1、人類胎盤促乳激素與人類促乳激素交叉嵌合重組蛋白 對人類促乳激素接受體 結合才干與抗乳癌相關機制之研討藍珮菁Pei-Ching Lan張正教授Advisor: C.Allen ChangNational Chiao Tung UniversityBiological Science and Technology研討背景胎盤及胎盤素 中國的漢方醫學寶典本草綱目中，對於乾燥胎盤 -紫河車有記載 胎盤是母體傳遞胚胎生長發育所需物質的通道前四週發育快速 胎盤素之效果，廣為生醫界所研討，其具有幫助細胞新生、及增強免疫機能等效果風濕性關節炎研討背景胎盤及胎盤素 研討背景胎盤促乳激素Placenta Lact

2、ogen與促乳激素(Prolactin) 胎盤促乳激素Placenta Lactogen, PL22.3kDa蛋白質只由胎盤生產初期了解可促進母體乳腺之生長與乳汁之生產。促乳激素(Prolactin, PRL)腦下垂體前葉所分泌22.5kDa蛋白質在生產後調控乳汁中之酪蛋白(casein)與乳蛋白素(lactabumin)之製造以及乳汁分泌。 研討背景促乳激素與訊息傳遞 JAK-STAT pathwayRas-MAPK pathway研討背景促乳激素與訊息傳遞 oPL/PRLR x-ray structure研討背景胎盤促乳激素Placenta Lactogen與促乳激素(Prolactin)

3、 訊息傳遞: JAK2 kinase-STAT路徑、ras-MAPK路徑最近一些研討報告指出，促乳激素會影響thymic stromal cell的 IL-1與IL-6的表現量，進而影響T細胞的分化。IL-6在體外試驗上也表現出抑制鼠的胎盤促乳激素的分泌量。顯示促乳激素與細胞動素亦有關連，但其機制尚不清楚。 最近的研討顯示促乳激素與乳癌有其相關性研討背景乳癌與乳癌用藥乳癌在國人及世界婦女癌癥中，不斷佔有很高的比例。乳癌：乳房乳腺管細胞或是腺泡細胞經由不正常分裂、繁衍所構成之惡性腫瘤。 乳癌的治療：開刀、放射線治療、化學治療與荷爾蒙療法研討背景乳癌與乳癌用藥化學治療藥物：fluorouracil

4、5-FU與anthracycline(ex. doxorubicin)為第一線藥物荷爾蒙療法：以對抗動情激素接受體(estrogen receptor)的藥物為主，如tamoxifen。 衛生署藥政處通過用於治療乳癌的新藥：化學療法：太平洋紫杉醇 Taxol、歐洲紫杉醇 Taxotere、滅癌平Navelbin與截瘤達Xeloda荷爾蒙療法：安美達Arimidex。 研討背景乳癌與乳癌用藥目前對乳癌的荷爾蒙療法主要是以對抗動情激素接受體(estrogen receptor，ER)的藥物為主-無法完全抑制乳癌細胞的成長。Tamoxifen 亦會抑制由促乳激素引發的 ER-negative Nb2

5、 rat lymphoma cells的生長。-ER以外的receptor在一些報告中指出促乳激素(PRL)能夠為對抗乳癌的另一個目標。會過量表現促乳激素的基因轉殖鼠在11至15月齡即出現乳癌腫瘤PRL有影響經由蛋白質水解酵素水解的促乳激素片段，可表現出有抑制血管新生的作用PRL有影響研討背景乳癌與乳癌用藥接受體PRL對抗乳癌的接受體研討：Dopamine receptor 但由最近的研討報告指出其與乳癌的相關性小，所以抑制Dopamine receptor對治療乳癌能夠是無效的 。PRL receptor：PRL 專一結合，抗乳癌接受體目標PL、GH 也會與PRL receptor bind

