1、第18章生殖毒性研究第一節 致畸胎研究研究概況年份 事件作者19321935194819501956196319661971維生素A缺乏可使猴胚胎畸形X射線照射使大鼠胚胎發生各種畸形氮芥導致大鼠胚胎畸形可的松致小鼠胚胎畸形反應停（Thalidomide）事件美國藥物安全委員會美國FDA 人用藥生殖安全評價準則WHO規定新藥應有生殖毒性研究HaleGobHarriuBaxter先天愚型海豹肢畸形 生殖毒性研究（Reproductive toxicity study）是藥物非臨床安全性評價的重要內容，它與急性毒性、長期毒性、遺傳毒性等毒理學研究有著密切的聯系，是藥物進入臨床研究及上市的重要環節。

2、生殖毒性研究在限定臨床研究受試者范圍、降低臨床研究受試者和藥品上市后使用人群的用藥風險方面發揮重要作用。生殖過程分期分期研究內容檢測方法交配前到懷孕成年雄性/雌性動物的生殖功能；配子的發育和成熟；交配行為及生育力一般生殖毒性試驗懷孕到著床成年雄性/雌性動物的生殖功能；著床前的發育和著床著床到硬腭閉合成年雄性/雌性動物的生殖功能；胚胎發和大部分器官形成致畸試驗硬腭閉合到懷孕末期成年雌性動物的生殖功能；胚胎生長發育以及器官發育和生長出生到斷奶成年雌性動物的生殖功能；嬰兒在宮外生活的適應性；斷奶前的發育和生長圍產期試驗斷奶到性成熟斷奶前的發育和生長；獨立生活的能力；完全達到性成熟避孕藥、性激素、性功

3、能障礙藥、促精子生成藥、致突變試驗陽性或有毒作用的新藥，必須進行生殖毒性試驗。第二節 有關生殖毒性的基本概念 生殖是機體繁衍種族的生理過程，包括生殖細胞的發育形成、交配、受精、植入、胚胎形成和發育、分娩和哺乳等過程。每一個環節均可能是化學物質毒性作用的靶部位，機體接觸化學物質后干擾了其生理過程，使生殖過程的功能出現缺陷和損害，此即化學物質的生殖毒性。 生殖毒性有兩個特點：（1）對化學物質的毒性作用敏感，一定劑量下，其他系統尚未出現損害之前，生殖過程中的某個環節或功能已經出現障礙；（2）化學物質毒性作用對其損害更為深遠，不僅表現在接觸化學物的機體本身，還可影響后代。第二節 有關生殖毒性的基本概念

4、 畸胎學：從胚胎學和病理學發展出來的一個分支學科，是研究胚胎發育時期，由各種內外因子引起結構和功能異常的先天性畸形的科學。 致畸性（teratogenicity）：藥物接觸胚胎發生期后引起永久性結構或功能異常的性質。 胚胎毒性（embryo toxicity）：某些藥物在一定劑量僅對胚胎或胎兒有毒性作用而對母體沒有毒性作用，此作用被稱為胚胎毒性。胚胎毒性表現為胚胎死亡、胚胎生長遲緩、畸形和功能不全。 母體毒性（embryo toxicity ）：指藥物引起懷孕動物的毒效應，如體重不增或減輕等，最嚴重的是死亡。第二節 有關生殖毒性的基本概念 畸形（malformations）：永久性結構異常或功

5、能異常的胎兒和新生兒。通常不包括顯微鏡下細微結構的異常, 生化代謝性缺陷。單純功能異常(如精神缺陷、智力缺陷), 也不包括分娩過程中各種因素造成的缺陷。 致畸指數（teratogeny index）：為一種藥物對母體的半數致死量與最小致畸量的比值，是表示一種化學物質的致畸強度指標。建議致畸指數在10以下定為不致畸，10 100為致畸，100以上為強致畸。 出生缺陷(birth defect)：指任何解剖學的和功能的異常。既包括形態結構的異常(大體的和細微的)，也包括功能、代謝、行為的異常。第三節 一般生殖毒性試驗 目的 一般生殖毒性試驗（reproductive toxicity test）是

6、研究藥物對整個生殖過程的影響。包括生殖細胞（精子、卵細胞）的發生，卵細胞受精、著床胚胎形成，胚胎發育階段的影響并作出評價。 動物及分組 至少一種動物，一般為大鼠或小鼠，每組雄性動物10只，雌性動物至少20只。第三節 一般生殖毒性試驗 給藥劑量及途徑 給藥組設高、中、低三個劑量；高劑量應能產生輕微毒性反應，如體重增長緩慢等，但不應出現嚴重中毒或死亡。 給藥途徑應盡量接近臨床。 給藥時間 雄性動物交配前給藥60 80天，雌性動物交配連續給藥14天。交配后繼續給藥至大多數器官發生期（大鼠/小鼠為孕后13天）。第三節 一般生殖毒性試驗 檢查雄性與雌性動物同籠交配后，每日檢查小鼠陰道中有無陰栓，大鼠則檢

