1、關于免疫組化及特殊染色第一張，PPT共七十八頁，創作于2022年6月第一節 免疫組織化學 技術概述第二張，PPT共七十八頁，創作于2022年6月（一）發展簡史 1941年Coons首先用熒光素標記抗體檢測肺組織內的肺炎雙球菌獲得成功。 60年代Nakane建立酶標抗體技術運用鐵蛋白標記Ab技術70 、80年代多位科學家改良上述技術，建立辣根過氧化物酶-抗過氧化物酶（PAP）技術,抗生物素生物素（ABC）法使免疫組織化學進入了應用階段。 第三張，PPT共七十八頁，創作于2022年6月2000年以后各種免疫組化技術更加成熟,使免疫組化技術成為當今生物醫學中形態、功能代謝綜合研究的一項有力工具。其應

2、用范圍深達醫學各個學科，是目前生命科學工作者應該掌握的基本技術之一。第四張，PPT共七十八頁，創作于2022年6月定義:是應用免疫學基本原理抗原抗體反應，即抗原與抗體特異性結合的原理，通過化學反應使標記抗體的顯色劑(熒光素、酶、金屬離子、同位素)顯色來確定組織細胞內抗原（多肽和蛋白質），對其進行定位、定性及定量的研究，稱為免疫組織化學技術(immunohistochemistry)或免疫細胞化學技術(immunocytochemistry)。 將試劑抗原或試劑抗體用可以微量檢測的標記物進行標記，在與標本中的相應抗體或抗原反應后，可以不必測定抗原抗體復合物本身，而測定復合物中的標記物，通過標記物

3、的放大作用，進一步提高了免疫技術的敏感性。（二）免疫組織化學的原理第五張，PPT共七十八頁，創作于2022年6月抗原是指能夠刺激機體產生（特異性）免疫應答，并能與免疫應答產物抗體和致敏淋巴細胞在體內外結合，發生免疫效應（特異性反應）的物質。抗原的基本特性有兩種，一是誘導免疫應答的能力，也就是免疫原性，二是與免疫應答的產物發生反應，也就是抗原性 第六張，PPT共七十八頁，創作于2022年6月病原微生物 在醫療中將病原微生物制成疫苗進行預防接種，可以提高人的免疫力。 嗜異性抗原 一類與種屬特異性無關的、存在于人以及某些動物、植物、微生物的性質相同的抗原。 腫瘤抗原 由物理的、化學的因素或某些病毒誘

4、發的實驗動物腫瘤，其細胞中或細胞表面均出現特異性抗原，稱為腫瘤特異性抗原。已證實在某些人類腫瘤中心存在著與病毒密切相關的抗原。 同種異體抗原動物免疫血清與人類有關的抗原 第七張，PPT共七十八頁，創作于2022年6月抗體（antibody）指機體的免疫系統在抗原刺激下，由B淋巴細胞或記憶細胞增殖分化成的漿細胞所產生的、可與相應抗原發生特異性結合的免疫球蛋白。 第八張，PPT共七十八頁，創作于2022年6月世界著名抗體公司 Santa公司、Abcam公司、Abgent公司、Proteintech Group、Cell Signaling Technology（CST）、羅氏公司（Roche）第九

5、張，PPT共七十八頁，創作于2022年6月 它借助于熒光素、酶等標記抗體與組織切片或細胞涂片中相關抗原相結合，由于熒光素所發熒光可用熒光顯微鏡檢出，而酶可經一定的顯色處理，呈現醒目的陽性色彩，從而可準確定位欲測定的抗原物質。 標記物第十張，PPT共七十八頁，創作于2022年6月熒光素、酶標記抗 體抗 原熒光陽性色彩顯微鏡觀察組織抗原抗體 酶熒光素第十一張，PPT共七十八頁，創作于2022年6月第十二張，PPT共七十八頁，創作于2022年6月 三大系統 本技術是應用免疫學原理來識別待測抗原，再通過酶和底物的作用外加顯色劑，將上述反應顯示出來。第十三張，PPT共七十八頁，創作于2022年6月免疫組

