1、遺傳修飾動(dòng)物模型在藥物安全性評(píng)價(jià)中的應(yīng)用1轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的定義相對(duì)于野生型動(dòng)物而言，其基因組被遺傳修飾的動(dòng)物有用遺傳修飾動(dòng)物 (Genetic altered animal)一詞2轉(zhuǎn)基因動(dòng)物分類(lèi)用于基礎(chǔ)生物學(xué)研究 - 基因的結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系 - 細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)的相互作用 - 胚胎發(fā)育和調(diào)控等生命科學(xué)中的基本問(wèn)題用于育種改良 -提高動(dòng)物的生長(zhǎng)速度 -改善肉質(zhì)營(yíng)養(yǎng) -增強(qiáng)抵抗疾病的能力用于生產(chǎn)目的蛋白、生物反應(yīng)器 - tPA，凝血因子用于各種疾病動(dòng)物模型 -癌癥轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型 -免疫缺陷動(dòng)物模型等3轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型安全性評(píng)價(jià)優(yōu)勢(shì)對(duì)受試物的敏感性增加。 -如帶有激活Pim-l腫瘤基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，對(duì)乙基硝

2、基脲的致癌作用，較相應(yīng)的非轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，其敏感性提高了25倍。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型用于安全評(píng)價(jià)，節(jié)省時(shí)間，縮短實(shí)驗(yàn)進(jìn)程，減少動(dòng)物的用量，符合3R原則 -傳統(tǒng)的致癌性實(shí)驗(yàn)采用普通大小鼠，實(shí)驗(yàn)長(zhǎng)達(dá)2年，時(shí)間長(zhǎng)，需要的動(dòng)物數(shù)量大，采用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型，可以在6個(gè)月內(nèi)得知結(jié)果，顯著節(jié)省時(shí)間 -采用TgPVR21轉(zhuǎn)基因小鼠替代猴進(jìn)行神經(jīng)毒性測(cè)試，測(cè)試效果與猴一致4國(guó)際獲得廣泛認(rèn)可的癌癥動(dòng)物模型TG:ACrasH2p53+/-XPA-/-TG:AC，p53+/-和rasH2模型在美國(guó)或日本已實(shí)現(xiàn)商品化，并獲得ICH等國(guó)際機(jī)構(gòu)的認(rèn)可5TG:AC小鼠模型的建立和生物學(xué)特性人類(lèi)正常的ras基因家族包括c-Ha-ras，c

3、-Ki-ras和c-N-ras三個(gè)成員，其中c-Ha-ras位于11號(hào)染色體上ras基因編碼細(xì)胞增殖信號(hào)傳導(dǎo)途徑中的一個(gè)189個(gè)氨基酸的關(guān)鍵蛋白分子P21蛋白，是生長(zhǎng)因子受體與下游分子聯(lián)系的必經(jīng)之路，其活性可以通過(guò)與GTPGDP的交換來(lái)調(diào)節(jié)P21蛋白在細(xì)胞分化和抑制細(xì)胞凋亡中扮演很重要的作用ras基因在第12、13、59、61位氨基酸發(fā)生突變時(shí)，其編碼的蛋白活性增高，易誘導(dǎo)癌變6TG:AC小鼠模型的建立和生物學(xué)特性該模型是通過(guò)顯微注射的方法獲得的受精卵來(lái)自近交系FVB小鼠轉(zhuǎn)基因表達(dá)的部位包括胚胎期的血液、肝和胎盤(pán)。此外在成年小鼠的骨髓中也有低水平的表達(dá)用佛波酯 (Phorbol ester)處

4、理轉(zhuǎn)基因鼠，6個(gè)星期內(nèi)能誘導(dǎo)產(chǎn)生多種乳頭瘤，部分小鼠發(fā)生鱗狀細(xì)胞瘤，多數(shù)情況下產(chǎn)生惡性肉瘤7RasH2轉(zhuǎn)基因鼠模型的建立及生物學(xué)特性（一）轉(zhuǎn)入該模型的DNA為人的正常ras基因 (c-Ha-ras)，全長(zhǎng)大小為6.8 Kb轉(zhuǎn)化型ras基因最初是從日本病人惡性黑色素瘤組織中獲得的，被保留在裸鼠NIH 3T3成纖維細(xì)胞中擴(kuò)增8RasH2轉(zhuǎn)基因鼠模型的建立及生物學(xué)特性（二）該模型十分穩(wěn)定，從未出現(xiàn)過(guò)應(yīng)答消失特別適合對(duì)食道癌研究rasH2轉(zhuǎn)基因模型誘發(fā)腫瘤的器官主要限于肺、皮膚和前胃2000年又建立了c-Ha-ras轉(zhuǎn)基因大鼠模型，命名為Hras128。該大鼠轉(zhuǎn)基因模型不僅可用于篩選致癌物和癌癥誘導(dǎo)因

