1、Good is good, but better carries it.精益求精，善益求善。CRISPR及其在原核生物防御系統中作用的研究進展-CRISPR及其在原核生物防御系統中作用的研究進展摘要近來在眾多原核生物的基因組的分析中，發現一類成簇的、有規律間隔的短回文重復序列（clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats，CRISPR）結構家族。CRISPR由一類DNA重復單元所構成，在功能上與DNA的重組、修復及原核生物的免疫防御系統關系密切。通過對于CRISPR及其相關系統（CASs）基因的比較性分析，CRISPR獨特的結構和功能

2、引起人們的廣泛關注。實驗表明CASs的插入序列來源于細胞內的許多染色體外遺傳物質，并且以一種類似于真核生物中RNA干擾（RNAi）系統的機制，在原核生物抵抗入侵的噬菌體和質粒的防御系統中發揮著重要作用。本文綜述了CRISPR系統的基本結構、多樣性、作用機理及其區分自我與非我的機制，并對CRISPR研究和應用前景進行了展望。關鍵詞：CRISPR；原核生物；免疫成簇的規律間隔的短回文重復序列（clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats，CRISPR）是一類獨特的DNA直接重復序列家族，廣泛存在于眾多原核生物基因（大多數的細菌和幾乎所有的

3、古細菌）中1。自2002年首次被人們所定義以來，CRISPR一直以其奇特的結構與特殊的功能吸引著各國科學家們的共同關注。它的結構非常穩定，長度約2550bp的重復序列（這里我們稱為repeats）被單一序列（這里我們稱為spacers）間隔2。根據不同的研究結果，人們對CRISPR系統的生物學功能曾有過種種推測，最近人們發現Cas系統（CRISPR-associatedsequencessystem，CASs）在原核生物中表現出某種獲得性免疫功能，幫助細菌抵御病毒的侵犯，并和DNA的重組與修復有關3。2005年，3個研究小組分別發現一些CRISPR的間區序列是來自噬菌體或質粒等染色體外的序列，

4、據此推斷CRISPR系統能使宿主獲得抵抗噬菌體、質粒等外來DNA入侵的免疫能力4-6。2007年，Barrangou等7通過實驗證實了CRISPR系統的這一生物學功能。1CRISPR系統的基本結構隨著細菌基因組學的發展，CRISPR的基本結構已逐漸被確定，由短的高度保守的repeat與長度相似的非重復的spacers序列間隔排列11所組成（圖1-A）。Repeats是一組高度保守的短小序列，其長度一般為25至50個堿基對。Spacers與repeats的長度相近，約為26到72個堿基對。此外一組約由410個保守基因組成的序列被發現于CRISPRs周圍，我們稱之為CASs（CRISPR-asso

5、ciatedsequences，CASs）11。在CAS蛋白中已鑒定出核酸內切酶、核酸外切酶、螺旋酶、RNA-和DNA-結合等結構域，因此，認為CAS蛋白參與CRISPR的轉錄、加工和外來基因序列的降解等過程3。圖12CRISPR統的廣泛分布和多樣性在已測序的約40%細菌和90%古細菌基因組中至少存在1個CRISPR座位(locus)，古細菌詹氏甲烷球菌(Methanocaldococcusjannaschii)中存在18個CRISPR座位，是目前已研究的原核生物中最多的8。每個CRISPR座位具有幾個到幾百個R-S重復單位(圖1-A)，平均為66個，目前記錄最高的是Chloroflexuss

6、p。Y400fl(4個CRISPR座位中的1個具有374個R-S重復單位)和Verminephrobactereiseniae(249個)2,8cas基因多達45個家族9，根據CAS蛋白的序列同源性、組成情況和功能，可將CRISPR系統分為8個亞型:Ecoli、Ypest、Nmeni、Dvulg、Tneap、Hmari、Apern和Mtube，各亞型通常具有26個亞型特異的cas基因，在沒有CRISPR系統的基因組中則不存在相關基因8。cas1cas6這6個家族廣泛存在于不同的CRISPR亞型，被認為是核心cas基因，其中只有cas1和cas2家族存在于所有的CRISPR亞型，因此，cas1和

7、cas2家族基因也被用作鑒定CRISPR系統的分子標記10。此外，間區序列(S)也具有極其豐富的多樣性，Horvath等12在嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophilus)的124個菌株中發現了3626個間區序列，分布在3個CRISPR座位，其中，77%、16%和7%的S序列分別與噬菌體、質粒和嗜熱鏈球菌基因組序列具有同源性。在Bacillusthuringiensis菌YBT-1520和CT-43菌株的染色體上均沒有鑒定出CRISPR系統，而在YBT-1520菌株的大質粒pBMB293和CT-43菌株的大質粒pCT283上各存在2個CRISPR座位。pBMB293的CRIS