6、織化學識別系統聯結系統顯示系統第十四張，PPT共七十八頁，創作于2022年6月識別系統是指特異性抗體識別組織或細胞中的靶抗原。抗原抗體的特異性結合是本技術的基本依據。第十五張，PPT共七十八頁，創作于2022年6月聯結系統由聯結抗體構成。它的作用是聯接識別系統和顯示系統。 第十六張，PPT共七十八頁，創作于2022年6月顯示系統的目的是使抗原抗體間的特異性結合變為肉眼可見。因此顯示系統由標記酶，底物和顯色劑組成，以在靶抗原存在位點上形成有色沉淀。第十七張，PPT共七十八頁，創作于2022年6月特點： 特異性強靈敏度高定位準確和簡便快速等優點又能夠將形態、功能及代謝的研究有機結合起來。第十八張，

7、PPT共七十八頁，創作于2022年6月IHC方法1 過去用過的方法ABC法，SP法。三步法，使用生物素2 目前最常用的方法二步法： EnliVision顯色系統（即用型非生物素免疫組化EnliVisionTM plus檢測試劑盒 ）將多個抗鼠和抗兔的IgG分子二抗與辣根過氧化物酶通過一個多聚葡聚糖骨架聯接成一個大分子多聚體（polymer），直接放大信號40-50倍。敏感、省時、方便、背景低（避免了內源性生物素干擾）。第十九張，PPT共七十八頁，創作于2022年6月3 最新一代的免疫組化 Novolink Polymer法：使用小分子聚合物（減少細胞薄膜硬脂的阻礙，比傳統中的大分子聚合物染色更

8、顯著），信號放大更強，還可以檢測到組織中低濃度的抗原。 IHC方法第二十張，PPT共七十八頁，創作于2022年6月 EnliVision法的工作程序： 切片，烤片，脫蠟水化（使用防脫片處理的玻片：多聚賴氨酸，APES）H2O2處理（阻斷內源性過氧化物酶），蒸餾水漂洗組織切片的預處理（枸櫞酸鈉緩沖液中熱修復，酶消化暴露出抗原決定簇），TBS漂洗內源性過氧化物酶的阻斷一抗孵育，TBS漂洗二抗孵育，TBS漂洗DAB顯色，蒸餾水中止反應蘇木素復染及封片 IHC技術的基本操作流程第二十一張，PPT共七十八頁，創作于2022年6月切片烤片脫蠟水化H2O2處理熱修復一抗二抗Enlivision試劑DAB顯色

9、蘇木素復染第二十二張，PPT共七十八頁，創作于2022年6月IHC染色結果的判讀原則第二十三張，PPT共七十八頁，創作于2022年6月玻片干燥造成的“邊緣效應”假陽性未阻止內源性過氧化物酶阻止內源性過氧化物酶后I. 注意影響IHC結果判讀的因素第二十四張，PPT共七十八頁，創作于2022年6月酒精固定福爾馬林固定胰腺，insulin平滑肌肉瘤，SMA氣泡影響抗體抗體反應冰凍切片石蠟切片結腸，CEA假陰性：注意內對照第二十五張，PPT共七十八頁，創作于2022年6月假陰性蛋白酶處理后蛋白酶未處理皮膚，IV膠原甲狀旁腺，PTH微波未處理微波處理后第二十六張，PPT共七十八頁，創作于2022年6月I

10、I. 染色的特異性判定第二十七張，PPT共七十八頁，創作于2022年6月第二十八張，PPT共七十八頁，創作于2022年6月第二十九張，PPT共七十八頁，創作于2022年6月第三十張，PPT共七十八頁，創作于2022年6月Fujita Health University School of MedicineMitochondoriaApicalmembraneBasolateral membranePlasma Membrane+PERGolgiPlasma membranePER + GolgiGolgiapparatusEndocrinegranuleEndocrine granuleLys

