1、?胚胎工程?一、精子的發(fā)生1、場所：2、時期：3、過程：1、場所：精子的發(fā)生是在睪丸內完成的2、時期：從初情期開始直到生殖功能衰退3、過程：發(fā)生的過程大體可分為三個階段曲細精管第一節(jié)、哺乳動物生殖細胞的發(fā)生精原細胞有絲分裂初級精母細胞次級精母細胞精子細胞精子M第一階段第二階段第三階段M精子發(fā)生的過程多個精原細胞染色體復制變形精原細胞經過有絲分裂產生多個初級精母細胞。初級精母細胞經減數分裂形成含有單倍染色體的精子細胞。細胞核變?yōu)榫宇^部的主要局部；高爾基體發(fā)育為頭部的頂體；中心體演變?yōu)榫拥奈玻痪€粒體形成線粒體鞘膜；其它物質濃縮成原生質滴球形1.家畜每次射精排出的精子數以億計，但是通常只有一個精

2、子能夠與卵子結合，這能說是一種浪費嗎？怎樣理解這一現(xiàn)象？ 提示：不是。其一，在自然繁殖的條件下，可以說是動物為繁殖后代、延續(xù)物種的一種生理保障機制；其二，在自然條件下，精子從射精部位運行到受精部位，將對精子進行篩選，并致使大量的精子途中死亡，被分解或排除，造成精子大量損耗。最后到達受精部位輸卵管的精子只剩百余個，與卵子完成受精的只有一個。2.精子細胞變成精子的過程中，細胞中很多結構會消失，而細胞核和線粒體都保存下來，對這一現(xiàn)象怎樣理解？為什么精子中的線粒體集中在尾的基部？提示：細胞核是精子遺傳物質儲存和復制的場所，也是參與精、卵結合和后代遺傳特性與細胞代謝活動的控制中心。而線粒體那么是有氧呼吸

3、產生運動能量的場所。精子的線粒體集中于尾的基部形成線粒體鞘膜，是精子維持生存和運動能量的“動力工廠或“發(fā)動機。思考：二、卵子的發(fā)生1、場所：卵子的發(fā)生是在卵巢內完成 的。2、時期：性別分化以后放射冠3、過程： 雌性胎兒卵巢內的卵原細胞，通過有絲分裂增加其數量，演變?yōu)槌跫壜涯讣毎宦雅菁毎鼑纬陕雅荨３跫壜涯讣毎涍^減數分裂變?yōu)槌墒斓穆炎印?減數第一次分裂時間是在雌性動物排卵前后完成的，結果是產生1個次級卵母細胞和第一極體。 減數第二次分裂時間是在精子和卵子結合的過程中，結果是產生1個成熟卵子和第二極體。卵原細胞有絲分裂多個卵原細胞染色體復制初級卵母細胞M第一極體次級卵母細胞兩個第二極體第二

4、極體卵子退化消失M排卵前后完成在受精過程完成被卵泡細胞包圍,形成卵泡胎兒時期完成1.一個卵泡中能形成幾個成熟的卵子？2.排卵是指卵子從卵泡中排出，還是指卵泡從卵巢中排出？3.剛排出的卵是成熟的卵子嗎？它在母體的什么部位與精子受精？ 答：剛排出的卵子尚未完全成熟，僅完成第一次減數分裂，需要在輸卵管內進一步成熟，直到減數第二次分裂的中期才能與精子結合完成受精過程。排出的卵子是在輸卵管內與精子受精的。 答：正常情況下，一個卵泡只能形成一個成熟的卵子。 答：是指卵子從卵泡中排出。思考：4、精子與卵子的發(fā)生比較場 所開始時間細胞增殖方式子細胞數目是否變形重要區(qū)別精子睪丸初情期以后先有絲分裂后減數分裂 4

