1、基因工程實驗流程總覽DNA提取，純化限制圖譜瓊脂糖電泳檢測片段體外擴增PCR目的基因制備載體選擇DNA重組片段連接未知核酸序列須DNA片段大小估計互補性黏性不互補性黏性末端平末端限制性核酸內(nèi)切酶酶切分離法簡單基因組分離如質(zhì)粒和病毒物理化學法構(gòu)建基因組文庫PCR擴增基因的化學合成雙抗體免疫法酶促反應(yīng)mRNA-cDNA 目的基因分離雙酶切部分酶切Bal31逐步切割轉(zhuǎn)座子基因定位克隆酵母雙雜交前處理防止自連RNA提取RT-PCRTA克隆藍白選擇膠回收表達引物PCR載體PCR產(chǎn)物回收轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞構(gòu)建基因組文庫真核生物有成千上萬個堿基對，單個未知基因在整個基因組中的比例很小且不能在體外特異性擴增，所以

2、只能對所有基因擴增，也就是構(gòu)建基因組文庫。油菜TOC33基因片的克隆實驗項目背景 國家自然科學基金項目（油菜葉綠體蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運突變體中差異表達基因的克隆，編號：30170500）。實驗?zāi)康?通過本綜合實驗，掌握植物基因組DNA的制備技術(shù)、PCR技術(shù)、限制性內(nèi)切酶酶切技術(shù)、重組DNA技術(shù)、克隆鑒定技術(shù)、質(zhì)粒DNA的制備、瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)、測序技術(shù)、生物信息技術(shù)等，得到一個與科學研究過程相近的分子生物學綜合技能訓練。 具體實驗步驟.植物基因組DNA的制備.TOC33基因片段的PCR擴增. DNA的瓊脂糖凝膠上回收與純化IV. DNA片段的體外重組與轉(zhuǎn)化V. 克隆的篩選與鑒定VI.序列分析.植物基因

3、組DNA的制備取0.2g樣品嫩葉至1.5mL EP管中，放在液氮中冷凍處理后，在EP管中充分搗碎，加入0.6mL 抽提緩沖液，65水浴處理10min。12,000rpm離心3min，取上清，加入二倍體積預冷的無水乙醇沉淀，遇有絮狀沉淀，4,000rpm離心5min。沉淀用50ul TE-RNase（5.0mM Tris.HCl pH 8.0，1.0mM EDTA pH 8.0，RNase A 30ug/mL）溶解，37保溫處理15min。加入二倍體積預冷的無水乙醇，-20下沉淀10min ，4,000rpm離心3min，加適量70%乙醇洗沉淀，自然干燥或37烘干，加入50ul ddH2O溶解備

4、用。.TOC33基因片段的PCR擴增引物設(shè)計，為擴增Toc33片段，用OLIG05. 0設(shè)計1對PCR引物:上游引物P1: 5一ATGGGGTCTCTCGTTCGTGAAT-3，下游引物P2：5一TTAAAGTGGCTTTCCACTTGTC一3。在0.2mLEppendorf管內(nèi)配制25ul反應(yīng)體系：10PCR Buffer 2.5 ul Mg2+ 1.5 ul dNTP 1.0 ul Primer 1 1.0 ul Primer 2 1.0 ul Taq 酶 0.5 ul 模板 1.0 ul ddH2O 16.5 ul1) 94 oC 預變性 5 min2) 94 oC變性 30 sec3)

5、 55 oC退火 30 sec4) 72 oC延伸 45 sec5) 重復步驟2)-4)30次6) 72 oC延伸10 min瓊脂糖凝膠電泳分析PCR結(jié)果 1)稱取0.5g瓊脂糖放入溶膠瓶中，再加入1ml 50TAE緩沖液，49ml 高水，置微波爐或水浴加熱至完全融化，取出搖勻，則為1瓊脂糖凝膠液。2)取電泳槽里面的膠板，用膠帶將兩端封好，調(diào)平，并放好樣品梳子。3)將冷到60oC左右的瓊脂糖凝膠液，緩緩倒入膠板，直至膠板上形成一層均勻的膠面。4)待膠凝固后，取出梳子，放在電泳槽內(nèi)。電泳槽內(nèi)應(yīng)加入電泳緩沖液。5)用移液槍將已加入上樣緩沖液的PCR產(chǎn)物加入加樣孔。6)接通電泳槽和電泳儀的電源（注意