11、osomeCytosolNucleusCytoskeleton amylase lysozome PAcP S-100 NSE prefixation diffusion artifact CEA EMA ALPCD10 cytochrome P-450 immunogloblin AFP HCG factor -RA prolactin in activated pituicyte SC EGFRE-cad Leu 4 HLA-DR CEA, EMA, SC, CA19-9 in cancer cell Leu 1 LCA PALP in seminoma cellCerb-B2 SC, A

12、FP EMA, immunoglobulin in special conditions chromogranin A serotonin Peptide hormone DNA polymerase S-100 (occasional) estrogen receptor keratin in carcinoid, mesothelioma vimentin keratin in adenocarcinoma hepatocyte actin keratin vimentin GFAP tubulin 各抗原在細胞內的顯色方式第三十一張，PPT共七十八頁，創作于2022年6月細胞膜陽性細胞粘

13、附分子： E-cadherin、CD31、CD56等交聯膜蛋白分子：catenin、dystrophin 等細胞表面受體：EGFR、c-erbB2、c-kit/CD117（酪氨酸激酶受體）等絕大多數白細胞抗原: LCA、CD20、CD2、CD5等表面或跨膜蛋白：Villin、BerEP4、EMA、 CEA、CA125、EBV-LMP1等第三十二張，PPT共七十八頁，創作于2022年6月細胞核陽性細胞周期素蛋白：cyclins、cyclin 依賴激酶(cdk)、cdk 抑制劑 (如 p16)等細胞增殖相關蛋白：Ki67、PCNA轉錄因子：MyoD1、myogenin、TTF-1、CDX2、PAX

14、5腫瘤抑制基因：如 p53、p63、Rb、WT1基因錯配產物：如 MLH1、MSH2第三十三張，PPT共七十八頁，創作于2022年6月細胞核酶：如 TdT類固醇激素受體：如 ER、PR、AR細胞核鈣結合蛋白：如 S100蛋白、calretinin定位細胞核的病毒：如 CMV、HBcAg（核+核周）NeuN：neuronal nuclei，表達于成熟的神經元第三十四張，PPT共七十八頁，創作于2022年6月細胞漿內顆粒狀陽性-定位于細胞器溶酶體顆粒：如 lysozyme、CD68、myeloperoxidase黑色素小體和前黑色素小體：如 HMB45、Melan-A細胞毒顆粒：如TIA-1、gr

15、anzyme B線粒體: 如抗線粒體抗體, HEP-PAR1神經內分泌顆粒：各種激素（如PTH、 ACTH、insulin）、CgA、SynW-P 小體: F-VIII相關抗原分泌顆粒：如BRST-2、surfactant、PSA細胞內微生物：如弓形蟲第三十五張，PPT共七十八頁，創作于2022年6月細胞漿纖維狀陽性-中間絲或微絲中間絲;CK;Vimentin;DesminGFAP（glial fibrillary acidic protein，膠質纖維酸性蛋白 ）NF（Neurofilament，神經元胞漿節細胞神經瘤，副節瘤/嗜鉻細胞瘤，神經母細胞瘤）Nestin：巢蛋白，神經前體細胞第三

16、十六張，PPT共七十八頁，創作于2022年6月彌漫或片狀的細胞漿陽性蛋白分布在細胞內液、大量的微囊及內質網中如:myoglobin、hemoglobin、albumin、AFP、 NSE、cytoplasmic Ig、CD3病毒顆粒/蛋白如:HBsAg（常在核旁著色）從細胞間液吸收的蛋白如: Ig、 albumin第三十七張，PPT共七十八頁，創作于2022年6月 分化差惡性腫瘤的診斷和鑒別診斷； 證實內分泌腫瘤和神經內分泌腫瘤； 應用腫瘤胚胎性抗原診斷某些腫瘤，如癌胚抗原（CEA）對胃腸道癌、甲胎蛋白（AFP）對肝癌和卵巢內胚竇癌診斷有幫助； （三）免疫組化的應用第三十八張，PPT共七十八頁