7、查精子，以檢查到陰栓或精子的當日作為妊娠第0天。雌鼠于妊娠第13天解剖觀察，以確定妊娠、胎兒的吸收和死亡情況，并記錄母鼠的一般狀況、體重變化和胎盤重量，以確定子宮內的活胎數，對活胎進行性別鑒定、體重和身長的測量以及外表和內臟器官的形態學觀察，對骨骼進行茜紅素染色后進行檢查，必要時進行組織學和組織化學的詳細檢查。第三節 一般生殖毒性試驗 檢查大鼠于孕期第20天處死（小鼠18天）。剖腹取出子宮及卵巢，辨認和記錄活胎數，早死胎數、晚死胎數、吸收胎數和黃體數，對活胎仔應辨別性別、稱重，測量身長及尾長，仔細檢查活胎仔的外觀有無畸形，將每只母鼠的2/3活胎仔剝去皮膚和內臟，經脫水透吸及茜紅素染色后，檢查骨

8、骼畸形，將1/3活胎仔浸入Bouin氏溶液中固定，供檢查內臟畸形。第三節 一般生殖毒性試驗 結果判定 100 %畸胎率% =畸胎總數活胎仔總數活胎仔平均畸形數 =畸形總數活胎仔總數100 %母體畸胎出現率% =出現畸胎母體數妊娠母體總數* 畸胎及畸形的計算方法第四節 繁殖試驗 目的、原理 凡受試物能引起生殖機能障礙，干擾配子的形成或使生殖細胞受損，其結果除可影響受精卵或孕卵的著床而導致不孕外，尚可影響胚胎的發生及胎仔的發育，如胚胎死亡導致自然流產、胎仔發育遲緩以及胎仔畸形。如果對母體造成不良影響，出現妊娠、分娩和乳汁分泌的異常，亦可出現胎仔出生后發育異常。 本試驗檢測藥物對整個生殖過程的毒性作

9、用，通過繁殖試驗可以了解藥物對試驗動物的性腺功能、交配能力、受孕能力、妊娠過程、分娩、哺乳及對后代生長發育的影響。 一般傾向于二代繁殖試驗。第四節 繁殖試驗 動物及分組 大鼠，至少設三個劑量級和一個對照組。每組動物應至少能產仔20窩；F0代有生育能力的雄鼠至少10只，以后各代每組也應至少有10只雄鼠。 給藥劑量 高、中、低三個劑量；高劑量應有毒性作用，但不能引起10%以上動物死亡，且超過人體預期接觸水平。低劑量應不產生可觀察到的有害作用。 方法 以人體可能接觸的方式染毒。 僅對F0及F1代動物染毒。 F0代動物自離乳起（6 w之前）開始染毒，直到F1代離乳；F1代動物離乳（約30 d）后，部分

10、動物（用來繼續繁殖的動物）每天染毒，直到F2代離乳后30天。 F0代給藥至少100天后，開始交配，產生F1代。 F1代給藥至少數120天后，開始交配，產生F2代。第四節 繁殖試驗第四節 繁殖試驗 觀察指標 包括動物一般狀態、體重、進食量及死亡情況；著重觀察受孕率、妊娠率、出生存活率、產仔總數及平均仔重等與生殖機能有關指標。 計算下述生殖指數：100 %1. 生育力指數： 受孕率% =妊娠雌鼠數交配雌鼠數100 %2. 受孕指數： 正常妊娠率% =活產雌鼠數妊娠雌鼠數100 %3. 存活力指數：出生存活率% =生后4 d 存活仔數出生時活仔數100 %4. 哺育指數： 哺育存活率% =生后21

11、d 存活仔數出生后4 d 存活數第四節 繁殖試驗第五節 致畸試驗 原理 母體在孕期受到可通過胎盤屏障的藥物作用,影響胚胎的器官發育,導致結構和機能的缺陷,出現胎仔畸形。因此在受孕動物的胚胎著床后，并已開始進入細胞及器官分化期時，可檢出該物質對胎仔的致畸作用。 致畸試驗（teratogenic test）為鑒定動物致畸物的標準方法。不僅能檢測到藥物的致畸性，也可得到有關藥物致胚胎死亡及生長遲緩的資料。第五節 致畸試驗 動物 要求選用對藥物敏感性高而自發畸形率低的動物，常用大鼠、小鼠和兔。一般至少采用2種動物，一種為嚙齒類，另一種要求非嚙齒類（狗和猴）。 動物受孕及檢查方法 未交配過的雌鼠，鼠齡3

