1、項(xiàng)目四 絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶的電泳制備1 SHMT電泳制備方案的制定11212011423225第六組張家敏生藥1121第六組絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶的電泳制備簡介聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺（acrylamide，簡稱Acr）和交聯(lián)劑又稱為共聚體的N, N-甲叉雙丙烯酰胺（methylene-bisacrylamide，簡稱Bis）在加速劑和催化劑的作用下聚合交聯(lián)成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠，以此凝膠為支持物的電泳稱為聚丙烯酰胺凝膠電泳簡稱PAGE）。張家敏生藥1121第六組絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶的電泳制備與其他凝膠相比，聚丙烯酰胺凝膠有下列優(yōu)點(diǎn)：在一定濃度時(shí)，凝膠透明，有彈性，機(jī)械性能好?；瘜W(xué)性能穩(wěn)定，與被

2、分離物不起化學(xué)反應(yīng)。對(duì)pH和溫度變化較穩(wěn)定。幾乎無電滲作用，只要Acr純度高，操作條件一致，則樣品分離重復(fù)性好。樣品不易擴(kuò)散，且用量少，其靈敏度可達(dá)10-6g。凝膠孔徑可調(diào)節(jié)，根據(jù)被分離物的分子量選擇合適的濃度，通過改變單體及交聯(lián)劑的濃度調(diào)節(jié)凝膠的孔徑。分辨率高，尤其在不連續(xù)凝膠電泳中，集濃縮、分子篩和電荷效應(yīng)為一體，因而有更高的分辨率。張家敏生藥1121第六組絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶的電泳制備聚丙烯酰胺凝膠聚合原理及相關(guān)特性張家敏生藥1121第六組絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶的電泳制備張家敏生藥1121第六組絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶的電泳制備2凝膠孔徑的可調(diào)性及其有關(guān)性質(zhì)（1）凝膠性能與總濃度及交聯(lián)度的關(guān)系：凝膠

3、的孔徑、機(jī)械性能、彈性、透明度、粘度和聚合程度取決于凝膠總濃度和Acr與Bis之比。通常用T%表示總濃度，即100ml凝膠溶液中含有Acr及Bis的總克數(shù)。Acr和Bis的比例常用交聯(lián)度C%表示，即交聯(lián)劑Bis占單體Acr與Bis總量的百分?jǐn)?shù)。 根據(jù)有關(guān)實(shí)驗(yàn)研究，可知當(dāng)T%值固定時(shí)，Bis濃度在5%時(shí)孔徑最小，高于或低于5%時(shí)，孔徑卻相應(yīng)變大。為了在使用凝膠做實(shí)驗(yàn)時(shí)有較高的重現(xiàn)性，制備凝膠所用的Acr濃度，Bis和Acr的比例、催化劑的濃度、聚合反應(yīng)的溶液pH值、聚膠所需時(shí)間等能影響泳動(dòng)率的因子都必須保持恒定。張家敏生藥1121第六組絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶的電泳制備（2）凝膠濃度與被分離物分子量的

4、關(guān)系：由于凝膠濃度不同，平均孔徑不同，能通過可移動(dòng)顆粒的分子量也不同，在操作時(shí)，可根據(jù)被分離物的分子量大小選擇所需凝膠的濃度范圍。也可先選用7.5%凝膠（標(biāo)準(zhǔn)膠），因?yàn)樯矬w內(nèi)大多數(shù)蛋白質(zhì)在此范圍內(nèi)電泳均可取得較滿意的結(jié)果。張家敏生藥1121第六組絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶的電泳制備張家敏生藥1121第六組絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶的電泳制備SDS的影響因素1. 帶電顆粒的性質(zhì)凈電荷多少、顆粒大小及形狀。一般凈電荷多，直徑小而且近于球狀，則泳動(dòng)速度快，反之則慢。張家敏生藥1121第六組絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶的電泳制備2. 電場(chǎng)強(qiáng)度（電位梯度）指單位長度（cm）支持物體上的電位降，它對(duì)泳動(dòng)度起著十分重要的作用。一般

5、電場(chǎng)強(qiáng)度越高，帶電顆粒移動(dòng)速度越快。根據(jù)電場(chǎng)強(qiáng)度可將電泳分為低壓（常壓）電泳100500V，電場(chǎng)強(qiáng)度為210V/cm，分離時(shí)間需要數(shù)小時(shí)、數(shù)天或更長。高壓電泳5001000V，電場(chǎng)強(qiáng)度20200V /cm，電泳時(shí)間短。有時(shí)僅需幾分鐘，主要用于氨基酸、肽、核苷酸。由于電壓增高電流增大需要冷卻裝置。張家敏生藥1121第六組絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶的電泳制備3. 溶液的PH溶液的pH值決定帶電顆粒的解離程度。也決定物質(zhì)所帶凈電荷的多少。對(duì)氨基酸、蛋白質(zhì)等兩性電解質(zhì)而言，溶液PH值離等電點(diǎn)越遠(yuǎn)，顆粒所帶凈電荷越多，電泳速度越快。反之越慢。血清中：白蛋白pI 4.0；2球蛋白 pI 5.06；球蛋白 pI 5

