液配置.濃度可根據點蛋白實驗,及ECL要求來定.4度,過夜.最好有那種4度搖床.我一般早上到實驗室后,再搖床上再搖3個小時左右.

19、洗膜液洗3次,每次10分鐘.二抗:用雜交液配置.室溫,搖床,1小時.洗膜液洗3次,每次10分鐘.PBS洗5分鐘.如果一抗沒有混濁,放置時間不長,可以重復使用,本人一般連作二天時,才會重復用,如果因為一抗的原因而不出結果,太不值了.雜交液:BSA0.5克,洗膜液50ML.4度保存,如有混濁,重配.點蛋白試驗:在正式作WESTERN之前可先做這個,如果沒有結果可能提蛋白中不含目的蛋白,也可能一抗與目的蛋白結合不好,或一,二抗結合不好.(之前拿一滴二抗和ECL試一下是否發光,以排除二抗的問題).若有結果,可能選擇一個比較合適的一,二抗濃度.取小塊膜,放到24孔板中(PVDF先有甲醇泡,烘干),滴上不

20、同濃度的蛋白(先加5UL,37度烘干,再加5UL,烘干),加封閉液,室溫,搖床一小時,洗去.加不同濃度一抗,2-3小時,室溫,搖床.洗膜液洗3次,每次10分鐘.不同濃度二抗一小時,室溫,搖床.洗膜液洗3次,每次10分鐘.PBS洗5分鐘.顯色ECL顯影將膜上多余的水吸干,與膠相鄰的一面向上,按ECL說明書配置發光液.點在膜上.不同廠家ECL要求不一樣,本人用的ECL二種液體1:1混合后,0.125/CM2,放置2分鐘,吸干(可以用微量加樣器抽回來,可連續用下一張膜),放在保鮮膜上,包好,壓片.若肉眼可見發光,可壓10-20秒;若看不到,可壓30分鐘.(再長的時間沒試過,一般30分鐘不出,就重新再

21、回一次ECL,重做一次,若再不出,就認為沒有了.)轉完膜后的膜如果不能及時做,可放在洗膜液中,4度保存,最多放過2天,時間長了就不知道了.小分子量的蛋白半干轉效果比較好，大分子量（100KD）以上建議濕轉。具體轉膜條件需要多摸一下。30-80KD半干轉恒流1mA/cm2，1-1.5h都可以，大分子濕轉100V，2.5h以上應該可以，轉完膜麗春紅染出的條帶比較清楚的話，一般都能有結果。濕轉，Buffer一定要預冷，最好提前一天配好放4度；濾紙不要大過PVDF膜，防止短路；膠在負極，膜靠近正極，放入Tank前檢查一遍會使你免以體會放反的痛心疾首；膜要標記好正反面；轉膜過程中，經常過去看看，防止意外

22、，如電泳儀接觸不好。顯影:轉膜后看和你的蛋白分子量近似的預染Marker有沒有轉過去，如果marker沒問題，那基本可以認為你的蛋白轉過去了。顯色的話應該ECL好些吧，靈敏度更高呢，HRP標記的二抗孵育完后用TBST充分清洗，然后加ECLHYPERLINK/reagent/t_blank試劑，包好后壓片，一般如果你能夠看到熒光的話，壓片5min以內就可以看一下，如果看不見的話，直接壓半小時吧。暗室中壓片，壓片完后顯影、定影、水洗，就可以了。要是對曝光時間沒有把握，可以一次疊兩張膠片，相當于做個梯度。蛋白分子量大小分別為21kd、28kd，用的是濕轉，請問多大電流，多長時間比較合適？解答：分子量

23、比較小，最好是用干轉，濕轉效率太高，易轉過了。干轉的話，用2.5A/cm2，30min就應該夠了。濕轉，按照bio-rad的說明，用100mA，也得要半個多小時吧。轉膜時何為濕法，何為半干法？解答：半干法和濕法轉移是兩種不同的轉移裝置下的轉移系統，將膜，膠，濾紙整個浸泡在buffer的Tank里轉移的，叫濕法；用濾紙吸buffer來做轉移體系的叫半干法半干法轉移與膠的面積和蛋白分子兩大小好像都有關系，那么濕法轉移是不是所有的轉移條件都一樣呢？一般的條件是怎樣的？解答：半干轉的電流大小是按照面積來算的，時間是根據蛋白分子大小定的；而濕轉的話電流是恒定的，時間也是根據分子量而定。western顯色

24、的方法主要有以下幾種：i.放射自顯影ii.底物化學發光ECLiii.底物熒光ECFiv.底物DAB呈色現常用的有底物化學發光ECL和底物DAB呈色，體同水平和實驗條件的是用第一種方法，目前發表文章通常是用底物化學發光ECL。只要買現成的HYPERLINK/reagent/t_blank試劑盒就行，操作也比較簡單，原理如下（二抗用HRP標記）：反應底物為過氧化物+魯米諾，如遇到HRP，即發光，可使膠片曝光，就可洗出條帶。DAB好還是ECL好？答：DAB有毒，但是比較靈敏，是HRP最敏感的底物；ECL結果容易控制，但被催化時靈敏度差一點，但如果達到閥值，就特別靈敏，可以檢測pg級抗原。要看你實驗的