6、ingPLPRLGH 研討背景擬解決問題 針對PRL receptor研討抗乳癌藥物利用PL與PRL特性研發不產生生理功用的蛋白質蛋白質片段：成分複雜不易控制嵌合重組：可掌握蛋白質性質研討背景基因隨機的嵌合重組 相關的基因做隨機的嵌合重組，可以得到多樣化的新型基因，而成為一組新蛋白質的基因庫。Gene shuffling為一快速產生chimerical library的方法。利用DNase I 將類似的gene做隨機的剪切成小片段，再以此小片段基因的互補做PCR，可隨機的將基因相連而成相互鑲嵌的新的基因。由於鑲嵌的順序隨機且互不一樣，分析新的基因庫，可以獲得更多的蛋白質資訊，並且可以由特定目標

7、的篩選而得到功能更佳的基因及蛋白質。 研討背景基因隨機的嵌合重組 研討背景基因隨機的嵌合重組 將hPL、hPRL做隨機的gene shuffling，藉由鑲嵌而成的基因序列，可分析這一family的蛋白質的結協作用、coding potential、tissue specificity 跟gene function，藉由DNA sequence 以及computer modeling，可比較不同蛋白質之結構與性質的關係。而藉由此蛋白質與PRL 接受體的競爭力分析，及進一步的細胞動素分析，可作為抗乳癌藥物之candidate或是乳腺發育不全的治療。 PL gene cloningPRL gene

8、 cloningPRLR gene cloningIn vitro assayBinding constantYeast two hybridDNA shufflingPLPRLMutant gene任務項目及實施方法 1.人類促乳激素接受體(hPRL receptor)基因分子選殖為了進行重組促乳激素的篩選，本實驗室必須有促乳激素接受體基因以表現其蛋白質。PCRcloning vector E.coli 做藍白篩選限制酵素來剪切DNA定序確認選殖入表現穿越載體如：pQE30E.coli check 表現選殖出之促乳激素接受體任務項目及實施方法 2.人類促乳激素(hPRL)之基因分子選殖與蛋白

9、質表現 為了進行重組促乳激素的篩選，以及測試將來進行shuffling重組時的PCR條件，本實驗室亦進行促乳激素基因選殖，並可將其表現之蛋白質與市售隻促乳激素蛋白質加以比較。PCRcloning vector E.coli 做藍白篩選限制酵素來剪切DNA定序確認選殖入表現穿越載體如：pQE30E.coli check表現選殖出之促乳激素任務項目及實施方法 3.hPL與 hPRL gene shuffling 0.005U DNase I剪切hPL與 hPRL geneRT 10-30min9510minice 10min1.4agarose電泳200-500bpprimeless PCRPri

10、mer PCRCloning vector E.coli shuffling libraryDNA sequence任務項目及實施方法 4. Shuffling gene與hPRL 結構之分子模擬 利用電腦程式,如Rasmol、insight II將已選殖出之hPRL receptor gene進行電腦模擬，加上PRL之模擬結果，以得到兩蛋白質相互作用之方式。模擬各Shuffling gene之三級結構,比較其蛋白質結構，並由模擬預測能夠之功能性,如與receptor之結合位置。任務項目及實施方法 5. Shuffling gene與hPRL receptor之結合力試驗 Yeast two-

11、hybrid system是近年發展的蛋白質交互作用研討方法。以yeast two hybrid 的方法，以hPRL receptor為釣餌，找出與hPRL receptor有交互作用的Shuffling genehPRLR gene - pGBKT7 vectorshuffling gene - pGADT7 vectoryeast表現出轉錄活化之表型如lacZ基因表現而使參與X-gal培養之菌體產生藍色Essential gene 存活任務項目及實施方法 Shuffling gene與hPRL receptor之結合力試驗 其利用將釣餌蛋白的基因剪接入一帶有DNA binding doma

12、in基因之現載體，以產生釣餌蛋白與DNA binding domain之交融蛋白；另外候選之library基因則剪接入一帶有轉錄活化因子基因之載體，以產生候選蛋白與轉錄活化因子之交融蛋白當此兩種選殖載體均被轉型入酵母菌內，假設釣餌蛋白與候選蛋白產生交互作用，則DNA binding domain會與酵母菌內之DNA結合，轉錄活化因子則促使標示基因表現，如此則可以挑出可與釣餌蛋白質交互作用之候選蛋白質。任務項目及實施方法 6. Binding constant Yeast two hybrid： 定性藉由ELISA方法測定重組蛋白質與接受體的結合常數。 另一個篩選的方法：可以將shuffling