6、正負極，DNA片段從負極向正極移動）；選擇合適的電壓，開始電泳；7)當溴酚藍燃料移動倒距離凝膠前言12cm處，停止電泳。8)將電泳的凝膠浸入溴化乙錠染色液中，染色10min后取出，用清水沖洗。將膠放于凝膠成像系統(tǒng)內(nèi)拍照，以觀察樣品在瓊脂糖凝膠中的帶（EB有劇毒，戴手套操作）。電泳染色后，在紫外分析儀上切取所需要的條帶，按1克膠：1000添加提取緩沖液，放在60度的金屬浴中溶解。然后把溶液轉(zhuǎn)移到試劑盒專用管中，6000轉(zhuǎn)/分離心1分鐘；倒掉上清，再加入500微升的extraction buffer,12000r/min離心1分鐘；倒掉上清，加入750微升的wash buffer ,12000r/

7、min離心1分鐘；倒掉上清，重復步驟三；倒掉上清，在12000r/min下空轉(zhuǎn)1分鐘；把帶有膜的管子換到新的EP管中，加入3050微升的水，靜置1分鐘，12000r/min離心一分鐘，即得到所要回收的片斷。此樣品可用來做酶切等。. 瓊脂糖凝膠上DNA的回收與純化IV. DNA片段的體外重組加試劑順序由上到下（用500ul的EP管裝），加完之后混勻，短時離心，用封口膠封口。將EP管放入金屬浴當中37度酶切兩個半小時左右，取出酶切產(chǎn)物，用試劑盒進行割膠回收進一步純化酶切片斷以進行連接反應(yīng)。酶切體系： 40.0ulddH2O 9.0ul10Buffer 4.0ul DNA 25.0ul Xba I、

8、 1.0ul Hind III 1.0ul 連接反應(yīng)：連接體系： （20.0ul） 酶切產(chǎn)物 3.0ul Buffer 1.0ul 載體 14.0ul Liagse 2.0ul加試劑順序由上到下（用500ul的EP管裝），加完之后混勻，短時離心，用封口膠封口。將EP管放入金屬浴當中16度連接過夜。IV. DNA片段的轉(zhuǎn)化1. 從液氮中取出感受態(tài)細胞，完全融化后，用移液槍將連接產(chǎn)物加入感受態(tài)細胞中，溫柔混勻，在冰上放置半個小時。2. 42OC熱激90sec。再在冰上放10min，然后導入SOC（1.5mlEP管）中，在37OC搖床上200rpm進行振蕩一小時。3. 在這段時間里可以準備平板，25

9、ml左右加了抗生素的60度左右的LB固體培養(yǎng)基倒入事先滅菌的培養(yǎng)皿中，在表面涂布上X-gal和ITPG;4. 取出搖得菌液在離心機上6000轉(zhuǎn)每分鐘離心五分鐘。然后將大部分培養(yǎng)基倒出，剩余大概五十微升左右的SOC即可。注意不可將沉淀倒出。5. 用移液槍將沉淀吹散均勻，將其加入事先倒好的平板上，加入涂布玻璃珠進行涂布。涂布均勻后將平板倒置放于37OC培養(yǎng)箱內(nèi)過夜培養(yǎng)。第二天從轉(zhuǎn)化的平板上挑去白色的菌落以驗證是否是陽性克隆V. 克隆的篩選與鑒定1.用移液槍在1.5mlEP管中加入液體LB培養(yǎng)基500ul，再用滅過菌的牙簽在生長藍白斑的平板上挑取陽性克隆放于EP管中，丟棄牙簽，蓋緊管口，用報紙包好放

10、到37OC，200r/min的搖床中過夜培養(yǎng)；2.EP管出現(xiàn)混濁，用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒。3.對于得到的質(zhì)粒再酶切電泳檢測陽性克隆，如果酶切后的電泳圖上出現(xiàn)了與插入片斷相應(yīng)大小的條帶，證明是此單菌落是陽性克隆，否則是假陽性的。試劑盒質(zhì)粒回收過程 把過夜培養(yǎng)菌液，10000r/min離心1分鐘，倒掉上清液；向菌體中加入質(zhì)粒回收試劑盒中的SolutionI400微升，震蕩，直到沉淀的菌體完全懸浮；然后加入400微升的SolutionII，輕輕地顛倒混勻，然后在室溫下放置2分鐘；加入525微升的SolutionIII，顛倒混勻，直到出現(xiàn)白色的絮狀沉淀，10000r/min離心10分鐘；把上清液轉(zhuǎn)移

11、到試劑盒專用管中，10000r/min離心1分鐘;倒掉溶液，向管子中加入600微升的buffer HB，10000r/min離心1分鐘；倒掉溶液，加入750微升的wash buffer, 10000r/min離心1分鐘;重復上一步驟7次；倒掉溶液后空轉(zhuǎn)一次，以盡量除盡殘余的wash buffer ;將帶有膜的管子轉(zhuǎn)移到新的EP管中，加入100微升的水，靜置1分鐘，10000r/min離心1分鐘，即得到所需要的質(zhì)粒。VI.序列分析 獲得的陽性單克隆送樣測序，測序結(jié)果的同源性比較采用GenBank中的BLAST分析程序，基因序列比較運用DNAsist軟件。實驗起始材料的選取和準備mRNA的提取、純

