1、研究技術（一）光學顯微鏡技術（二）電子顯微鏡技術（三）組織化學術（四）免疫組織化學術（五）原位雜交術（六）細胞和細胞化學定量術（七）組織培養術（八）放射自顯影術1 問 題 解決方法 觀察對象太小 放大 顯微鏡光線不能透過觀察對象 切片觀察對象缺乏反差 染色觀察對象生化成分不同 細胞化學 免疫組織化學觀察對象為生活狀態 培養2（一）光學顯微鏡技術1、一般光學顯微鏡2、熒光顯微鏡3、相差顯微鏡4、激光掃描共聚焦顯微鏡3（二）電子顯微鏡技術1、透射電子顯微鏡2、掃描電子顯微鏡4（三）組織化學術1、多糖2、脂類3、酶4、核酸5（四）免疫組織化學術（五）原位雜交術（六）細胞和細胞化學定量術1、顯微分光光

2、度測量術2、形態計量術3、流式細胞術（七）組織培養術（八）放射自顯影術6（一）光學顯微鏡術light microscope（LM）1 石蠟切片取材 Formalin 40%, 4%固定 Bouin Formalin 40% 25ml 苦味酸飽和水溶液 75ml 冰醋酸 5ml 脫水-乙醇、包埋-石蠟切片 6um脫蠟 二甲苯乙醇 水 染色 HE Hematoxylin： 核酸RER、 Ribosome Eosin： 蛋白、膜結構（mitochondria、 SER、lysosome）透明、封片78910111213141516171819202122232425262728293、涂片 血涂片

3、精液 痰液 培養細胞4、鋪片5、磨片 骨和牙需制成磨片、經染色后觀察3031323334353637（二）電子顯微鏡技術 電子顯微鏡（簡稱電鏡）的發明和使用，使組織胚胎學研究內容發生了深刻變化。光鏡分辨率為0.2um，放大倍數約為1000倍，而電鏡的分辨率為0.2nm，比光鏡高1000倍，可放大幾萬倍至幾十萬倍，因此電鏡能觀察到更微細的結構。在電鏡下所見的結構稱為超微結構(ultrastructure)。38 用于觀察細胞內部結構，標本制備比光鏡的要求更嚴格，組織塊要更新鮮，體積更小（1mm3），固定常用戊二醛和鋨酸。切片則用超薄切片機，制成5080nm的超薄切片，用醋酸鈾和檸檬酸鉛染色，然后

4、在電鏡下觀察并攝片。1、透射電鏡（transmission electron microscope）3940414243444546 用于觀察組織或細胞表面的微細結構，標本需經噴鍍金屬膜特殊處理，然后在掃描電鏡下觀察，在熒光屏上掃描成像，呈現富于立體感的表面圖像，如細胞表面的微絨毛、纖毛和細胞伸出的偽足等。2、掃描電鏡（scanning electron microscope)4748495051522、冰凍切片 組織置入液氮（-196）快速凍結，恒冷切 片機切片、染色。 更好保存細胞內酶的活性、蛋白質結構。 缺點：組織片厚，經冷凍后易破壞組織結構532、熒光顯微鏡（fluorescence

5、microscope） 由光源、濾光系統和顯微鏡三個部分組成。光源為高壓汞燈，可產生紫外光，標本中的自發熒光物質或經熒光素染色或標記的結構在紫外光激發下可產生各種顏色的熒光，以此來研究該熒光物質在細胞和組織中的分布。543、相差顯微鏡（phase contrast microscope） 用于進行細胞培養中活細胞的觀察，可使無色透明的細胞鏡下結構反差明顯，圖像清晰。554、激光掃描共聚焦顯微鏡（laser scanning confocal microscope） 是近年研制和應用的一種新型顯微鏡。它將激光束落在樣品上，并作移動掃描，對樣品內某種熒光標記的物質進行二維和三維的動態微量分析測定。

