1、第九章 植物組織培養技術及其在育種中的應用植物組織培養技術是現代植物生物技術的基本技術。一、 現代生物技術及其基本概念（一）生物技術概念 生物技術（Biotechnology)，有時也稱生物工程（Bioengineering）, 是指人們以現代生命科學為基礎，結合先進的工程技術手段和其他基礎科學的原理，按照預先的設計改造生物體或加工生物原料，為人類產出所需產品。生物技術是一門綜合性學科。現代生物技術已成功地應用于植物育種中。（二）生物技術的種類基因工程（Gene Engineering）細胞工程（Cell Engineering ）酶工程（Enzyme Engineering ）發酵工程（Fe

2、rmentation Engineering ）蛋白質工程（Protein Engineering ）（三）細胞工程 細胞工程就是在細胞水平研究開發、利用各類細胞的工程。亦即人們根據科學設計改變細胞的遺傳基礎，通過無菌操作，大量培養細胞、組織乃至完整個體的技術。（四）克隆概念分離基因的技術；擴增基因的技術；將單一細胞擴增成細胞群體的技術；將一個生命體復制成一個與之完全相同的新個體的過程；將單一個體擴增成一個遺傳上完全相同的群體。一個遺傳上來源完全相同的生物群體。二、植物組織培養的基本步驟1、植物細胞的全能性（Cell Totipotency） 一個植物細胞能產生一個完整植株的固有能力稱之為細胞

3、的全能性。2、植物離體分化的類型無菌短枝型叢生芽增殖型器官發生型胚狀體發生型原球莖發生型3、植物組織培養的特點培育材料經濟；培養條件可人為控制；生長周期短，繁殖率高；管理方便，利于自動化控制。5、植物組織培養的基本操作無菌操作技術細胞培養技術原生質體融合技術接種用具的滅菌 接種前，必須把用具放入接種室或箱內，初用接種室或箱時要用甲醛（一般市售分析純的有效成份為 36-38% 熏蒸5小時以上再開紫外光燈照射40-60分鐘，以后在每次接種之前，把要接種的試管或三角瓶放入接種室（箱）內，用5%的煤酚瓶皂溶液即來蘇爾（一般市售的有效成份為47-53%）或 5% 的石灰炭酸液噴霧消毒，再打開紫外光燈照2

4、0-40分鐘，這樣消毒后，再經30-40分鐘便可進行接種。 接種材料的表面滅菌 接種前花蕾或穗的徹底滅菌是杜絕污染的主要關鍵，先用70-75%的酒精浸泡10-15秒鐘或用酒精棉球擦兩遍，初步殺死表面所帶的微生物，放在10%的漂白粉液或飽和漂白粉液中浸泡15-30分鐘殺菌，然后用無菌水沖洗2-3次。 消毒過的穗子或花蕾用消毒紗布包好，待取花藥接種，注意，穗子或花蕾的操作要在無菌條件下進行。5、植物組織培養所需營養與環境條件（1）無機營養大量元素： 一般是指濃度大于0.5mmol/L.氮(N) 、磷(P) 、鉀(K) 、鈣(Ca) 、鎂(Mg) 、硫(S) 。微量元素： 包括鐵(Fe) 、銅(Cu

5、) 、鉬(Mo) 、鋅(Zn) 、鈉(Na) 、錳(Mn) 、鈷(Co) 、硼(B) 、碘(I)。（2）有機營養維生素、肌醇、氨基酸、有機添加物。（3）生長調節物生長素：2，4 - D、奈乙酸(NAA)、吲哚丁酸（IBA）、吲哚乙酸(IAA) 。細胞分裂素：激動素（KT）、6-芐基氨基嘌呤（6BA） 、玉米素（ZT）。赤霉素（GA） ：脫落酸（ABA） 、乙烯利（CEDP）。（4）瓊脂（5）能源和滲透壓（6）其他成分（7）溫度（8）光照（光強、光質）培養基的配制： 培養基母液的配制 ；配制培養基的步驟；培養基的分裝及滅菌。6、植物組織培養經歷的五個階段：（1）預備階段外植體的獲得；接種材料的消

6、毒處理；配制適宜的培養基；（2）誘導去分化階段（3）繼代增殖階段（4）生根成芽階段（5）移栽成活階段三、植物組織培養技術在育種中的應用種質資源保護；優良品種快速繁殖；誘發和離體篩選突變體；克服遠緣雜交困難；克服種子發育中的障礙；單倍體育種的技術環節基因工程的基礎技術（一）單倍體育種單倍體的概念及其特點 只含有一套染色體組的生物體； 被子植物的配子體世代。矮小性；不育性；全顯性。2. 單倍體植物在育種上的意義單倍體植物的直接利用；克服雜種分離，縮短育種年限；快速獲得異花授粉植物的自交系；單倍體植物的誘變育種；克服遠緣雜種不孕性與不穩定的現象；3. 單倍體植株和愈傷組織的培養（1）單倍體材料的采集