5、個精子細胞變形哺乳動物卵泡的形成和在卵巢內的儲備是在出生前完成的；而精子是從初情期開始的卵子卵巢輸卵管性別分化以后先有絲分裂后減數分裂 1個卵細胞,3個極體不變形相似點：最初階段均進行有絲分裂，不斷增加生殖原細胞的數量；經過兩次減數分裂M和M才能形成精子和卵子。不同點：一個精原細胞多個精子； 減1和減2是連續(xù)的，細胞質分裂均等。一個卵原細胞一個卵子；減1和減2是不連續(xù)的，細胞質分裂不均等。精子形狀為蝌蚪狀；卵子為球形。多數哺乳動物卵子的形成和在卵巢內的貯備是胎兒出生前完成的。四、受精作用受精1、概念:2、標志:3、場所:1、概念:指精子和卵子結合形成合子 (即受精卵)的過程。2、標志:在卵黃膜

6、和透明帶的間隙可以觀察到兩個極體時。第二極體的形成3、場所:受精是在輸卵管內完成的。4、過程受精前的準備階段受精階段準備階段1：精子獲能準備階段2：卵子的準備即精子必須在雌性動物生殖道內發(fā)生相應生理變化后，才能獲得受精能力的現(xiàn)象。即卵子在輸卵管內到達減數第二分裂中期M時，才具備受精能力。包括精子穿越放射冠和透明帶，進入卵黃膜，原核形成和配子結合。穿過放射冠：在卵子外圍集聚有幾十個精子，它們首先穿放射冠。 幾個精子同時分解透明帶，但只有一個精子能穿過透明帶進入卵子內，當第一個精子進入后，透明帶的穿透性就立即發(fā)生變化，從而阻止其他精子穿越透明帶。穿過透明帶：1) 精子穿越放射冠和透明帶 頂體反響使

7、頂體內的酶釋放出來并溶解放射冠內的卵丘細胞透明帶反響是防止多精入卵受精的第一道屏障2)精子進入卵黃膜 卵黃膜封閉作用是防止多精入卵受精的第二道屏障 精子進入卵子后,其細胞核變大到和卵子細胞核相似,精子細胞核(雄原核)和卵子細胞核(雌原核)同時向細胞中部靠攏,并相互融合成一個細胞核,（受精完成的標志）這時稱受精卵。形成受精卵：思考：當你了解到精子需要獲能，受精過程中有防止多精入卵的現(xiàn)象時，你是否提出過這樣的問題：精子在雌性生殖道內是如何獲能的？防止多精入卵的兩道防線的形成機制究竟是什么？答：精液由精子和精清精漿兩局部組成。精清中含有一種能抑制精子獲能的物質，因此，在一般情況下，精液中的精子無法獲

8、能。只有當交配后精液進入雌性動物的生殖道時，由生殖道分泌產生一種物質解除對精子獲能的抑制，才能引起精子獲能。精子在雌性動物生殖道內獲能的部位因種類而異，但主要是子宮和輸卵管。防止多精入卵主要通過透明帶反響和卵黃膜封閉作用兩道屏障。在受精過程中，當精子穿越透明帶觸及卵黃膜時，透明帶會立即封閉，阻止后來的精子進入透明帶，可看作是防止多精受精的第一道屏障。而精子入卵后，卵黃膜會立即拒絕其他精子再進入卵內，可看作是防止多精受精的第二道屏障。精、卵相遇頂體反響頂體酶釋放頂體酶溶解透明帶接觸透明帶穿越放射冠溶解卵丘細胞 放射冠穿越透明帶接觸卵黃膜產生透明帶反響形成第一道屏障精子被微絨毛抱合精子外膜與卵黃膜