6、.1；球蛋白 pI 7.1。在pH 8.6的緩沖液中電泳時(shí)，都帶負(fù)電荷，其泳動(dòng)速度為：白蛋白2球蛋白球蛋白球蛋白。為了利于分離蛋白質(zhì)混合液，應(yīng)選擇一種使各種蛋白質(zhì)所帶電荷差異明顯的pH值。張家敏生藥1121第六組絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶的電泳制備4. 溶液的離子強(qiáng)度在保持足夠緩沖能力的前提下，離子強(qiáng)度要求最小。溶液離子強(qiáng)度越高，帶電顆粒泳動(dòng)速度越慢，反之越快。通常選擇在0.050.1mol/l 之間。緩沖溶液離子強(qiáng)度可通過下列公式計(jì)算：I=0.5cZ2；I 溶液的離子強(qiáng)度； c 離子濃度； Z 離子價(jià)數(shù)。如:0.154 mol/l 的NaCl溶液的離子強(qiáng)度。I=0.5（0.15412+0.15412

7、）=0.154。張家敏生藥1121第六組絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶的電泳制備5. 電滲作用在有支持物的電泳時(shí)影響電泳的另一個(gè)重要因素是電滲作用。電滲作用：在電場(chǎng)中，溶液對(duì)固體支持物的相對(duì)移動(dòng)。電滲作用根據(jù)支持介質(zhì)的不同而產(chǎn)生不同程度和不同方向的電滲流動(dòng)。因此電滲作用與電泳速度關(guān)系密切。張家敏生藥1121第六組絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶的電泳制備電泳基本原理蛋白質(zhì)在十二烷基硫酸鈉（SDS）和巰基乙醇的作用下，分子中的二硫鍵還原，氫鍵等打開，形成按1.4gSDS/1g蛋白質(zhì)比例的SDS-蛋白質(zhì)多肽復(fù)合物，該復(fù)合物帶負(fù)電，故可在聚丙烯酰胺凝膠電泳中向正極遷移，且主要由于凝膠的分子篩作用，遷移速率與蛋白質(zhì)的分子量大小

8、有關(guān)，因此可以濃縮和分離蛋白質(zhì)多肽。聚丙烯酰凝膠電泳分離蛋白質(zhì)多數(shù)采用一種不連續(xù)的緩沖系統(tǒng)，主要分為較低濃度的成層膠和較高濃度的分離膠，配制凝膠的緩沖液，其pH值和離子強(qiáng)度也相應(yīng)不同，故電泳時(shí)，樣品中的SDS-多肽復(fù)合物沿移動(dòng)的界面移動(dòng)，在分離膠表面形成了一個(gè)極薄的層面，大大濃縮了樣品的體積，即SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳的濃縮效應(yīng)。張家敏生藥1121第六組絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶的電泳制備張家敏生藥1121第六組絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶的電泳制備張家敏生藥1121第六組絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶的電泳制備張家敏生藥1121第六組絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶的電泳制備張家敏生藥1121第六組絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶的電泳制備張家敏

9、生藥1121第六組絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶的電泳制備張家敏生藥1121第六組絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶的電泳制備試劑1、30%凝膠貯備液：稱取29g 丙烯酰胺（Acr）和1g 甲叉-雙丙烯酰胺（Bis），加蒸餾水至100ml，濾紙過濾貯存。2、10% SDS：稱取SDS 10g 加蒸餾水至100ml。3、10%過硫酸胺（AP）4、N，N，N，N四甲基乙二胺（TEMED）5、5電泳緩沖液：于900ml蒸餾水中分別加入15.1g Tris、94g甘氨酸、5g SDS，混勻后加蒸餾水至1 000ml。6、1.5mol/L Tris-HCl(pH8.8)和1.0mol/L Tris-HCl(pH6.8)7、電泳加樣

10、緩沖液張家敏生藥1121第六組絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶的電泳制備器材移液槍垂直電泳槽電泳儀移液管張家敏生藥1121第六組絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶的電泳制備操作步驟1、配制分離膠濃度8%、體積15mlH2O 6.9ml30%凝膠貯備液 4.0ml1.5mol/L Tris-HCl(pH8.8) 3.8ml10%SDS 0.15ml10%過硫酸胺 0.15mlTEMED 0.01ml張家敏生藥1121第六組絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶的電泳制備2、一旦加入TEMED，混勻后立即小心地將分離膠注入準(zhǔn)備好的玻璃板間隙中，為成層膠留有足夠空間。用毛細(xì)管輕輕在其頂層加入幾毫升正丁醇，以阻止空氣中的氧氣對(duì)凝膠聚合的抑制作用。3、

11、聚合完成之后，倒掉覆蓋液體，用去離子水洗凝膠上部數(shù)次，盡可能用吸水紙吸干頂端的殘存液體。張家敏生藥1121第六組絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶的電泳制備4、配制5%成層膠5ml，插入梳子，小心避免混入氣泡，垂直放置室溫下。H2O 3.4ml30%凝膠貯備液 0.83ml1.0mol/Ltris-HCl(pH6.8) 0.63ml10%SDS 0.05ml10%過硫酸胺 0.05mlTEMED 0.01ml張家敏生藥1121第六組絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶的電泳制備5、在成層膠聚合時(shí)，將樣品與加樣緩沖液混勻，100加熱3min。6、成層膠聚合完成后，用去離子水沖洗梳孔以除去未聚合的丙烯酰胺，將凝膠放入電泳槽上。7、加