17、，創作于2022年6月 有時可幫助確定腫瘤的良惡性，如應用免疫球蛋白輕鏈和來鑒別濾泡性惡性淋巴瘤和濾泡性反應性增生； 研究某些癌癥與病毒的關系，如肝癌與乙型肝炎病毒、鼻咽癌與EB病毒、宮頸癌與乳頭狀瘤病毒等的關系；第三十九張，PPT共七十八頁，創作于2022年6月 為腫瘤治療的選擇提供依據，如乳腺癌檢測雌、孕激素受體（ER、PR）呈陽性時，應用他莫昔芬（三苯氧胺）治療可預期獲得較好的療效； 檢測癌基因和抑癌基因蛋白產物（如c-erbB2，p53）、增生活性抗原（如Ki-67，PCNA）用來估計腫瘤的預后。 第四十張，PPT共七十八頁，創作于2022年6月 免疫組化在臨床診斷中 應用病例示范（C

18、ase 1）臨床病史資料：48歲，男性，胃活檢標本取自胃大彎部位。H&E染色切片描述腫瘤細胞顯示在間質中呈癌巢樣，鄰近的腺體腸上皮化生，間質中的不規則的巢狀結構待診斷.第四十一張，PPT共七十八頁，創作于2022年6月H&E染色 第四十二張，PPT共七十八頁，創作于2022年6月 首先選擇Cytokeratin單克隆廣譜角蛋白抗體在細胞巢中呈強陽性染色，證明是上皮來源性的腫瘤，在圖片頂部是非腫瘤性的腺上皮陽性，腫瘤性的腺體在底部。第四十三張，PPT共七十八頁，創作于2022年6月 腫瘤細胞再進一步進行cytokeratin 7 /cytokeratin 20染色，染色證實在腫瘤細胞中同時缺少c

19、ytokeratin 7 /cytokeratin 20的表達。在這張圖片中腸上皮細胞cytokeratin 20陽性與鄰近的腫瘤細胞陰性形成明顯的對照。cytokeratin 7 and 20在臨床中使用中，如果同時都不表達，特異性地表示腫瘤細胞為來源于一些上皮的腫瘤（subset of epithelial tumors），包括腎細胞癌，前列腺癌、肝細胞癌和神經內分泌腫瘤等。第四十四張，PPT共七十八頁，創作于2022年6月 Synaptophysin 測定Synaptophysin所有腫瘤細胞中都顯示出較強的陽性表達，而在腫瘤細胞中包繞的腸腺體呈陰性診斷:神經內分泌癌第四十五張，PPT共

20、七十八頁，創作于2022年6月 Ki-67 測定:Ki-67 在腫瘤細胞呈現非常低的表達，Ki-67 染色同樣證實為腫瘤細胞增殖率低，腸腺上皮中Ki-67 高表達，可能是胃小凹腺體，與高細胞增殖率的腺上皮相比Ki-67在腫瘤細胞中缺少胞核表達。這些Ki-67 標記陰性的腫瘤細胞是低分級的神經內分泌癌細胞，第四十六張，PPT共七十八頁，創作于2022年6月第二節 免疫組織化學染色前的基本技術(一) 樣品的取材 組織標本包括石蠟切片（病理切片和組織芯片）和冰凍切片。細胞標本后者包括組織印片和細胞涂片。第四十七張，PPT共七十八頁，創作于2022年6月 其中石蠟切片是制作組織標本最常用、最基本的方法

21、，對于組織形態保存好，且能作連續切片，有利于各種染色對照觀察；還能長期存檔，供回顧性研究.第四十八張，PPT共七十八頁，創作于2022年6月 樣品制備的第一步就是取材，取材的好壞關系到實驗的結果。所以必須做好準備工作。 現將組織取材的原則和具體要求分述如下： 1 刀剪銳利、潔凈。 2 快速、準確、盡量保持生活狀態， 力爭1分鐘之內放入固定液，最遲不能超 過3分鐘。 第四十九張，PPT共七十八頁，創作于2022年6月3 一刀切取，切取應在蠟版或濾紙上進 行，避免拉鋸、牽拉或擠壓等動作。4 低溫操作，防止自溶現象，通常以 0-4的低溫條件下操作為佳。第五十張，PPT共七十八頁，創作于2022年6月