9、融合精子進入卵精子進入卵后變化變化變化產生卵黃膜封閉作用形成第二道屏障尾部脫離核膜破裂形成雄原核形成雌原核激活卵子完成減數第二次分裂，排出第二極體發(fā)育 移動 接觸 合并形成受精卵5.意義維持每種生物前后代體細胞中染色體數目的恒定 ；對于生物的遺傳和變異十分重要。受精卵卵裂期桑椹胚囊胚內含囊胚腔原腸胚內含原腸腔胚層分化形成胎兒形成：進行有絲分裂，細胞數量不斷增加，但胚胎總體積并不增加，或略有減少。：由具有全能性細胞構成，細胞數在32個左右，排列緊密，形似桑椹內細胞團：發(fā)育成胎兒各組織滋養(yǎng)層細胞：發(fā)育成胎膜和胎盤：最初發(fā)育在輸卵管進行有絲分裂滋養(yǎng)層外胚層中胚層內胚層原腸腔第二節(jié)、哺乳動物胚胎發(fā)育的

10、根本過程胚胎發(fā)育：指受精卵發(fā)育成幼體的過程二、人體胚胎發(fā)育的根本過程人體胚胎發(fā)育在子宮內經過約38周，整個過程可分為胚卵期、胚胎期和胎兒期三個階段胚卵期：從受精至第一周末胚胎開始著床胚卵期強調：卵裂期的特點細胞分裂方式為_細胞數目_胚胎總體積_或略有_每個細胞體積_DNA數目_有機物總量_有絲分裂增加不增加縮小減小增加增加新生命的第四天胚泡 新生命的第三天桑椹胚 受精后8天。胚芽完成著陸,微微嵌入子宮內膜。此時它分裂發(fā)育為幾百個細胞。 桑椹胚：細胞數在32個左右，細胞排列致密，形似桑椹，細胞屬于全能細胞囊胚：細胞開始分化;內細胞團將來發(fā)育成各種組織, 滋養(yǎng)層將來發(fā)育成胎膜、胎盤;出現(xiàn)囊胚腔后，

11、進一步擴大會導致孵化。新生命的第四周 新生命的第五周看啊，眼的雛形出來了 胚胎期：從第二周至第八周第三周末形成原腸胚：內細胞團表皮的細胞形成外胚層，下方的細胞形成內胚層，出現(xiàn)原腸腔。新生命的第六周四肢和腦都開始初步分化了，真讓人激動 受精后6星期，人形已隱約可見。這時，胚胎的心跳每分鐘140150下是母親心跳的兩倍。 新生命的第七周進一步發(fā)育了，看個整體的吧 人類胚胎第八周時在子宮內的照片 ，胚初具人形新生命的第九周胎兒已基本成形，看看手的進一步分化 新生命的第十二周理論上這時的胎兒已可以獨立生活，但其實出世的日子還早 胎兒期：從第九周開始至分娩此時胎兒已長到20周，他移動手臂，把手指放在唇邊

12、，這可以促進它對吮吸的反映 。新生命的第二十六周中間的很多周變化不大，是體內器官的逐步分化和成熟，就略過吧。二十六周的胎兒如果出世，存活率已經很高了！看看就知道差不多了啊！ 新生命的第二十八周請注意體位，現(xiàn)在已經為分娩做好準備了 胚胎工程技術： 胚胎移植 體外受精 胚胎分割 胚胎干細胞培養(yǎng)目前應用較多的是： 胚胎移植、胚胎分割、體外生產胚胎技術。第三節(jié).胚胎工程的主要技術與應用一、體外受精和胚胎體外培養(yǎng)體外受精概念：采取雌性動物的卵細胞和雄性動物的精子，使其在試管受精。過程： 1精子的收集和獲能； 2卵母細胞的收集和培養(yǎng)； 3獲能精子和卵細胞的受精。“試管動物2采集卵母細胞方法： 超數排卵具體

13、做法： 注射促性腺激素(1).精子的收集和獲能 在獲能溶液或專用的受精溶液中完成受精過程。 (3)體外受精胚胎體外培養(yǎng)概念：將受精卵在人工環(huán)境下培養(yǎng)成早期胚胎。培養(yǎng)液：不同時期成分不同 水、無機鹽、有機物、維生素、激素、氨基酸、核苷酸以及動物血清等。 胚胎培養(yǎng)比組織、細胞培養(yǎng)要難。 其他方式二、胚胎移植胚胎移植概念:將經濟價值較高、遺傳性狀優(yōu)秀的母畜，經過激素處理，使其超數排卵后受精，然后將發(fā)育的早期胚胎分別移植到同期發(fā)情的代孕母的子宮內，通過代孕母妊娠產仔的技術。供體：提供胚胎的個體。受體：接受胚胎的個體。良種雌性動物。一般品種的雌性動物。“借劣質動物之腹懷優(yōu)秀個體之胎過程胚 胎 移 植 的