6、可用來研究活細胞內Ca2、 Na+和 K+等pH值的動態變化；細胞內各種細胞器、細胞骨架、核酸、蛋白質和受體等的定位和定量分析；細胞膜電位、膜通道及信息傳遞的檢測；利用激光對細胞結構或染色體作切割、分離和克隆等逐漸成為生物醫學研究中重要的研究手段。5657（三）組織化學術（histochemistry） 應用化學反應與物理反應原理檢測組織或細胞內某種化學成分并進行定位、定量及相關功能研究的技術。581、多糖 顯示多糖或蛋白多糖的常用方法是過碘酸雪夫反應(periodic acid Schiff reaction,PAS反應)。組織或細胞中的多糖被結合形成紫紅色沉淀物。此反應稱PAS陽性反應，P

7、AS陽性部位為多糖存在部位。5960612、脂類 標本用甲醛固定，冷凍切片，用油紅O、尼羅藍或蘇丹類染料染色，使組織和細胞中的脂類物質顯示相應顏色。亦可用鋨酸固定兼染色，脂類呈黑色。6263643、酶 酶細胞化學反應的基本原理是利用酶對其相應底物的水解、氧化等作用，使底物的反應產物被某種捕獲劑捕獲并在原位沉淀，形成有色的終產物，借此測定該酶在細胞內的分布及活性強弱。65664、核酸 顯示DNA的傳統方法是Feulgen反應（Feulgen reaction），組織切片或細胞涂片先經稀鹽酸處理，使DNA水解，醛基暴露，再用雪夫試劑處理，形成紫紅色反應產物。67（四）免疫組織化學術（immunoh

8、istochemistry） 利用免疫學抗原和抗體特異性結合的原理，檢測組織或細胞中的多肽和蛋白質等大分子物質的分布。為顯示抗原抗體復合物的存在，需進行抗體標記；用熒光素如異硫氰酸熒光素標記，可以在熒光顯微鏡下觀察，用膠體金標記，可以在電鏡下觀察，用辣根過氧化酶標記，則可在光鏡下或在電鏡下觀察。常用的方法有直接法、間接法和親和素-生物素復合物法（ABC法）等。686970熒光的觀察（按標本分類） 在熒光顯微鏡下觀察的標本，當然必須發出熒光，可是大多數標本本身不能發出熒光，因而必須用熒光色素處理過才能發出熒光。（A）自發熒光（B）二次熒光（C）抗體熒光技術71（A）自發熒光（不加染色） 有些物質

9、不加染色，也能發出熒光（自發熒光或原發熒光），但在醫學和生物學（細胞學、生物組織、培養體等）領域中，只有很少物質具有自發熒光，常采用后兩種方法。 測定物質的熒光光譜或者激發光譜，可以判定物質性質（熒光光度法）。 應用：生物學方面判定維生素，研究生物學上的生物源的胺。72（B）二次熒光（用化學染色） 非熒光性的物質（蛋白質、炭水化合物等）用熒光色素染色，由熒光色素產生熒光（二次熒光），以便進行觀察，對特定物體選擇合適的熒光色素，該物體就能和周圍的組織或細胞區別（分離）出來而可以觀察到。 應用：吖啶橙+核酸 金胺+結核菌 介子奎二噁因+染色體73（C）抗體熒光技術（用免疫染色） 利用特定的抗原必然

10、和特定的抗體相結合這一個事實，有意識地使帶熒光標記的抗體和標本中的抗原進行抗原/抗體反應，這樣兩者的結合體就能通過抗體的熒光觀察到。熒光顯微鏡最常用于抗體滎光技術進行觀察，并成為醫學、生物學很多領域中極為有用的工具。74Glial fibrillary acidic protein75熒光色素+物質 激發方法 吸收波長 輻射熒光（自發熒光）維生素A 紫外（UV） 325-345nm 470-490nm維生素B6 紫外（UV） 356 432 兒茶酚胺 紫（V） 410（405-415） 480（475-485）血清素（5-羥色胺） 紫（V） 390（385-400） 530（520-540）葉