8、PR-1座位包含10個間區序列，其中的5個分別與已知噬菌體GIL16c和Bam35c、質粒pGIL01和pAH187、HalothermothrixoreniiH168的染色體有很高的序列同源性；CRISPR-2座位包含5個間區序列，只有1個與已知的質粒序列(pAH187)具有同源性。3SpacerDNA的來源CRISPR廣泛存在于原核生物（如古細菌、革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細菌），并在其生理和種族發生過程中發揮著多重功能13,14。在來源于不同基因組的CRISPR之中，repeats所表現出的相似性是有限的，而保守基序spacers卻是相同的，即使是在親緣關系較遠的古細菌和細菌中也是如此4,1

9、5。此前，Mojica等將這類Spacers都描述為特有的獨一無二的序列，但最近的研究越來越傾向于另一種假設：CRISPR的插入序列來源于一些已存在于細胞中的序列16。通過檢測發現，在許多株群，CRISPR中的spacers與細胞中其它遺傳成分存在著高度的相似性。關于CRISPR插入片段的來源有如下幾種：約65與噬菌體和結合性質粒存在相關，其余的35與染色體序列有關而與外緣DNA之間沒有關系。之后的一系列研究使我們更清晰的了解到CRISPR的spacer元件是染色體外遺傳物質入侵細菌后的殘留體，他們很可能通過編碼一類anti-senseRNA為細胞提供了一種對抗噬菌體感染甚至是更廣泛的外源基因

10、侵染的免疫能力17。4CRISPR的作用機理4.1新間區序列的獲得在噬菌體等入侵宿主菌后，CRISPR系統會從外來序列中選取一段序列作為新的間區序列，加工成新的R-S序列后以非同源重組的方式增加到CRISPR簇內，從而使宿主獲得抵抗相應噬菌體等再次入侵的免疫能力8，這一現象也得到實驗證實7。新的R-S序列幾乎總插入到前導序列和原來的第一個R區之間(圖1-B)，因此，前導序列中可能存在相關蛋白(可能是CAS蛋白)的識別位點，在增加新R-S序列過程中起定位的功能。CRISPR系統從噬菌體等基因組中選取新的間區序列并不是隨機的。事實上，多個研究小組已經在噬菌體、質粒中發現了一些稱為前間區序列(pro

11、tospacer)的序列，并且在其附近鑒定出一些小的前間區序列鄰近基序(protospaceradjacentmotifs，PAMs)。不同CRISPR亞型識別的PAM基序具有亞型特異性18。目前，有哪些蛋白質參與PAM基序的識別、前間區序列的選取、間區序列長度如何確定等方面的具體機制尚不清楚。4.2CRISPR的轉錄與加工研究表明，CRISPR簇首先轉錄為長的轉錄體，即前crRNA，然后逐步被加工成小的crRNA。多數情況下，只有CRISPR簇的編碼鏈被轉錄和加工10但在古細菌Sulfolobus屬19和嗜熱鏈球菌7，CRISPR簇的2條鏈都可以被轉錄。在大腸桿菌K12菌株中，CRISPR簇

12、的前crRNA與CAS蛋白CasABCDE形成的Cascade復合物結合，其中，CasE的功能是將前crRNA切割加工成crRNA。成熟的crRNA分子一般包含5-端為89nt的R區、S區和3-端稍長且更多樣化的R區20(圖1-C)。在超嗜熱菌強烈熾熱球菌(Pyrococcusfuriosus)中，Cas6的功能與CasE相同，Cas6是金屬離子依賴型的核酸內切酶，與CRISPR的重復序列5-端特定基序結合并在重復序列的3-端將其切開21。CRISPR簇及cas基因的轉錄受到宿主內多種因素的調控22。在大腸桿菌中，類組蛋白擬核構造蛋白(histone-likenucleoidstructuri

13、ngprotein，H-NS)能降低CRISPR系統抵抗噬菌體的能力23，而轉錄因子LeuO能解除H-NS的抑制作用24。研究表明，H-NS能與CRISPR簇及cas基因的啟動子區結合，抑制CRISPR簇及cas基因的轉錄(圖1-C)，一方面，CRISPR簇被轉錄的前crRNA減少了，另一方面，CAS蛋白特別是CasE的減少又導致將半衰期短的前crRNA加工成更穩定的crRNA的能力降低23，從而導致CRISPR系統抵抗噬菌體的能力降低。4.3CRISPR系統介導的沉默嗜熱鏈球菌在受噬菌體侵染后，CRISPR簇新獲得的間區序列有的來自噬菌體DNA的編碼鏈，有的來自模板鏈7；無論用噬菌體的編碼鏈