14、 意 義1.發(fā)揮優(yōu)良母畜的繁殖潛力，提高繁殖效率。2.促進家畜改進的速度3.產生雙胎和使不孕母畜獲得生殖能力4.瀕危動物的拯救和保護5.研究手段39胚 胎 移 植 的 原 那么1.受體與供體在分類學上的相同屬性2.動物生理上的一致性3.動物解剖部位的一致性4.胚胎發(fā)育的期限5.胚胎的質量6.供體、受體的狀況40胚胎移植原那么圖解41胚 胎 移 植 的 程 序優(yōu)良種公畜 供體優(yōu)良母畜 超 數 排 卵 處 理 發(fā) 情、配 種 胚 胎 回 收 超 數 排 卵 處 理受體優(yōu)良母畜 同 期 發(fā) 情 處 理 發(fā) 情 胚 胎 移 植優(yōu) 良 后 代42 在生理或非妊娠條件下，雌性動物每間隔一定時期均會出現(xiàn)一次

15、發(fā)情，通常將這次發(fā)情開始至下次發(fā)情開始、或這次發(fā)情結束至下次發(fā)情結束所間隔的時期，稱為發(fā)情周期。 發(fā) 情 周 期43 通常根據動物的精神狀態(tài)、雌性動物對雄性動物產生的性欲表現(xiàn)、卵巢內卵泡的生長發(fā)育、排卵和黃體形成的情況及雌性生殖道子宮、陰道等的生理變化等幾個主要方面，將發(fā)情周期劃分為：發(fā)情前期前情期 發(fā)情期 發(fā)情后期后情期 間情期休情期 44451.供體的超數排卵( Superovulation of Donor ) 在母畜發(fā)情周期的適當時期，用促性腺激素進行處理，誘發(fā)其卵巢上有大量卵泡同時發(fā)育并排卵，稱為超數排卵，簡稱超排。超排技術通常用于單胎家畜，如牛、綿羊和山羊等，其目的是讓優(yōu)良母畜排出

16、大量卵子，充分發(fā)揮其繁殖潛力，因而是胚胎移植中的一個重要環(huán)節(jié)，也是首要環(huán)節(jié)。超排方法：在發(fā)情周期的一定時期，用PMSG或FSH促進卵泡發(fā)育，于發(fā)情開始后12-16h和20-24h各配種輸精一次，并于第一次配種后靜脈注射hCG或LH，以便排出多數卵子。 4647天數 110 11 12 1315-1620處理 置栓 換栓7:00FSH2.5ml 19:00FSH1.5ml 7:00FSH1.5ml19:00FSH1.5ml7:00FSH1.5ml19:00FSH1.0mlPG0.1mg試配首配后LRHA310-20Mg每8小時配一次 首配后3-3.5d置栓7:00停食腹腔鏡檢查手術沖胚PG0.1

17、mg羊供體超排處理方案48羊的陰道栓處理49羊的陰道栓處理5051羊的陰道栓處理52 影響超排效果的因素 家畜本身：母畜個體差異可導致超排反響不同，這與家畜的種類、品種、年齡、體重及營養(yǎng)情況都有關系。促性腺激素：所用激素的種類、用量和注射程序，尤其是制品中兩種促性腺激素FSH/LH )的比例差異，是影響胚胎數量及質量的重要因素；用量的大小那么與超排的多少直接有關，如果用量過大，往往會使卵泡發(fā)育過多，以致發(fā)生排卵延遲或不能排卵。53用藥時間：發(fā)情周期階段、產后階段及季節(jié)不同，超排結果均有差異。 重復超排：一般而言，供體對前3次超排處理 的反應相似，但有些個體對重復超排的反響不佳，可能是由于促性腺