11、綠素 蘭（B） 520 650-66076熒光色素+物質 激發方法 吸收波長 輻射熒光（二次熒光）芥子奎二噁因 蘭紫（BV） 450 500四環素+骨，牙 紫（V）或蘭（B） 390 560吖啶橙+DNA 蘭（B） 460 530吖啶橙+RNA 蘭（B） 460 650金胺+結核菌 蘭（G） 470 557福爾根反應+DNA 綠（G） 550 650溴化乙啶（EB）+DNA 綠（G） 545 605Propidium Iodide（PI）+DNA 綠（G） 530 615DAPI+A-T 紫外（U） 372 456Mithramycin+G-C 蘭紫（BV） 395 570Olivomycin

12、+G-C 蘭紫（BV） 430 545 77熒光色素+物質 激發方法 吸收波長 輻射熒光（抗體熒光技術） FITC 蘭（B） 495 525TRITC 綠（G） 555 580羅達明（Rhodamine） 綠（G） 568 597尼羅紅+溶酶體 蘭，綠（B、G） 485-530 525-605派若寧丫+線粒體 綠（G） 540 47078（五）原位雜交術（in situ hybridization） 通過檢測細胞內mRNA和DNA分子序列片段，原位顯示細胞合成某種多肽或蛋白質的基因表達。應用某種已知的并被標記的RNA或DNA片段即核酸探針（cRNA或cDNA），與細胞內的待測核酸（RNA或DN

13、A片段）進行雜交，通過標記物的顯示在光鏡和（或）電鏡下觀察目的mRNA或DNA的存在與定位。79標記胰島素cRNA探針，示胰島素mRNA陽性80（六）細胞和細胞化學定量術1、顯微分光光度測量術2、形態計量術3、流式細胞術811、顯微分光光度測量術（microspectrophotometry） 應用顯微光光度計，以物質分子對光波的選擇性吸收為基礎，在顯微鏡下對生物樣品中的化學物質進行定量分析。822、形態計量術（morphometry） 運用幾何學和統計學原理，對組織或細胞進行二維和三維的形態測量研究，如對細胞的數量、體積、表面積和周長的相對和絕對值的測量等。833、流式細胞術（flow cy

14、tometry） 是近年發展起來的細胞分類和定量研究技術，能對細胞的生物化學和生物物理特性進行快速定量測定，還可分選收集各種細胞。該技術的建立為細胞動力學、免疫學、血液學和腫瘤學等的研究提供了重要的研究手段。如細胞周期各時相細胞的比例，同步分析細胞內DNA、RNA和蛋白質的含量，T淋巴細胞亞群的分離和定量，淋巴細胞表面受體的分析，分離和濃縮造血干細胞，血細胞增殖情況，惡性腫瘤早期診斷，藥物作用機制等。84（七）組織培養技術（tissue culture） 是將離體的細胞、組織或器官置于培養基中，在無菌和適宜溫度及酸堿度條件下進行培養成活，藉以觀察各種物理、化學和生物因素對組織或細胞的作用，探索和提示細胞生命活動規律和細胞的結構功能變化。8586新鮮實體組織細胞分離 膠原纖維1、酶消化法原理 緊密連接 粘多糖常用酶 蛋白酶類-胰酶：脂鍵、肽鍵 -膠原酶：膠原 -溶菌酶：糖蛋白和肽的糖苷鍵 血管 -彈性蛋白酶：糖蛋白和彈性蛋白 心臟 肝臟87注意：溶解液-酶效價 時間-新鮮組織、酶解時間過長，細胞自溶 pH值-堿性：胃蛋白酶失活 -中性：胰酶活性欠佳 酶純度 細胞膜改變882、機械法