25、情況。westernblot的實驗步驟及注意事項的資料1.把聚丙烯酰胺凝膠中的蛋白質電泳轉移到硝酸纖維膜上。1）轉移緩沖液洗滌凝膠和硝酸纖維素膜，將硝酸纖維素膜鋪在凝膠上，用5ml移液管在凝膠上來回滾動去除所有的氣泡。2）在凝膠/濾膜外再包一張3mm濾紙（預先用轉移緩沖液浸濕），將凝膠夾在中間，保持濕潤和沒有氣泡。3）將此濾紙/凝膠/薄膜濾紙按照廠家建議方法放入電泳裝置中，凝膠面向陰極。4）將上述裝置放入緩沖液槽中，并灌滿轉移緩沖液以淹沒凝膠。5）按照廠家所示接通電源開始電泳轉移。6）轉移結束后，取出薄膜和凝膠，棄去凝膠。2.將薄膜漂在氨基黑中快速染色，直至分子量標準顯現時取出，記錄下標準位置

26、。3.用100ml水洗滌纖維素膜，必要時可用脫色緩沖液。4.膜置印跡緩沖液中于37保溫1小時。5.室溫下，用PBS-Tween緩沖液洗滌薄膜。6.用封口機將薄膜封入塑料袋中，盡可能不留空氣。7袋的一角剪一緩沖液的小口，用透析袋夾緊。8混合：NGS(100微升)，印跡緩沖液中的HYPERLINK/antibody/t_blank抗體（10毫升），加在裝薄膜的袋中，于室溫下搖動2小時（或4過夜）9用總體積300mlPBS-Tween緩沖液，分4次在一淺盤中洗滌薄膜，每次75ml。10將連接生物素的羊抗兔IgG（40微升溶于10毫升印跡緩沖液/100微升NGS）加在袋內，于室溫下搖動1小時。11按步

27、驟9洗滌。12加入抗生素蛋白-HRP（40微升溶于10毫升印跡緩沖液/100微升NGS），于室溫下搖動。注意事項：westernblot中轉移在膜上的蛋白處于變性狀態，空間結構改變，因此那些識別空間表位的HYPERLINK/antibody/t_blank抗體不能用于westernblot檢測。這種情況可以將表達目的蛋白的細胞或細胞裂解液中的所有蛋白先生物素化，再用酶標記親和素進行westernblot。實驗中取膠和膜需帶手套。westernblot試驗心得前兩天做了一個westernblot,現在把試驗中的一點小小的體會發上來，與大家交流，希望大家多多指點！1本實驗室采用的脫脂奶粉已經存放了

28、近兩年了，雖然是四攝氏度保存，但是其封閉質量還是難以保證的。所以本人的試驗結果中出現了小斑點。建議最好使用BSA或專用的脫脂奶粉進行封閉，雖然貴點，但還是有個好點的結果比較好。2本人采用的是過夜封閉方法，雖然時間長，想想封閉效果應該是沒有什么問題，但是一定要注意封閉液是否蓋過了全部的膜，不要漏掉任何一個小角落喲。3洗膜的時候，最好將膜放在平皿中，置于水平的試驗桌面上，不時用手晃動一下平皿，這樣洗膜會比在脫色搖床上更完全。因為在脫色搖床上晃動，有時洗滌液不足以完全沒過膜，在最后顯色的時候，會發現液體流過的一道道痕跡，使背景值增加。4其實在westernblot中，以上操作都是小問題，最主要的是一

29、抗的質量和待檢測蛋白的提取質量。在試驗之前，最好先用陽性對照與一抗做免疫學沉淀檢測（如ELISA），看看其效價和質量，以便確定在后來的雜交試驗中一抗的選擇和加量。另外，在做雜交之前最好也先跑一塊PAGE膠，染色，檢測一下待檢蛋白的提取質量。5在加一抗溫育之前，最好先將等量的一抗與野生型（即陰性對照）的蛋白在37攝氏度作用30分鐘，這樣可以封閉掉一抗的一些非特異性結合位點。6一定不要忘記做陰性對照和陽性對照，特別是陰性對照，不然結果出了什么問題，就無從分析了。7全程做下來，最后的顯色就像是個一錘定音的時刻，分外激動，但也應該尤為專注，一旦目的條帶出現了，就要馬上對顯色進行終止，要不然雜帶就要出來

30、了。主要HYPERLINK/reagent/t_blank試劑1、丙烯酰胺和N，N-亞甲雙丙烯酰胺，應以溫熱(以利于溶解雙丙稀酰胺)的去離子水配制含有29%(w/v)丙稀酰胺和1%(w/v)N，N-亞甲雙丙烯酰胺儲存液丙稀酰胺29g，N，N-亞甲叉雙丙稀酰胺1g，加H2O至100ml。)儲于棕色瓶，4避光保存。嚴格核實PH不得超過7.0，因可以發生脫氨基反應是光催化或堿催化的。使用期不得超過兩個月，隔幾個月須重新配制。如有沉淀，可以過濾。2、十二烷基硫酸鈉SDS溶液:10%(w/v)0.1gSDS，1mlH2O去離子水配制，室溫保存。3、分離膠緩沖液:1.5mmol/LTris-HCL(pH8.8):18.15gTris和48m