1、生物化學檢驗實驗室基本知識教學目的和要求：1、掌握實驗用純水的三級標準；實驗方法的分級、標準品分級及相互之間的聯系；實驗誤差的定義、分類和表示方法；方法評價實驗尤其是回收實驗和干擾實驗的原理和操作；診斷性能評價的指標。2、熟悉純水的制備方法；實驗方法選擇的的原則和步驟；方法評價的基本內容和步驟；方法評價的指標；參考值和醫學決定水平的概念。3、了解水的純度檢查；方法性能判斷的指標；受試者工作曲線的應用和用途。2第一節 實驗用純水天然水 自來水 實驗用純水 經簡單的物理、化學方法處理，除去懸浮物質和部分無機鹽 經蒸餾、電滲析等處理，除去雜質 (懸浮物,膠體物質,溶解物質)3一、純水的制備方法 蒸餾

2、法:優點:設備簡單缺點:1、揮發性物質難以去除；2、耗能大，耗能水多； 3、需注意管道清潔 純度： 25時1105cm如何安裝：4離子交換法：氫型強酸性陽離子交換樹脂(RSO3H，R為母體)，其中的H+與Ca2+、Na+等金屬離子發生交換反應，而將鈣、鎂離子除去 氫氧型強堿性陰離子交換樹脂(RNOH，R為母體)，其中的OH-與水中的CL-、碳酸根等陰離子發生交換反應，而將它們除去：5優點: 除了可去除雜質離子以外兼具吸附電中性雜質和過濾顆粒雜質的作用。缺點: 純度： 25時5106cm2、由于離于交換為可逆反應，故去離子水并非絕對不含離子 1、設備較復雜，成本較高；6電滲透法 在電場作用下水中

3、各種陽離子趨向陰極，各種陰離子趨向陽極但陽離子只能透過陽膜而被相鄰的陰膜所阻，陰離子與此相反這樣，在一些隔間內集中了陽離子和陰離子，即形成含鹽多的濃水，在另一些隔間內由于陰、陽離子的遷出降低了含鹽量形成淡水 71、不需要消耗化學藥品，設備簡單，操作方便。消耗電能，當原水中鹽濃度過低時，溶液電阻大，用電滲析也不經濟 純度:25時104105cm2、對于含鹽量高的海水等用此法比用離子交換法更為經濟優點:缺點:8炭吸附法:活性炭是一種非常優良的吸附劑，它是利用木炭、各種果殼和優質煤等作為原料，通過物理和化學方法對原料進行破碎、過篩、催化劑活化、漂洗、烘干和篩選等一系列工序加工制造而成。91、設備簡單

4、，操作方便。純水制備效率低.,僅作為各種制備純水配套的一種措施. 2、它具有物理吸附和化學吸附的雙重特性,可以有選擇的吸附氣相、液相中的各種有機物質.優點:缺點:10超濾膜法特點:僅能除去膠體細菌等大分子物質和懸浮物,所得水還需進一步純化.也是作為各種制備純水配套的一種措施.11混合純化系統醫用超純水設備 實驗室純水系統 櫥下式全自動逆滲透純水機特點:多種方法混合純化,可獲得純度很高的二級甚至一級純水.12二、水的純度檢查 用電導儀或兆歐表測定其電導率或電阻率用特定試劑檢測水中殘留的Ca2+、Mg2+、CI-、SO42- 、硅酸鹽等成分的含量微生物含量檢測單位：電導：西門子（s）電導率： sc

5、m-1電阻：電阻率：cm13CAP:美國病理學家學會實驗用純水標準14NCCLS:美國臨床實驗室標準化委員會15級水:臨床實驗室用水,一般實驗檢驗;級水:特殊實驗如酶活性測定、電解質分析等;級水:用做儀器、器皿的自來水清潔后沖洗. 實驗用純水的用途16實驗用純水的貯存、運輸和使用: 一般選用聚乙烯或聚丙烯桶（瓶）貯存，貯存時間不宜太長，使用時應避免一切可能的污染，切勿用手接觸純水或容器內壁. 盛裝藥品,試劑17第二節 實驗用玻璃儀器(了解) 18第三節 實驗方法的選擇 選擇準確可靠的實驗方法為臨床提供準確可靠的信息臨床生化檢驗分析實驗方法選擇的目的實驗方法的分級 標準試劑的分級保證19一、實驗