18、激素產生了抗體。為了 提高重復超排的效果，一是延長激素處理的間 隔，二是盡量采用同種動物的促性腺激素，以減少抗體的產生。54超排效果好的卵巢黃體55超排效果不好的卵巢黃體562.受體的同期發(fā)情( Synchroestrus of recipient ) 無論在何種家畜或任何品種，為了使胚胎移植獲得成功，必須使受體母畜與供體的發(fā)情同期化，使二者的生殖器官處于相同的生理階段。受體與供體發(fā)情開始的時間越接近，移植的受胎率越高。這是因為妊娠初期的子宮環(huán)境在不斷發(fā)生變化，而特定時間的環(huán)境只適合于發(fā)育階段相應的胚胎生存；也可能是因為非同期胚胎不能對受體產生促黃體作用。為了獲得最正確受胎效果，應將受體與供體

19、的發(fā)情時間之差控制在24h之內。57同期發(fā)情方法:誘發(fā)同期發(fā)情的理想藥物有孕激素和前列腺素PGF2及其類似物。其劑量根據PG種類和用法不同而異。在國外，普遍采用氯前列烯醇(cloprostenol)和15甲基PGF2倘假設在400頭以上的大牛群中進行胚胎移植，因為每天都可能遇到發(fā)情母牛，就可以盡量選留自然發(fā)情的母牛作為受體，不需要進行同期發(fā)情處理。58羊受體的同期發(fā)情處理方案天數 1 11 12 131720 處理 置栓 19:00FSH 25iu 或PMSGFSH25iu去栓 早晚試情，記錄發(fā)情時間 7:00停食移胚593.供體的配種輸精 超排供體的配種次數，應比自然供體多一些，每次輸入的精

20、子數亦應增多。超排供體的受精率，通常比自然供體為低，這可能是由于排卵不集中、卵母細胞有缺陷或母畜生殖道的環(huán)境不太適宜于精子的運行。60精子的收集和獲能 1)收集的方法:假陰道法,手握法和電刺激等 2)獲能處理: 培養(yǎng)法：嚙齒動物、 家兔和豬化學法：牛、羊4.收集胚胎Collection of eggs 收集胚胎就是在配種或輸精后的適當時間，從超排供體回收其胚胎，以備給受體移植，亦稱胚胎回收或胚胎采集，簡稱采卵。采卵的效果與采集時間、方法和檢卵技術均有關系。62 1.采卵時間 一般將配種當日定為0 天，由配種后第二天開始計算采卵天數。根據采集目的不同，決定在第幾天采卵。就母牛而言，一般第1-4天

21、可以由輸卵管采到16細胞以前的卵，58天可以由子宮采到桑植胚和囊胚。其依據是胚胎在生殖道內的發(fā)育情況及移行速度 .636465662采卵方法 有手術法和非手術法兩種。在大家畜根本上已將手術法淘汰，但在綿羊、山羊、豬和實驗動物由于受解剖特點的限制，一直采用手術方法。不管用何種方法，一般收集卵子數只能相當于黃體數的4080。 67第一種由宮管結合部沖向輸卵管。本法沖卵率高，很少損害生殖道。除了豬因宮管結合部具有閥門樣結構不能采用以外，各種中、小動物均可采用。第二種方法是由輸卵管傘沖向宮管結合部。本法適用于豬，是由一個插入該處的鈍注射針頭或光滑的細玻管收集卵子；其缺點是術后常造成宮角尖端或輸卵管粘連

