1、脊髓灰質炎病毒的實驗室監測河南CDC脊灰實驗室脊灰病毒病原學特征屬于小核糖核酸病毒科腸道病毒屬。病毒為直徑30nm的小圓球型顆粒，無包膜。有三個血清型，為I型、II型和III型，每個型別的脊灰都可致病。各型之間缺少交叉保護作用，三個血清型相對穩定，分別可用對應型的免疫血清做中和試驗定型。相對耐熱、耐酸，也能抵抗許多普通的清潔劑和消毒劑，但在干燥、紫外線、高熱、甲醛和游離氯作用下很易滅活 。病毒在4下能存活數周，常溫下能存活幾天，-70可存活數年。脊灰病毒的傳播主要通過糞-口途徑傳播，近99%為隱性感染，但脊灰病毒通常持續2-4周隨著感染者的糞便排出體外，而且可在外環境中存活較長時間。人是脊灰病

2、毒的唯一天然宿主。由于OPV常規免疫，疫苗相似株病例可在全國免疫日期間聚集發生。脊灰病毒的致病性主要侵犯人體脊髓灰質前角的灰、白質部分，對灰質造成永久損害，使這些神經支配的肌肉無力，出現肢體弛緩性麻痹。好發嬰幼兒，故又稱小兒麻痹癥。本病可防難治，一旦引起肢體麻痹易成為終生殘疾，甚至危及生命 。 中國在2000年通過了世界衛生組織西太區的無脊灰認證。河南省在1992年4月19日，發現最后一例脊髓灰質炎野病毒病例。實驗室檢測的重要性 實驗室在確保達到消滅脊灰中的作用是至關重要的。除了脊灰病毒以外，還有其它因素也能引起急性弛緩性麻痹，因此所有疑似病例的標本都必須經過病毒學檢測。因為只有0.1%1%的

3、感染者會出現臨床癥狀，所以從每例確診的AFP病例中采集到的糞便標本都必須按規定的程序進行認真檢測，以防漏檢脊灰野病毒，漏掉1例就意味著漏掉1000例脊灰病毒感染者。實驗室檢測內容細胞培養脊灰病毒便標本的接收和處理及分離脊灰病毒定型的中和試驗細胞培養兩種細胞系 細胞培養需要的試劑和材料細胞培養的操作方法兩種細胞1L20B細胞，來源于轉基因小鼠肺細胞，通過基因工程體外表達的方法使其表達人脊髓灰質炎病毒受體。該細胞對脊髓灰質炎病毒敏感，感染后產生特征性的腸道病毒致細胞病變（CPE）。 2RD細胞，來源于人橫紋肌肉瘤，該細胞對脊灰病毒、許多ECHO病毒和一些其它腸道病毒高度敏感，感染后產生特征性的腸道

4、病毒CPE。 注意如果RD細胞出現陽性結果而14天后L20B細胞仍然陰性，要在L20B細胞上續種一代，并且再觀察7天以排除脊灰病毒存在的可能性。除了腸道病毒外，含有一些其他病毒的糞便標本接種到L20B細胞上也會產生CPE（例如呼腸孤病毒和腺病毒）此時需如實記錄CPE。一些非脊灰腸道病毒可以在肺細胞上產生CPE，因此也可以在L20B細胞上產生(但這些病毒產生的CPE通常與脊灰病毒產生的CPE明顯不同）。這些標本也應該進行脊灰病毒定型實驗以排除這些標本含有脊灰病毒的可能性。L20B negativeRD-A negative細胞培養兩種細胞系 細胞培養需要的試劑和材料細胞培養的操作方法試劑和材料生