13、的protein點於晶片上，再利用帶有標示的receptor protein，來將與hPLR有交互作用之蛋白質篩選出。參考各文獻的方法，以gel filtration 來分析與hPRL receptor之競爭力。對hPRL receptor有較大競爭力者，能夠為抗乳癌藥物 candidate。任務項目及實施方法 7. NMR/X-Ray蛋白質結構測定 將與清華大學余靖教授協作進行NMR測試與中研院袁小含博士協作進行X-Ray測定重組蛋白質的分子結構。 任務項目及實施方法 8. Clinical studies 篩選出能夠有功用之重組蛋白質後，將再以乳腺細胞株做in vitro assay。以特

14、定乳癌老鼠進行animal model試驗。 9. hPL之細胞動素(cytokine)變化乳腺細胞株與hPL或重組蛋白共同培養之，測定cytokine 如IGF-1、IL量之變化或其他cytokine量之變化。 目前研討結果 1. DNA shuffling試驗先前的試驗，試以不同濃度DNaseI與不同作用時間的搭配，尋找出可以適當剪切DNA為不同大小片段的條件。最後以以0.005U的DNase I剪切DNA，室溫作用10分鐘，可得到較佳的剪切情況，最小片段可由電泳膠片上看出約200bp。 200bp目前研討結果 1. DNA shuffling試驗而在將DNA片段重新組合的PCR試驗，則先

15、以Taq聚合脢做試驗，但卻無法正確生合成所要的DNA。後經參考paper上以辨識度較高的聚合脢做效果較好，則改以rTth聚合脢做重組的PCR，則可得到重組的DNA。 目前研討結果 1. DNA shuffling試驗Shuffle重組的DNA library，經酵素剪切，接入cloning vector 來載入shuffling之基因，再轉型入 E.coli 中。經過DNA初步定序，發現有二個重組DNA能夠是有變化的。分別命名為pSPRS314-2-2與pSPRS314-3-3b46目前研討結果 2. TLC與HPLC分析突變株TKRMY68及對照之野生株CBY57(無CAS基因)以SD培養液

16、培養3天後，搜集菌液，萃取其不皂化之脂類物質經TLC分析，可明顯辨識出TKRMY68會產生一新的環化物質。目前研討結果 2. TLC與HPLC分析以HPLC分析，OSD 4.6x250mm管柱，CH3CN 1ml/min沖提，UV202偵測突變株TKRMY68的萃取物於大約25分鐘時較野生株CBY57的萃取物多了一個peak。 目前研討結果 3. PRL基因選殖 PL基因已由林孟嘉同學於本實驗室選殖出。PRL基因則參考基因庫裡的DNA序列設計引子，欲以PCR放大的方法來選殖。hPRL(I)-30BamHI :5-CGCGGATCCAACATGAACATAAAGGATCG -3hPRL (II)

17、-24EcoRI :5-CCGGAATTCCTTCTGATACATTTCCTGCAG -3hPLR(II)-30KpnI :5-CGGGGTACCGTTACCTGAAGAAAAATCACA -3以super Therm聚合脢做PCR，由瓊脂膠體電泳確認，已經由placental cDNA放大選殖出PRLR基因。選殖入pBluescript II SK+ vector，經轉型入XL1Blue E. Coli，萃出其plasmid，以EcoRI限制酵素剪切，由瓊脂膠體電泳可見約3kb相當於vector大小及約2kb相當於insert大小的DNA片段。目前研討結果 5. PRL molecular simulation 由於oPL的X-Ray三級結構已解出，我們以oPL結構為模板，利用insightII軟體模擬出hPRL的三級結構結果仍為4-helix bundle的結構，與oPL X-Ray結構的骨架平均差為12.39。目