22、。手術法采卵68第三種方法是由子宮角尖端沖向子宮角基部。本法用于發(fā)情5天以后收集子宮內的卵，其收集數量比A, B法略少，易引起子宮粘連。 沖卵液為杜氏PBS,用量:第一、第二兩種方法用5-l0ml，第三種方法用10-20ml。6970羊的手術法采卵71羊的手術法采卵 72手術操作現(xiàn)場73Sgie創(chuàng)造了一種帶有氣球的非手術采卵器，可由牛的子宮角采卵，顯著提高了采卵率。Folley和Stewart又相繼改進，設計出三通路進氣、進液、回液導管采卵器附圖4，使用更加方便有效，能夠從同一供體反復收集卵子。沖卵液的用量一般為500 ml，裝入輸液瓶內，每次放出30-60m1，反復沖洗子宮角，并回收到集卵杯

23、內。沖完一個子宮角后，再用同法沖洗另一子宮角。 非手術法采卵7475765.檢卵Egg picking 將沖卵液回收之后，盡快置于放大10-15倍的實體顯微鏡下，檢查收集到的卵數，并用一細吸管將卵移至新鮮培養(yǎng)液內，在放大40-200倍的復式顯微鏡下，進行形態(tài)學觀察，選出適合于移植的正常卵附圖5。形態(tài)不正常者附圖6及發(fā)育延遲2天以上的卵，都不可用于移植。77檢胚78顯微鏡下的胚胎7980816.移植胚胎Egg transplantation 移植胚胎就是將采取的可用卵移給受體母畜，亦稱卵的移植，簡稱移卵。移卵方法：與采卵方法相似，也分為手術法與非手術法兩種，前者適用于不能進行直腸操作的中小動物，

24、后者適用于大家畜。82手術法移卵 方法與采卵一樣，先暴露輸卵管及子宮角，再將卵注入輸卵管或子宮角。當移入輸卵管時，將毛細移卵管的尖端通過輸卵管傘插到壺腹部，注入含有胚胎的培養(yǎng)液12滴；假設移入子宮角，可先用鈍針頭刺破子宮角壁，然后將毛細管從針孔插入子宮腔，注入含胚胎的培養(yǎng)液 838485羊的手術法移卵8687非手術法移卵 自從1982年以來，非手術法已被某些胚移中心用于商業(yè)性移植，但將胚胎送到子宮角內需要有一定經驗。為了提高成功率，Elsden1982將其總結為四步。 將胚胎吸入細管中，位于兩個氣泡之間。 將細管裝入卡蘇槍，槍外由一塑料套保護。 將受體保定好，進行硬膜外麻醉，由直腸觸摸黃體位于

25、何側。 將胚胎送到黃體同側的子宮角中部。88899091三、胚胎分割優(yōu)勢:可成倍增加胚胎數量，可以快速繁殖良種畜。1.概念: 采用顯微手術機械方法的方法將早期胚胎分割成2分胚,4分胚或8分胚,經體內或體外培養(yǎng)后植入受體，以得到同卵雙胎或同卵多胎的技術。過程2.特點： 后代具有相同的遺傳物質， 因此胚胎分割可以看做動物無性繁殖或克隆的方法之一。3、理論根底 動物胚胎細胞的全能性。 所以胚胎分割的時期為： 囊胚或桑椹胚。4、選擇的胚胎： 發(fā)育良好的,形態(tài)正常的桑椹胚或囊胚。5、使用的主要儀器： 實體顯微鏡和顯微操作儀。6、具體操作 用分割針或分割刀片將胚胎切開，吸出其中的半個胚胎，注入預先準備好的空透明帶中，或直接將裸半胚移植給受體。胚胎分割的根本操作選擇良好的桑椹胚或囊胚移入培養(yǎng)皿中，用分割針或分割刀片將其切開，吸出其中的半個胚胎注入透明帶中或直接移植給受體。 胚胎分割移植的顯微操作受精卵分裂 早期胚胎胚胎分割根本過程代孕母牛植入植入分割7、操作本卷須知： 對囊胚階段的胚胎進行分割時，要將內細胞團均等分割。 原因：內細胞團一般到囊胚階段才出現(xiàn)，它是發(fā)育為胚胎本身的根底細胞，其他細胞為滋養(yǎng)細胞，只為