6、方法選擇的目的根本目的：各實驗室按照方法選擇的原則結合自身條件，確定合適的某項目的檢測方法。保證擬使用的檢測方法在正式應用于臨床分析病人標本之前，對方法性能及可能引入的誤差進行了解，作出初步評估。20二、實驗方法的分級分級依據：IFCC根據分析方法的準確性與精密度的不同。決定性方法 參考方法 常規方法 分為三級：21（一）決定性方法definitive method定義： 是指準確度最高，系統誤差最小，經過詳細的研究，沒有發現產生誤差的原因或在某些方面不夠明確的方法，其測定結果與真值最為接近。主要方法：重量分析法、中子活化法、同位素稀釋-質譜分析法（ID-MS）22應用： 由于技術要求太高，費

7、用昂貴，這類方法不直接用于鑒定常規方法的準確性，只用于評價參考方法與一級標準品。儲氫重量分析儀 (北京英格海德分析技術有限公司)23（二）參考方法reference method定義： 是指準確度與精密度已經被充分證實，且經公認的權威機構（國家主管部門、相關學術團體和國際性組織等）頒布的方法。這類方法干擾因素少，系統誤差很小，有適當的靈敏度、特異度、較寬的分析范圍并且線性良好，重復測定中的隨機誤差可以忽略不計。主要方法： 原子吸收分光光度法、火焰光度法、免疫化學法，離子交換層析法等24應用： 能在條件優越的實驗室作常規分析，主要用于鑒定常規方法，評價其誤差大小、干擾因素并決定是否可以被接受；用

8、于鑒定二級標準品和為質控血清定值；用于商品試劑盒的質量評價。25（三）常規方法（routine method ）定義： 應具有足夠的精密度、準確度和特異度，有適當的分析范圍，經濟實用，其性能指標符合臨床或其它目的的需要。主要方法： 溴甲酚綠法、雙縮脲法、J-G法等。應用： 臨床常規檢驗使用，常規方法在作出評定以后，經有關學術組織認可，可以作為推薦方法（recommended method ） 。偏差已知方法偏離未知方法26項目決定性方法參考方法鈣ID-MS原子吸收分光光度法氯電量滴定法、中子活化法電流滴定法鎂ID-MS原子吸收分光光度法磷ID-MS鉀ID-MS、中子活化法火焰光度法鈉重量分析法

9、、中子活化法火焰光度法白蛋白免疫化學法總蛋白雙縮脲法肌酐ID-MS、離子交換層析法離子交換層析法尿素ID-MS尿素酶法尿酸ID-MS尿酸酶法（紫外法）膽紅素重氮反應法葡萄糖ID-MS己糖激酶法膽固醇ID-MSAbell-Kendall法，膽固醇氧化酶法甘油三酯ID-MS酶法AST（GOT ） MDH-NADH法ALT（GPT）LDH-NADH法轉肽酶（r-GT）連續監測產物生成法肌酸激酶 NAD+偶聯法27三、標準試劑的分級標準試劑（標準品）的定義： 國際標準化委員會將標準品（參考物， reference material）的定義暫定為：它的一種或幾種物理或化學性質已經充分確定；被用于校正儀器

10、或用于評價一種測定方法的物質，并將其分成三級。標準品的應用：方法評價、儀器校正、常規分析的質量控制28標準品的分級：一級標準品 二級標準品 控制物 29（一）一級標準品（原級參考物）定義： 是已經確定的穩定而均一的物質，其數值已由決定性方法確定或由高度準確的若干方法確定，所含雜質已經定量。應用： 用于校正決定性方法，評價和校正參考方法以及為“二級標準品”定值。30（二）二級標準品（次級參考物）定義： 這類標準品可以是純溶液（水或有機溶劑的溶液），也可以存在于相似基質中。可由實驗室自己配制或為商品，其中有關物質的量由參考方法定值或用一級標準品比較而確定。應用： 主要用于常規方法的標化和控制物的定

11、值。31（三）控制物（質控物） 用二級標準品和常規方法測定，用于常規質量控制，以控制病人標本的測定誤差。控制物不能用于標定儀器或方法。 定值血清：在發生問題時查找原因 未定值血清：一般情況下使用 另：用二級標準品和常規方法測定，然后定值經過修正后得到校準品。32決定性方法 一級標準品參考方法 二級標準品常規方法 控制物33四、實驗方法選擇的原則總原則： 從實際出發，根據實驗室的條件和檢測要求確定適當的方法。條件優越的實驗室：參考方法一般臨床化學實驗室實驗室：常規方法或使用方便的參考方法34 盡量選用國內外通用方法或推薦方法，便于方法的規范化和質量控制，重點考慮實用性和可靠性。常規方法選擇時的原