12、化目標片段的克隆和分析DNA、RNA的提取、純化和分析克隆化基因的表達及表達蛋白的純化和功能分析基因轉(zhuǎn)化實驗及轉(zhuǎn)基因結(jié)果分析一、實驗起始材料的選取和準備水稻卵細胞的分離分離準備工作材料的速凍長期保存人工氣候箱、制冰機超凈工作臺、顯微操作系統(tǒng)RNase-free 耗材、液氮罐超低溫冰箱RNase 抑制劑二、卵細胞mRNA的提取、純化Oligotex系列試劑盒細胞裂解勻漿去蛋白和細胞殘渣溫浴并結(jié)合洗脫去鹽和回收旋渦混勻器離心機恒溫水浴鍋離心機、旋渦混勻器200 烘箱DEPC 、RNase-free DNase I 、RNase-free 耗材三、目標片段的克隆和分析利用SMART cDNA文庫構(gòu)建

13、試劑盒構(gòu)建水稻卵細胞cDNA文庫；目標基因的獲得；通過噬菌體載體自切割或T-Vector、平末端載體克隆獲得目標質(zhì)粒；利用測序儀和通用引物對克隆的目的基因測序；1.通過SMART技術(shù)構(gòu)建cDNA文庫第一鏈的合成第二鏈的合成和擴增 酶切、純化和片段分離cDNA檢測插入載體并包裝文庫質(zhì)量檢測文庫擴增及保藏恒溫水浴鍋、制冰機RTase、RNase抑制劑PCR儀高保真Taq酶恒溫水浴鍋、離心機限制性內(nèi)切酶、過濾柱電泳儀器、凝膠成像系統(tǒng)瓊脂糖恒溫水浴鍋超凈工作臺、烘箱、PCR儀培養(yǎng)基超低溫冰箱DMSO2.目標基因的克隆利用特異探針，通過核酸雜交的方法或利用特異的抗體，通過抗原-抗體反應(yīng)進行文庫目標基因的

14、篩選將培養(yǎng)于平板的噬菌斑通過印跡轉(zhuǎn)于尼龍膜，并于核酸交聯(lián)儀中固定。在雜交箱中利用特定探針雜交。最后在恒溫搖床中洗膜（探針標記：放射性和非放射性）將噬菌體培養(yǎng)于平板，于42培養(yǎng)幾小時后，于37用IPTG誘導融合蛋白的表達并印記于尼龍膜上，利用抗原-抗體反應(yīng)進行雜交利用GSP（基因特異引物）通過PCR擴增出目標基因利用GSP，以文庫為模板通過PCR擴增出目標基因，并通過電泳、凝膠成像系統(tǒng)檢測。利用文庫載體序列和已知的目標基因的序列設(shè)計通用引物和GSP，通過5RACE和3RACE擴增出目標基因的5和3端序列。并通過電泳、凝膠成像系統(tǒng)檢測。通過5RACE和3RACE克隆已知部分序列的目標基因四、DNA

15、、RNA的提取、純化和分析包含有目標基因的質(zhì)粒的獲得 對于通過篩庫技術(shù)獲得的目標基因，通過噬菌體載體的自切割作用生成目標質(zhì)粒。水稻基因組DNA的提取、純化和分析水稻各器官Total RNA的提取、純化和分析質(zhì)粒提取、分析常規(guī)質(zhì)粒提取方法：通過細菌的適當裂解釋放出質(zhì)粒，利用酚和氯仿抽提掉蛋白，再利用無水乙醇沉淀質(zhì)粒DNA質(zhì)粒提取試劑盒：裂解方法一致。裂解完成后利用過濾柱純化出質(zhì)粒DNA質(zhì)粒提取后，根據(jù)以后實驗要求利用不同的限制性內(nèi)切酶在水浴鍋中進行酶切電泳，用凝膠成像系統(tǒng)分析測序水稻基因組DNA的提取、純化和分析利用SDS法或Qiagen提供的基因組提取試劑盒提取水稻基因組DNA：利用SDS在高

16、鉀離子濃度的情況下能沉淀蛋白和多糖等雜質(zhì)的原理提取基因組DNA利用酚-氯仿抽提或過濾柱純化基因組DNA水稻基因組文庫的構(gòu)建利用特異的探針，通過Southern blotting檢測目標基因的拷貝數(shù)水稻各器官Total RNA的提取、純化和分析分離所需的水稻各器官組織，并利用Qiagen的RNeasy系列試劑盒提取總RNA：將材料裂解后，通過過濾柱純化出總RNA在RNase-free的情況下，通過甲醛變性膠電泳檢測總RNA的質(zhì)量利用特異性的探針，通過Northern blotting檢測目標基因在各器官的表達情況Southern blotting基因組DNA完全消化探針制備瓊脂水平電泳比活性測定