5、長液不含鈣離子和鎂離子的PBS .PBS(-)長成單層的 RD 或 L20B 細胞胰蛋白酶/EDTA PBS(-)稀釋的 0.1% w/v 臺盼蘭細胞計數板和蓋玻片細胞培養管和細胞培養瓶吸管 & 吸尖細胞培養兩種細胞系 細胞培養需要的試劑和材料細胞培養的操作方法操作方法檢查細胞的質量用 PBS(-) 洗兩次用胰蛋白酶/EDTA消化細胞在 36培養箱孵育 5 分鐘用生長液懸浮細胞并且計數計算 傳代至新的培養瓶 有關糞便標本注意事項采集時間和采集份數保存條件運輸條件個案調查表的填寫采集時間和采集份數麻痹14天內采集雙份糞便標本，兩份標本采集時間間隔24-48小時。采集的糞便每份至少5-10克。樣品

6、容器最好使用省級統一下發的采便盒，糞便盒上注明樣品信息。有關糞便標本注意事項采集時間和采集份數保存條件運輸條件個案調查表的填寫保存條件糞便標本采集后短時間可以4C保存（冷藏包），長時間需要-20C保存（冰箱/冰柜）。有關糞便標本注意事項采集時間和采集份數保存條件運輸條件個案調查表的填寫運輸條件糞便標本應有專業技術人員送往省級實驗室。糞便標本應放置在冷藏包/冷藏箱，要有足夠的冰塊保證儲存溫度。盡量在工作時間把樣品送至省級實驗室。有關糞便標本注意事項采集時間和采集份數保存條件運輸條件個案調查表的填寫個案調查表和送檢表樣品送往省級實驗室同時要求附有個案調查表和送檢表調查表信息確保真實完整脊灰病毒便標

7、本的處理糞便標本的處理必須在Class II生物安全柜(BSC)中進行。 7/8/2022National Laboratory for Poliomyelitis267/8/2022National Laboratory for Poliomyelitis26脊灰病毒分離檢測流程接種 L20B & RDL20B +L20B & RD +脊灰病毒血清型鑒定L20B , RD -報告陰性RD分離物轉種到 L20B細胞上型內鑒定糞便標本L20B 報告 NPEVCytopathic effect on L20B and RD cells 除了腸道病毒外，含有一些其他病毒的糞便標本接種到L20B細胞上

8、也會產生CPE（例如呼腸孤病毒和腺病毒）此時需如實記錄CPE。一些非脊灰腸道病毒可以在肺細胞上產生CPE，因此也可以在L20B細胞上產生(但這些病毒產生的CPE通常與脊灰病毒產生的CPE明顯不同）。這些標本也應該進行脊灰病毒定型實驗以排除這些標本含有脊灰病毒的可能性。非脊灰病毒病變照片L20B非脊灰病毒病變照片RD-A脊灰病毒定型的中和試驗 原 理 血清/病毒混合物在36孵育2小時使得抗體與病毒結合。然后，將細胞懸液加入到微孔板中，逐日觀察CPE。能夠阻止產生CPE的抗血清意味著可以識別病毒。 脊灰實驗室認證合格標準實驗結果28天內報告及時率80。每年至少檢測150份標本。脊灰病毒分離株與地區

9、參比實驗室檢測結果一致率90。AFP脊灰病毒分離株7天內送出進行型內鑒別及時率80。最近一次WHO認可的職能考核（PT）成績不低于80分。至少每季度進行一次內部質量控制。歷年標本檢測情況疫苗衍生脊灰病毒(VDPVs)與原始Sabin株比，VP1區序列同源性小于99%，這種基因突變表明經過了長期的復制。（每年1%-2%的核苷酸發生變異）疫苗衍生脊灰病毒(VDPVs)VDPVs還可以分為3類：iVDPVs分離于患有免疫缺損的慢性排毒者；如果發生重組的話,經常與其它Sabin株病毒基因組發生重組；非常少見; 與 OPV免疫覆蓋率無關。cVDPVs引起循環的VDPVs通常發現于OPV免疫覆蓋率比較低的地區許多報導稱，其經常與C組腸道病毒發生重組正在循環的脊灰病毒都將和同種的腸道病毒重組其它VDPV 單一的從無免疫缺損者中分離到的毒株或從環境中分離