5、子，還可用于篩選抑制癌癥的藥物9c-Ha-ras轉(zhuǎn)基因小鼠的檢測(cè)標(biāo)記基因斑點(diǎn)雜交和PCR擴(kuò)增Southern雜交Northern雜交表達(dá)產(chǎn)物檢測(cè)10p53+/-小鼠模型的建立及生物學(xué)特性p53蛋白首先發(fā)現(xiàn)于SV40病毒轉(zhuǎn)化的嚙齒類(lèi)動(dòng)物細(xì)胞C57BL/6轉(zhuǎn)基因小鼠模型在6個(gè)月時(shí)易自發(fā)產(chǎn)生多種腫瘤，但胚胎發(fā)育正常這一模型從整體動(dòng)物水平證實(shí)了p53基因與胚胎發(fā)育無(wú)直接相關(guān)性，但它的缺失使動(dòng)物易發(fā)生腫瘤類(lèi)疾病11XPA-/-小鼠模型的建立及生物學(xué)特性著色性干皮病 (Xeroderma pigmentosum, XP)是一種常染色體隱性遺傳病，受到日照后易發(fā)生皮膚癌和神經(jīng)綜合癥該模型是在NER基因成功克

6、隆的基礎(chǔ)上，以干細(xì)胞為基礎(chǔ)，通過(guò)基因敲出的方式構(gòu)建的該模型不僅僅對(duì)紫外線(xiàn)敏感，而且對(duì)一些致癌性化學(xué)物也非常敏感，能誘導(dǎo)產(chǎn)生多種內(nèi)臟腫瘤12轉(zhuǎn)基因動(dòng)物用于評(píng)價(jià)需要注意的問(wèn)題必須有完全的病理學(xué)檢查需要非轉(zhuǎn)基因小鼠或者野生型小鼠作為對(duì)照需要檢測(cè)轉(zhuǎn)入基因是否穩(wěn)定等實(shí)驗(yàn)周期可能超過(guò)6個(gè)月，也需要更多的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物13國(guó)際上轉(zhuǎn)基因動(dòng)物應(yīng)用的指導(dǎo)原則1995年FDA “生產(chǎn)和檢驗(yàn)源于轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的人用生物制品的指導(dǎo)原則”(Points to Consider in the Manufacture and Testing of Therapeutic Products for Human Use Derived f

7、rom Transgenic Animals)。該指導(dǎo)原則規(guī)定了首建動(dòng)物的創(chuàng)建和繁殖、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物及其后代的飼養(yǎng)與維護(hù)等基本準(zhǔn)則歐盟EMEA (European Medicine Evaluation Agency)通過(guò)其下屬機(jī)構(gòu)CPMP (Committee for Proprietary Medical Products)制定了內(nèi)容相似的指導(dǎo)原則。ICH在著手修訂相應(yīng)的指導(dǎo)原則，以促進(jìn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型在致癌性實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用14FDA制定的指導(dǎo)原則轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的定義轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的飼養(yǎng)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的維持轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的使用使用后的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的處置15轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的定義通過(guò)導(dǎo)入重組DNA的方法制作的人為修飾動(dòng)物，

8、包括兩類(lèi)：一種為可遺傳的修飾，一種為體細(xì)胞非遺傳修飾第一類(lèi)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物包括通過(guò)對(duì)配子、早期胚胎或者胚性干細(xì)胞系的體外操作獲得可通過(guò)生殖細(xì)胞遺傳的動(dòng)物第二類(lèi)包括通過(guò)質(zhì)粒注射、病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移等基因治療手段獲得的體細(xì)胞改變的動(dòng)物轉(zhuǎn)基因 (Transgene) 指的是一段導(dǎo)入體細(xì)胞的或者穩(wěn)定整合在宿主基因組中并能穩(wěn)定遺傳給下一代的重組DNA16首建轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的建立及性質(zhì)分析配子或者胚性細(xì)胞供體動(dòng)物及代孕動(dòng)物的來(lái)源及歷史必須明確轉(zhuǎn)基因的方法需清楚必須寫(xiě)明首建轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的鑒定方法，建立轉(zhuǎn)基因鑒定的靈敏度檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，區(qū)分轉(zhuǎn)入外源基因但不表達(dá)目標(biāo)產(chǎn)物的動(dòng)物與未進(jìn)行轉(zhuǎn)基因操作的動(dòng)物當(dāng)將轉(zhuǎn)基因動(dòng)物作為食品供人食用

9、時(shí)，必須符合FDA (CVM或CFSAN)或者FSIS的管理規(guī)定一旦建立了首建轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，轉(zhuǎn)基因的穩(wěn)定性必須持續(xù)監(jiān)測(cè)17建立持續(xù)可靠的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物源 (首建轉(zhuǎn)基因動(dòng)物系)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物應(yīng)建立主轉(zhuǎn)基因動(dòng)物庫(kù) (Master transgenic bank, MTB)工作轉(zhuǎn)基因動(dòng)物庫(kù) (Manufactures working transgenic bank，MWTB)18轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的生產(chǎn)與選擇應(yīng)該建立標(biāo)準(zhǔn) -歷史來(lái)源，每一只轉(zhuǎn)基因動(dòng)物能溯源到它的首建轉(zhuǎn)基因動(dòng)物 -產(chǎn)地、出生日期、用途、疾病發(fā)生時(shí)間及處置方法詳細(xì)記錄轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的育種方法 -任何人工受精、胚胎移植、精子采集與存儲(chǔ)方法以及所采用的標(biāo)準(zhǔn)建立生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)19轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的維持疾病監(jiān)控圈養(yǎng)設(shè)施生產(chǎn)群中轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的淘汰與處置哨兵動(dòng)物的設(shè)置20轉(zhuǎn)基