12、 m以下，體重200 - 250 g，做陰道分泌物涂片檢查，若發現白色分泌物較多，鏡下發現有核上皮細胞，則提示大鼠處于動情前期。此時，將其與雄鼠按21 或32同籠過夜，次日檢查是否受孕。 檢查是否受孕。（1）檢查陰栓：陰栓是雄鼠精囊與凝固腺分泌液在雌鼠陰道凝結而成的白色塊狀物，形似米粒。大鼠陰栓易脫落，小鼠陰栓不易脫落。（2）陰道涂片檢查精子。 陰栓或精子檢出當日記為孕0天，次日為孕第1天。 第五節 致畸試驗 劑量分組 分組 分高、中、低三個劑量組；陰性對照組；陽性對照組。 劑量確定 （1）高劑量應有母體毒性反應，或為最大給藥量；低劑量組應為母體和胚胎毒性反應劑量。 （2） 以 LD50 的

13、1/3 1/5 為高劑量組；以 LD50 的 1/30 1/100 為低劑量。 （3） 以人實際接觸量做為低劑量組，并以其倍數（10倍）做為高劑量。 每組受孕動物數 大鼠、小鼠 15 20 只；兔 8 10 只；狗和猴 3 4 只。 第五節 致畸試驗 給藥方式及時間 給藥途徑根據藥物的性質及人類可能的接觸方式定，多為灌胃和腹腔注射。 給藥時間選在胚胎對致畸物的易感期（器官形成期）。第五節 致畸試驗 觀察指標 1 每只實驗動物在試驗期間的受精日期、給藥日期和劑量、體重等基本指標。 2 對母體的觀察：每天檢查有無中毒癥狀，對有流產或早產征兆者（陰道出血）及時處死檢查。 3 對胎仔的觀察A 活仔外形

14、的檢查B 胎仔內臟檢查C 對胎仔骨骼檢查部位 畸 形頭顱鼻眼耳腭頜和唇肢趾脊柱腹部尾肛門腦突出，露腦，顱脊柱裂，單純性腦膜膨出單鼻孔，鼻孔擴張小眼，無眼，開眼，眼異位無耳，小耳，耳異位腭裂頜小，無頜，無口，唇裂短肢，畸形足多趾，少趾，缺趾，并趾脊柱膜膨出，脊柱骨缺失，脊柱側凸臍疝短尾，卷尾，角形尾，螺旋尾，無尾肛門閉鎖常見畸形及部位（外觀畸形）部位 畸 形顱頂骨枕骨頸椎骨胸骨肋骨腰椎四肢骨盤骨尾椎骨缺損，骨化遲緩缺損，骨化遲緩缺損，骨化遲緩缺損，錯位，骨化遲緩多肋，少肋，短肋，分叉肋，波狀肋，融合肋缺失，分裂，變形多骨，缺失缺失缺失，椎弓不連續，融合常見畸形及部位（骨骼畸形）部位 畸 形頭腭口

15、腔眼心血管肺膈腸肝腎生殖器膀胱腦積水，腦室擴大腭裂短舌，分叉舌少眼，小眼，無眼右位心，室中隔缺損，單房室心，主動脈弓橫位氣管食管瘺，肺倒位，少葉橫膈缺損，并引起腹內臟疝或內臟側位腸疝肝異位，少葉馬蹄腎，腎積水，腎積水，腎缺失，腎異位子宮缺失，睪丸缺失或隱睪，睪丸發育不全（單側/雙側），兩性畸形缺失常見畸形及部位（內臟畸形）第五節 致畸試驗 結果評定 1 對母體動物評定： 100 %100 %母體畸胎出現率（%）=妊娠母體數交配率% =已交配動物數實驗動物數死亡率% =死亡動物數實驗動物數出現畸形胎的母體數100 %母體增重= 處死時母體體重 妊娠第6日體重 處死時子宮連胎重第五節 致畸試驗 結

16、果評定 2 對胎仔評定： 100 吸收胎率（% ）=早期吸收數 + 中期吸收數 + 晚期吸收數實驗動物數注意區分畸形數和畸胎數外觀畸形率% =外觀畸形數檢查胎仔數100 %骨骼畸形率% =骨骼畸形數檢查骨骼數100100 死胎率（%）=胎仔總數死胎數內臟畸形率% =內臟畸形數檢查胎仔數100 %100活胎率（%）=胎仔總數活胎數第五節 致畸試驗評定藥物致畸作用應注意問題統計分析；劑量效應關系實驗動物的自發畸形類型和頻率變異種屬差異、品系差異動物實驗結果外推致人類時，須結合人群流行病學調查注意人類實際接觸量及接觸方式與途徑第五節 致畸試驗第六節 致畸作用機理 突變引起胚胎發育異常 細胞死亡和增殖速度減慢 細胞間通訊抑制 胚胎中間代謝障礙 胚胎組織發育過程不協調 滲透壓不平衡