12、則：35（一）實用性微量快速、方法簡便、安全可靠、成本低廉（二）可靠性 所選方法具有較高的精密度、準確度和較大的檢測能力，保證測定結果的準確性能滿足方法允許誤差限度的要求。標本l、試劑ml36五、實驗方法選擇的步驟（一）廣泛查閱文獻：（二）選定侯選方法：全面認識該法。（三）侯選方法的初步試驗：根據方法選擇的要求，比較各種方法37初步試驗包括：簡單 標準曲線和重復性 質控血清和新鮮標本的重復實驗 析濃度不同的標本，并與公認的參考方法的結果對比.初步試驗目的: 使工作者熟悉有關技術,掌握各分析步驟要點,判斷能否適合本室條件要求.根據所獲得的資料確定是否有必要作進一步研究。初步試驗38第四節 實驗方

13、法的評價 初步試驗判斷符合實驗要求系統評價決定該方法是否可接受分析評價試驗測得結果和比較方法性能判斷的標準實驗方法系統評價的過程:對實驗誤差的測定39一、實驗誤差定義:指量值的給出值與其客觀真值之差.(一)實驗誤差的分類:依據來源性質實驗誤差系統誤差 SE隨機誤差 RE恒定系統誤差 CE比例系統誤差 PE廣泛性不可求另：粗大誤差40系統誤差（systematic error， SE） 定義:指一系列測定值對真值存在同一傾向的偏差。特點:具有單向性，而沒有隨機性，常有一定的大小和方向； 一般由恒定的因素引起，并在一定條件下多次測定中重復出現；當找到引起誤差的原因，采取一定措施即可糾正，消除系統誤

14、差能提高測定的準確度。41分類: CE：指由干擾物引起的使測定值與真值存在恒定大小的誤差，誤差大小與被測物濃度無關，而與干擾物濃度相關。 PE：指相對于被測物濃度有相同的百分比誤差，誤差的絕對量與被測物濃度成正比。 引起誤差的原因： 方法誤差：最嚴重，最難避免； 儀器和試劑誤差：可以采取措施避免。42隨機誤差（random error，RE） 特點:誤差沒有一定的大小和方向，可正可負，數據呈正態分布； 具有不可預測性，不可避兔，但可控制在一定范圍內； 當分析步驟越多，造成種誤差的機會越多； 隨測定次數增加，其算術均數就越接近于真值。定義:指在實際工作中，多次重復測定某一物質時引起的誤差。43

15、由測定儀器、試劑、環境等實驗條件的改變以及分析人員操作習慣等因素的變化而引起。系統誤差 隨機誤差引起誤差的原因引起誤差的原因：44(二)實驗誤差的表示方法：平均誤差：算術平均偏差，用dm表示標準偏差（標準差）：表示精密度的較好的指標。絕對誤差和絕對偏差：dm=di/n=X- /ndi2=N-1絕對誤差=X-T絕對偏差=X-X45相對誤差和相對偏差：變異系數（coefficient of variation，CV）相對誤差=X-TT100%相對偏差=X-X X100%CV= S X100比較各組數據間的變異情況CV 離散度 精密度4647二、方法評價的基本內容和步驟(一)方法評價的基本內容基本內

16、容:通過實驗途徑，測定并評價方法的精密度和準確度。評價試驗的過程:就是對誤差的測定。精密度和準確度誤差方法評價指標不可直接測定 實際測定可直接測定方法評價試驗48(二)方法評價步驟評價前實驗:研究候選方法的最適條件。 初步評價:批內和日內重復性試驗、回收試驗、干擾試驗 最后評價:依順序作日間重復性試驗，方法比較試驗和總體判斷方法是否可接受 。評價后實驗:如方法可接受，則進行臨床相關研究.方法應用:建立質控系統，培訓操作者，引人常規工作等 。 隨機誤差系統誤差方法性能判斷診斷學評價49三、方法評價指標 精密度、準確度、特異度和干擾以及檢測能力等（一）精密度（Precision）定義:表示測定結果

17、中隨機誤差大小程度的指標。它表示同一標本在一定條件下多次重復測定所得到的一系列單次測定值的符合程度。 表示方法:自身無量度指標，常用標準差（S）或變異系數（CV）表示。（n，X）（n，X）50分類：連續測定的精密度 重復性精密度 （了解）再現性精密度 （了解）51連續測定的精密度： 在相同條件下，對同一標本連續進行n次重復測定結果的符合程度。在有限次測定情況下，一般用 （總體標準差）的估計值S（樣本標準差）來表達這種精密度。定義：52重復性精密度： 又稱室（批）內精密度，指在相同條件下（同樣方法、同一種試劑和標準品、同樣儀器、在同一實驗室由同一人操作，并要保持實驗期間準確性不變）對同一標本在盡