22、5、樣品大小適當，光鏡樣品一般在1.0cm以內，免疫組織化學樣品大約在：2cm1.5cm0.3cm厚度控制在0.3cm。電鏡樣品規格要求切成0.5-1.0cm共3小塊。 對病理組織取材還應做到以下幾點： 取材部位必須是主要病變區； 必須取病灶與正常組織的交界區； 必要時取遠離病灶的正常組織做對照。 第五十一張，PPT共七十八頁，創作于2022年6月細胞標本的取材印片法:常用于活檢標本沉淀法:主要用于胸水、腹水、尿液等穿刺抽吸法：常用于淋巴結、軟組織、 腎、肝、肺等組織。第五十二張，PPT共七十八頁，創作于2022年6月注意事項：細胞經離心后細胞粘附性較差，標記過程中容易脫片，載玻片應涂粘附劑細

23、胞總數應以105個為宜，并集中在直徑0.6-1.0cm的圓圈內。富于粘液的標本，未經處理不宜作免疫組化標記。第五十三張，PPT共七十八頁，創作于2022年6月（二）、組織固定 2、免疫組化標本固定時，好的固定劑應 滿足哪些要求？ 1、目的:固有形態和結構、抗原完整性第五十四張，PPT共七十八頁，創作于2022年6月能快速固定抗原；防止抗原物質擴散；固定后的抗原能被抗體識別， 不影響抗原抗體反應。第五十五張，PPT共七十八頁，創作于2022年6月甲醛固定液：分類較多，最常用的4%多聚甲醛固定液，對于冰凍切片，甲醛固定有時比冰凍丙酮好；主要特點：組織穿透性好，收縮性小但對于不同的組織和抗原，可選用

24、不同的固定液。有時候商品化的抗體會有比較適合而推薦的固定液，請于購置前注意說明書。3、各種固定液：第五十六張，PPT共七十八頁，創作于2022年6月 Bouin,S固定液：飽和苦味酸750ml，甲醛250ml，冰醋酸50ml，其對組織的穿透力較強，固定較好，結構完整，但因偏酸，對抗原有一定損害，且組織收縮明顯，不適于組織標本的長期保存。 PLP液：即高碘酸鈉-賴氨酸-多聚甲醛，適于固定石蠟切片。適于富含糖類組織，對超微結構及許多抗原的抗原性保存較好。第五十七張，PPT共七十八頁，創作于2022年6月（三）、組織脫水浸蠟及包埋脫水透明等過程需在4或室溫下進行，避免組織抗原的損失；為使組織充分脫水

25、、透明和浸蠟，組織塊的厚度以1.0-1.5mm為宜;浸蠟及包埋過程中,石蠟溫度應保持在60或60以下,用熔點低的石蠟包埋;制備蠟塊在較低的溫度進行,故試劑處理時應適當延長,否則會給切片帶來困難第五十八張，PPT共七十八頁，創作于2022年6月常用的包埋法石蠟包埋冰凍干燥包埋塑料包埋第五十九張，PPT共七十八頁，創作于2022年6月（四）組織切片中載玻片的處理 抗原修復過程中，由于高溫、高壓、輻射等諸多因素的影響，極易造成脫片。為保證試驗的正常進行，可選用Poly-L-Lysine 、ZLI-9001 APESZLI-9003 HistogripTM或ZLI-9005 等幾種試劑，對已常規清洗的

26、載玻片進行處理。具體方法如下： 第六十張，PPT共七十八頁，創作于2022年6月Poly-L-Lysine：將洗凈、干燥的載玻片放入以1:10比例去離子水稀釋的多聚賴氨酸溶液中，浸泡5分鐘，60oC烤箱烘烤一小時或室溫過夜干燥。裝盒備用。試驗中使用的器具均為非玻璃制品。 第六十一張，PPT共七十八頁，創作于2022年6月（五）抗原修復 抗原修復是指石蠟、冰凍、火棉膠、塑料切片免疫組織化學（IHC）前用胰蛋白酶、尿素、表面活性劑、微波緩沖液和金屬鹽等，使被掩蓋的抗原決定簇或變性的抗原重新暴露或抗原性得到一定程度的恢復過程。 第六十二張，PPT共七十八頁，創作于2022年6月石蠟切片為什么要做抗原