7、 單倍體育種的首要問題是如何獲得大最的單倍體植株。據現有的研究材料，用花藥培養產生單倍體植株有兩個途徑: 第一是在離體培養的花藥中，花粉經過類似胚胎發育的過程直接形成單倍體植物，如煙草、曼陀羅等。 第二是在離體培養的花藥中，花粉形成愈傷組織，再從愈傷組織分化出單倍體植株。（2）花藥的接種接種前的準備工作 接種和培養花藥是在無菌條件下進行的，所用的一切用具必須徹底滅菌。花粉發育時期的鑒定 適宜的花粉發育時期對于提高花粉誘導愈傷組織分化的頻率是很重要的，為此，進行花藥培養前，要用顯微鏡進行花粉發育時期的鑒定。 經顯微鏡檢查后，把花粉細胞的發育進期與花藥或花序的外部形態聯系起來，找出花粉單核期或單核

8、期的花蕾或花序的外部形態標志選取花藥進行接種培養。 （3）從愈傷組織分化成苗 誘導愈傷組織分化出根、莖、葉的方法是在愈傷組織長到1-3毫米大小（如小米大）時，即可轉移到誘導分化培養基上，促使分化長出植株。一般說來，愈傷組織如果先形成芽，隨后根自然會發生，如果先有根，以后不一定會出芽。因此，掌握芽分化的條件是十分重要的。 愈傷組織轉移培養工作是在無菌室或接種箱內進行的，轉移后愈傷組織培養在23-28恒溫室內，每日光照9-11小時，可用日光燈作輔助光，光強度在2000勒克斯以上。 在轉移愈傷組織時，應注意其極性，原來向上的一但轉移后的一但轉移后仍應向上，否則會影響生長，同時在轉移時，就避免沾帶過多

9、的培養基。 4. 染色體加倍處理方式：試管內進行；花粉植株定植后進行；藥劑處理；植株鑒定。 單倍體育種程序：材料采集 接種培養 誘導愈傷組織 獲得再生植株 染色體加倍 幼苗培育和品種選擇 （二）原生質體培養與體細胞雜交 常規雜交育種由于物種間難以逾越的天然屏障而舉步維艱。 科學家們受細胞全能性理論及組織培養成功的啟示，逐漸將眼光轉向細胞融合，試圖通過這種嶄新的手段沖破自然界的禁錮。原生質體的概念 植物細胞原生質體是指那些以去除全部細胞壁的細胞。 此時，細胞外僅由細胞膜包裹， 呈圓形只有在高滲溶液中才能相對穩定。 原生質體經適當處理，可與其他細胞融合成新的體細胞。2. 原生質體的特點比完整的細胞

10、更容易獲得外來遺傳物質，為實現異源遺傳物質轉化提供了較好的實驗材料。原生質體在一定條件下可以融合成雜種細胞，開辟了一條新的育種途徑。3. 發展概況1892， J. A. Klerker 用機械法獲得原生質體；1960，E.C. Cocking 用酶法首先從番茄根尖中分離出大量有活性的原生質體并通過培養再生出細胞壁形成再生植株;1960，G. Barski發現, 題細胞原生質體能融合在一起形成單核的、并能進行分裂的雜種細胞；1972，P.S.Carlon首次獲得煙草體細胞種間雜種。80s 此項技術在我國得到發展。4. 原生質體的制備（1）取材與滅菌（2）酶解 (纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶) （

11、3）分離 （沉淀法、漂洗法、滴洗法）（4）洗滌（5）鑒定（形態觀測、活性鑒定）原生質體的培養：細胞壁再生；細胞分裂；植株再生。5. 原生質體的融合化學法誘導融合按比例混合雙親原生質體- 滴加PEG- 滴加高鈣高PH值溶液- 洗滌原生質體溶液- 離心獲得原生質體溶液-篩選雜種細胞-再生雜種細胞。物理法誘導融合基本程序：原生質體的獲得；電擊融合；篩選雜種細胞；雜種細胞再生和完整植株的形成。6. 融合細胞的培養鑒定與篩選雜和細胞的顯微鏡鑒別；互補法鑒定雜和細胞；細胞與分子生物學法；植株形態的鑒別。（三）人工種子 人工種子即人為制造的種子，它是一種含有植物胚狀體或芽、營養成分、激素、及其他成分的人工膠

12、囊。其具有種子的功能，可直接用于田間播種。 1、人工種子的構成 人工種皮 胚 狀 體 人工胚乳2、人工種子的特點：（1）可以不受環境條件的限制，周年進行生產；（2）經人工無性繁殖產生，有利于保存該種系 的優良性狀；（3）成本低，適于田間機械化生產；（4）可根據需要調節胚乳成分。3、人工種子的制備（1）胚狀體的制備及其同步生長；（2）人工胚乳的制備；（3）配制包埋劑及人工包埋。人工種子包埋示意圖 4%海藻酸鈉 體細胞胚 包埋丸 2% CaCl 人工種子 水 4、人工種子的貯存與萌發 低溫、干燥、潔凈。（四）基因工程（一）基因工程的含義 按照人們的愿望， 進行嚴密的設計， 通過體外 DNA重組技術 和DNA轉移技術，有目的地改造生物種性， 使現有物種在短時間內趣于完善， 創造出新的生物類型。致癌農桿菌介導的Ti質粒載體轉化法2、重組DNA的直接轉化法微粒散射技術 (Particle bombardment)（二）基因工程的基本步驟1、目的基因的克隆與鑒定；2、植物表達載體的構建；3、植物的遺傳轉化；4、轉化細胞的篩選；5、轉基因植株的鑒定。基因基因克隆基因轉