18、可能短的時間內進行m輪n次重復測定結果之間相互接近的程度。重復性（批內）精密度（S）Si2mS=Si=(xt-xt)2n-1CV= S X100定義：53再現性精密度定義： 又稱室（批）間精密度，指在不同條件下（不同操作者，用不同儀器，在不同實驗室和不同時間）采用同一方法對同一標本所獲得的單次測定結果之間彼此符合程度。應用：多用于實驗室間的質量估計，其標準差常稱為室間標準差。室（批）間標準差，是在對室（批）間重復性試驗結果進行單因素完全隨機設計方差分析后進行計算。54（二）準確度：定義: 指測定結果與真值接近的程度，一般用偏差和偏差系數表示。表示方法: 偏差為重復測定均值（ X）與真值之差。

19、偏差系數（CB）= 100 。真值-X真值定量的標準品確認的標準方法或55影響因素：系統誤差、隨機誤差（了解）表示已定系統誤差的綜合。A=+（不確定度） 不確定度（uncertainty）是表達測定結果的一個組成部分，它表明被測標本中真值存在的范圍56（三）特異度和干擾 即專一性，是指在特定實驗條件下分析試劑只對待測物質起反應，而不與其它結構相似的非被測物質發生反應。分析方法特異度越高，則測定結果越準確。特異度（specificity） 是指標本中某些非被測物質本身不與分析試劑反應但以其它形式使待測物測定值偏高或偏低，這些非被測物質稱為干擾物。干擾（interference）特異度干擾方法的準

20、確性側面指標正面指標57（四）檢測能力 定義：即檢測限度或檢出限（detection limit），是指能與適當的“空白”讀數相區別的待測物的最小值。空白讀數： 指由基質、試劑所得的讀數和結果，以及由儀器或測定過程所產生的影響測定步驟的殘余偏差。試劑空白：試劑+D.W檢出限TTT B 58四、評價試驗 評價試驗包括重復性試驗回收試驗于擾試驗方法比較試驗 59（一）重復性試驗試驗的目的: 試驗的方法: 對同一材料（標準液、質控液、標本等）分成數份試驗標本進行多次分析測定，并計算其均數、標準差與變異系數。檢測候選方法的隨機誤差（1）批內:標準液 （2）日內: （3）日間:質控液 （4）平行雙份:試

21、驗的形式:應注意的問題:（1）分析標本選擇（2）被測物濃度60(二)回收試驗試驗的目的: 試驗的方法: 將被測物標準液加人病人標本中，成為分析標本；原病人標本中加人等量的無被測物的溶劑作基礎標本；然后用候選方法測定并得到各自濃度。檢測候選方法的比例系統誤差。回收:指候選方法準確測定加入常規分析標本的純分析物的能力。61回收濃度=分析標本測得濃度 - 基礎標本測得濃度（實際測得值）計算:加入濃度= 標準液量病人樣品量（ml）標準液量（ml） 標準液濃度（理論真實值）回收率（%）=回收濃度加入濃度 100（理想值為）比例系統誤差回收率真實值測定值真實值誤差值真實值62注意事項：吸量準確；加入標準液

22、后，其實驗樣品的被子測濃度最好達到醫學決定水平；總濃度必須在方法分析范圍內；需加入高中低不同濃度回收試驗，計算平均回收率；加入標準液的體積一般在10%內；重復2-3次。63(三)干擾試驗試驗的目的: 用來檢測候選方法的恒定系統誤差。干擾物濃度不同，誤差大小也不同干擾:指標本中某些非被測物質本身不與分析試劑反應但以其它形式使待測物測定值偏高或偏低。64試驗的方法: 基本與回收試驗一樣，但在病人標本中加人的是疑有干擾或非特異性反應的物質。將可能引起干擾的物質配成一定濃度的溶液，加到病人標本中成為干擾分析樣本；原病人標本加人相同量的無干擾物質的溶劑作為基礎樣本；然后用候選方法對此兩種樣本同時測定，兩

23、者之差即表示該干擾物質產生的干擾所引起的誤差，即干擾值干擾值=分析標本測得濃度 - 基礎標本測得濃度計算:65注意事項被試驗的物質：膽紅素、溶血、防腐劑、抗凝劑、藥物等可疑干擾物的濃度：干擾物濃度有可能達到病理標本最高濃度值。本試驗檢測的誤差包括方法特異度不高和干擾物作用引起的誤差。消除干擾常用方法空白對照：試劑空白：常見標本空白：內空白法和外空白法物理、化學方法分離干擾物雙波長或多波長法檢測排除干擾誤差較大又無法消除，則改進或更換方法。（分析標本就是模擬實際標本）66(四)方法比較試驗（對比試驗）（熟悉）試驗的目的: 試驗的方法: 對一組病人的標本用候選方法和比較方法同時進行分析測定，觀察二