27、修復？有那些方法？ 石蠟切片標本均用甲醛固定，使得細胞內抗原形成醛鍵、羧甲鍵而被封閉了部分抗原決定簇,同時蛋白之間發生交聯而使抗原決定簇隱蔽.所以要求在進行IHC染色時,需要先進行抗原修復或暴露,即將固定時分子之間所形成的交聯破壞，而恢復抗原的原有空間形態。第六十三張，PPT共七十八頁，創作于2022年6月 常用的抗原修復方法有微波修復法，高壓加熱法，酶消化法，水煮加熱法等，常用的修復液是pH6.0的0.01mol/L的檸檬酸鹽緩沖液。第六十四張，PPT共七十八頁，創作于2022年6月抗原修復方法一、熱修復 1、微波爐加熱法 將玻片分別插入抗原修復盒中，以保證各部位的玻片受熱均勻。 在抗原修復

28、盒中加入抗原修復液，蓋上帶有小孔的蓋子。 將塑料盒置于微波爐中央，加熱 2x5min 。兩次加熱之間，加入 50ml 蒸餾水。 加熱過程中，組織標本不可干燥。 第六十五張，PPT共七十八頁，創作于2022年6月第二次處理后，將微波爐中的修復盒移至室溫冷卻 15-20 分鐘。 不要打開蓋子！ 蒸餾水沖洗。 阻斷內源性過氧化物酶并置于蒸餾水中。 用 TBS 或 PBS 液沖洗。 進行免疫組化染色。 第六十六張，PPT共七十八頁，創作于2022年6月 在壓力鍋中放入 1500-3000ml 抗原修復緩沖液加熱到沸騰，不加閥，玻片插入切片架并放入沸騰的修復緩沖液中。后加閥，使之加壓2分鐘。后將壓力鍋置

29、于流水槽或繼續冷卻 20 分鐘（減壓）。取出切片，蒸餾水沖洗，移至 TBS 或 PBS 液中，以避免組織干燥。 以下同微波爐修復法 。 2、壓力鍋法第六十七張，PPT共七十八頁，創作于2022年6月 抗原修復的方法選擇，關系到組織抗原能否暴露充分，這對免疫組化染色效果有很大影響。因此應當根據不同的抗原特點，采用不同的修復方法。對某些細胞內抗原（如Fas、Bax、F等）和細胞間質抗原（如Laminin、CoIV等）則需要用酶消化法處理切片。 二、酶消化方法第六十八張，PPT共七十八頁，創作于2022年6月1、胰蛋白酶處理： A 滴加一滴胰蛋白酶工作液于組織上。 B 室溫 37 孵育 20-40

30、分鐘，孵育時間的長短依福爾馬林固定時間及所測抗原情況而定。 C 蒸餾水沖洗，終止反應。 D 阻斷內源性過氧化物酶。 E 免疫組化染色。 第六十九張，PPT共七十八頁，創作于2022年6月2、胃蛋白酶處理 A 滴加胃蛋白酶工作液于組織上。 B 最佳消化時間取決于福爾馬林的固定時間， 37 預熱。一般消化 10 分鐘，長至 30 分鐘。 C 以下同胰蛋白酶處理方法 3 ,4,5 。 注：過度消化將導致組織結構的丟失，并引起組織脫片第七十張，PPT共七十八頁，創作于2022年6月三、綜合方法 微波爐加胰酶修復法： 將組織切片置于盛有 50ml 修復液的塑料盒中，封口膜封口后加熱 5 分鐘。 冷卻后打開，將切片置于 37 預熱的蒸餾水中，胰蛋白酶消化。 室溫胰蛋白酶處理 30 秒鐘。 蒸餾水沖洗。 阻斷內源性過氧化物酶，置蒸餾水中。 免疫組化染色。第七十一張