1、實驗三 家兔頭孢呋辛酯/頭孢呋辛鈉單次給藥藥代動力學研究（樣本測定）藥代動力學實驗實驗目的1. 掌握血漿生物樣本前處理方法。2. 掌握高效液相色譜法（HPLC）的操作方法和注意事項。3. 加深理解如何保證生物樣本分析結果的可靠性、重現性。實驗原理生物樣品分析質量的保證 應在生物樣品分析方法驗證完成之后開始測試未知樣品。每個未知樣品一般測定一次，必要時可進行復測。藥代動力學比較試驗中，來自同一個體的生物樣品最好在同一分析批中測定。 每個分析批應建立標準曲線，隨行測定高、中、低3個濃度的質控樣品，每個濃度至少雙樣本，并應均勻分布在未知樣品測試順序中。當一個分析批中未知樣品數目較多時，應增加各濃度質

2、控樣品數，使質控樣品數大于未知樣品總數的5%。質控樣品測定結果的偏差一般應小于15%，最多允許1/3質控樣品的結果超限，但不能在同一濃度中出現。 濃度高于定量上限的樣品，應采用相應的空白基質稀釋后重新測定。對于濃度低于定量下限的樣品，在進行藥代動力學分析時，在達到Cmax以前取樣的樣品應以零值計算，在達到Cmax以后取樣的樣品應以無法定量（Not detectable, ND）計算，以減小零值對AUC計算的影響。實驗原理1. 溶液配制(已配制） 精密稱取對乙酰氨基酚15 mg，加入溶液10 mL（甲醇：水=1:1）溶解，得濃度為1.5 mg/mL的儲備液，放4冰箱儲存。取對乙酰氨基酚儲備液10

3、0 L，加入溶液900 L（甲醇：水=1:1），得濃度為150 g/mL的內標液。實驗操作2. 血漿樣本預處理（1）待血樣（100 L） 完全解凍后，加入乙酰氨基酚內標液（150 g/mL）10 L，渦旋10s混勻。空白樣本不加內標.（2）加入甲醇300 L，渦旋1min，靜置3 min。（3）12000 rpm離心5 min，取上清液200 L常溫真空干燥12小時。（4）待溶劑揮干后，加入100 L甲醇水溶液（水：甲醇 = 8：2）溶解，渦旋1min，12000 rpm離心5 min。（5）取上清液60 L至有內趁管的進樣瓶（需檢查內趁管底部是否有氣泡，否則底部有氣泡影響進樣，有氣泡需甩一下

4、），進樣20 L。實驗操作實驗重復性及準確性最差的環節，影響實驗結果好壞的最重要的因素，是決定性的步驟。3. 色譜條件 流動相：0.05M磷酸二氫鉀：甲醇梯度洗脫，設置如下：檢測波長：271 nm 實驗操作時間（min）0.05M 磷酸二氫鉀：甲醇0-690:106-1275:2512-1590:104. 數據記錄與參數計算（1）分別記錄各時間點待測物及內標峰的面積。（2）將其代入標準曲線中（實驗一）計算濃度。（3）參數計算：采用非房室模型計算主要的藥代動力學參數，參見實驗四。實驗操作注意事項1. 注意有機溶劑（甲醇）的安全使用。2. 血樣從冰箱取出后須充分解凍再進行實驗，以免藥物分布不均勻。

5、3.仔細核對時間點，注意對EP管進行編號，避免不同時間點的樣品混淆。4. 由于加入的內標體積小（僅10 L），需加到液面以下并每次更換槍頭，避免樣品之間的污染。切記要加入內標。5. 真空干燥箱的規范使用：箱門關上，并關閉放氣閥，開啟真空閥，接通真空泵電源開始抽氣；使用結束，應先關閉真空閥，再關閉真空泵電源，再開啟放氣閥。6. 紫外檢測器是雙波長檢測的，請確認是271 nm波長檢測的數據方可拷貝。7. 數據拷貝時間：本周五（6月3日）下午14:00。8. 在Excel表中進行相關參數計算，并將該Excel文件于本周日（6月5日）晚上22:00前由班長或學委統一發送至zhonggp （鐘老師）（陳老師）單個文件命