24、者之間的差異。這是考驗候選方法是否可采用的重要措施。 用于檢測候選方法的系統分析誤差。對所得數據進行分析，可提供系統誤差的性質（恒定或和比例誤差）67在進行臨床化學常規方法的評價時，最好選擇參考方法作為比較方法若采用已知偏差法，則有部分誤差來自比較方法（與已知偏差 一致的那部分誤差），剩余的則屬于侯選方法。若采用未知偏差法，分析誤差可能來源于二者之一或兩者都有，難以分析。比較方法的選擇：應注意的問題:統計處理：配對t檢驗、相關和回歸分析。68方法學評價實驗小結重復性試驗：測定候選方法的偶然誤差，衡量精密度。回收試驗：測定比例系統誤差，衡量準確度。干擾試驗：測定恒定系統誤差，衡量準確度。方法對比

25、試驗：檢測候選方法的系統分析誤差。69五、方法性能判斷方法的選擇 方法的評價實驗的診斷性能評價方法性能判斷建立質控,引入常規檢驗實驗誤差某一確定的允許誤差某一確定的允許誤差方法性能標準(PS):運用統計方法制定出一系列醫學決定水平上的標本允許誤差限度70（一）方法學性能指標：、允許分析誤差：依據Westgard制定的標本的允許誤差限度，或者的病人標本其誤差應小于這個限度，用表示。 是大量研究,運用統計學方法制定出的。、醫學決定水平：對臨床病人的診療具有醫學判斷作用的臨界分析物濃度，用c表示。c代表一個閾值。每個檢測指標有一個或多個閾值。性能指標:和c組成某方法的性能指標。即某方法在一定XC下的

26、值。71制定性能標準，要反映臨床應用與解釋結果的要求（醫學效用限度），又要基本符合實驗室所能做到的技能狀態。方法學性能標準制定原則72（二）方法性能判斷指標：判斷標準：各種誤差值確定的允許誤差值：方法可以接受任何一項各種誤差值確定的允許誤差值：方法不能接受性能判斷指標：兩套（了解）第一套：單值判斷指標：簡單，用于初步估量第二套：可信區間判斷指標：復雜，對方法性能評價更客觀，用于最后判斷73、單值判斷指標 誤差類別 判斷指標 備注隨機誤差（RE） 1.96STMEA STM=重復試驗的標準差 比例誤差（PE）(|R-100|)(XC/100)EA R=平均回收率恒定誤差(CE) |偏差|EA 由

27、干擾試驗測出系統誤差(SE) |(a+bXc)-Xc|EA 對比試驗回歸方程總誤差(TE) RE+SEEA 包括偶然及系統誤差74（）可信區間、可信上限和可信下限：統計學的規律說明，每種測定結果的可靠性與測定次數有關，次數愈多，結果反映真實性愈強；但實際上，不可能進行大量的測定。 在統計學中為了估量分析誤差的不確定性，對于每一誤差可計算其可信區間，用可信上限與可信下限代替單值的估量，u為誤差的可信上限，l為誤差的可信下限。west-gard推薦用90的可信區間，這樣，u將是誤差單側的95上限，用此判斷候選方法的可接受性比較可靠。75假如，u EA ，則方法性能為可接受；假如l EA，則方法必須

28、改進，以減少誤差，否則排除。假如u EA ，但l EA ，說明僅有的數據不足以作出任何有關可接受性的結論，還需繼續實驗以收集更多的數據，以便對分析誤差作出較好的估量 76、可信區間判斷指標計算公式：誤差類別 實驗 接受指標EUEA隨機誤差 重復性 1.96STMUEA比例誤差 回收 |RU或L-100|U (XC /100)EA*恒定誤差 干擾 |d|+t(sd)/NUEA* 系統誤差 對比 | (a+bXcW)-XC| UEA*總誤差 重復性和 (1.96STMU)2+W2 (1.96STML)2+W2 方法對比 +|a+bXc)-XC|EA#*特例:當RU100RL,PEL=0 *特例:當t(sd)/NL/偏差/,CEL=0*特例:當(a+bXc+W)XC (a+bXc-W),CEL=0# 特例:當SEL=0,TEL=REL 77內容原理、試劑配制、所用器材、操作步驟等結論可接受或不被接受后期工作評價后實驗和應用階段。（三）評價實驗書面報告78第五節 實驗的診斷性能評價 方法的選擇 方