14、還是用模板鏈作為人工設計的間區序列，都能有效地使大腸桿菌獲得抗噬菌體的能力20；表皮葡萄球菌的1個CRISPR間區序列與結合轉移質粒的切口酶(nickase)具有同源性，而切口酶只在結合轉移的供體菌中發揮功能，但CRISPR系統能使供體菌和受體菌都失去結合轉移能力8。綜合這些研究結果，不難看出crRNA的作用機理不同于反義RNA，應該是直接作用于DNA。同時，前間區序列鄰近基序PAM不僅是選取新間區序列的識別位點，也是crRNA作用于外來DNA的靶標之一4。強烈熾熱球菌的Cascade復合物包括多個Cmr型的CAS蛋白，由Cas6加工成的前導RNA與該復合物結合后繼續被加工，即得到成熟的psi

15、RNA(prokaryoticsilencingRNA)25。Hale等進行的體外實驗表明，單鏈的psiRNA-Cmr復合物能位點特異地切割RNA而不能作用于DNA，而且切割位點總位于psiRNA的3-末端往前14nt。這種作用機理與真核生物的siRNA極其相似，只是還沒有psiRNA作用于天然靶標(來自噬菌體、質粒的轉錄體)的體內證據26。因此，前crRNA加工為成熟的crRNA后，是直接作用于DNA還是RNA，至今仍處于爭論期，或許二者兼而有之，但誰主誰次尚不清楚。4.4自我與非我的區分一般情況下，免疫系統能很好地區分自我與非我，從而快速產生針對外來成分的免疫反應，同時避免產生自身免疫。M

16、arraffini等通過向敲除了CRISPR簇的表皮葡萄球菌菌株中回補不同的CRISPR簇的突變體，并轉入帶有前間區序列及其鄰近基序PAM(進行了個別重要堿基的替換)的外來DNA序列，他們發現成熟crRNA的5-端重復序列(R區)在保護自身CRISPR簇不被切割時起主要作用，也暗示成熟crRNA5-端的均質性(5-端R區為89nt，3-端R區更長且多變)對crRNA發揮功能的重要性(圖2)；同時，外來DNA中的前間區序列鄰近基序PAM在區分自我與非我的過程中也起關鍵作用。值得關注的是，Stern等最近發現了自靶向的間區序列(self-targetingspacers)。他們分析了來自330種含

17、CRISPR系統的原核生物的23550個間區序列(S區)，發現每250個間區序列中就有1個是自靶向的，所研究的330種原核生物中有18%存在自靶向的間區序列。由于缺乏保守性，而且在自靶向間區序列的附近存在大量已退化的重復序列，因此，他們認為存在自靶向的間區序列不是其他調控機制而是一種自身免疫機制28。圖2crRNA區分自我與非我的機制5展望綜上所述，深入研究CRISPR系統不僅具有重大的理論意義，而且具有廣闊的應用前景。CRISPR系統間區序列的多樣性和特異性已被廣泛應用于基因分型、流行病學研究、分析不同人體內的細菌菌群差異、檢測環境中的噬菌體等科學研究。利用其作用機制的獨特性，CRISPR系

18、統也已用于構建噬菌體抗性的工業生產菌株。此外，CRISPR系統還可能在以下幾方面得到廣泛應用：作為遺傳操作的工具，用于靶向基因沉默；crRNA-Cascade復合物可用于體外DNA、RNA分子的位點特異性切割；在臨床上，通過限制質粒結合轉移而控制藥物抗性基因在致病菌之間擴散等。盡管發現CRISPR系統已有20多年，但直到最近36年才逐步揭開其神秘面紗。因此，還存在許多值得進一步研究的問題：crRNA是直接作用于DNA還是RNA；psiRNA介導的RNAi作用在原核生物中是否普遍存在；新間區序列的獲得機制已得到初步闡明，但間區序列的丟失機制尚不明了；形成crRNA-Cascade復合物的動態過程

19、等。這些未知的特性有待更深入的研究加以揭示。同時也更加確信關于CRISPR結構與功能的研究將有助于人們對于原核生物界乃至整個生物界的進化和特性的認識。參考文獻1LillestolPK,RedderP,BarrettRA,etal.AputativeviraldefencemechanisminarchaealcellsJ.Archaea,2006,2（1）:5972.2BlandC,RamseyTL,SabreeF,etal.CRISPRrecognitiontool（CRT）:atoolforautomaticdetectionofclusteredregularlyinterspacedp

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