17、印跡轉(zhuǎn)膜DNA交聯(lián)限制性內(nèi)切酶、恒溫水浴鍋手提紫外燈、電泳儀器真空轉(zhuǎn)膜儀紫外交聯(lián)儀同位素檢測儀探針制備試劑盒尼龍膜制備好的尼龍膜探針（放射性或非放射性）雜交雜交箱放射自顯影熒光同位素檢測儀磷屏成像系統(tǒng)熒光掃描成像系統(tǒng)克隆化基因的表達及表達蛋白的純化和功能分析克隆化基因的表達表達蛋白的純化 功能分析克隆化基因的表達基因的克隆：利用高保真的Taq酶和合適的反應(yīng)系統(tǒng)，通過PCR獲得與目標基因完全一致的DNA片段（通過測序確證）體內(nèi)表達：選擇合適的表達載體插入目標片段。利用化學方法或電轉(zhuǎn)化儀等手段轉(zhuǎn)入細胞表達體外轉(zhuǎn)錄和翻譯系統(tǒng)：兔網(wǎng)織紅細胞裂解物、小麥胚芽提取物等表達蛋白的純化SDS聚丙烯酰胺膠回收：

18、利用SDS聚丙烯酰胺膠分離不同大小的的蛋白。利用6HIS、GST（谷胱甘肽）等和親和樹脂純化：通過表達目標基因的融合蛋白，利用親和層析洗脫出目標蛋白自動核酸/蛋白純化工作站目標蛋白功能分析抗體的制備：多抗、單抗DNA-蛋白質(zhì)相互作用研究：Gel-shift實驗、蛋白質(zhì)磷酸化分析、酵母單雜交系統(tǒng)等蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用研究：酵母雙雜交系統(tǒng)、噬菌體表面展示技術(shù)等蛋白體內(nèi)表達研究Western blotting：利用抗原-抗體反應(yīng)，對蛋白質(zhì)混合物中的目標蛋白進行鑒別和定量免疫組織化學研究：通過切片技術(shù)和免疫反應(yīng)，利用特異抗體檢測特定蛋白在組織細胞內(nèi)的表達和定位蛋白質(zhì)芯片系統(tǒng)基因轉(zhuǎn)化實驗和轉(zhuǎn)基因結(jié)果分

19、析轉(zhuǎn)基因載體的構(gòu)建：載體、農(nóng)桿菌、特殊抗生素植株的轉(zhuǎn)化：葉盤轉(zhuǎn)化法、基因槍植株的篩選：熒光檢測、GUS染色、PCR法基因功能分析：激光共聚焦顯微鏡、FISH等連接反應(yīng) 在滅菌的0.5mL離心管中進行。 10L體積反應(yīng)體系中： 2快速連接緩沖液 5L 目的基因的雙酶切產(chǎn)物 XL pMal-c2x質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物 XL T4-DNA連接酶 0.3L 輕輕混勻，室溫下放置過夜。注意事項：目的基因和 c2x質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物的加入比例應(yīng)根據(jù)電泳結(jié)果而定，使加入的2片段的濃度比為1：1剩下的酶切片段不要丟掉，留做轉(zhuǎn)化時做對照感受態(tài)菌的制備（1）E.coli TB1菌株37過夜培養(yǎng)以復蘇菌種，取過夜培養(yǎng)的菌液1

20、mL加入到50 mL LB培養(yǎng)基中，37，230 r/min振蕩培養(yǎng)3 h，至A600約為0.4左右。（2）無菌條件下，將50mL菌液轉(zhuǎn)移至離心管中，冰上放置10 min，使培養(yǎng)物冷卻至0。（3）在預冷4的離心機上以4000 r/min離心10min，棄去上清，加入5mL預冷的0.1mol/LCaCl2溶液重懸沉淀，冰浴上放置10 min。（4）以4000r/min在4離心10min，棄去上清，每50mL初始培養(yǎng)物用2mL預冷的含有10%20%甘油的0.1mol/LCaCl2溶液重懸細胞沉淀，100L/管分裝，于-70條件下，可保存半年。注意事項：細胞一旦離開培養(yǎng)基，實驗操作要輕柔。整個實驗過

21、程中注意將細胞置于冰上不能搖過了！選用處于對數(shù)生長期的細胞預先冷卻pMal-ade重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化（1）向分裝有100LE.coli TB1菌株感受態(tài)細胞的EP管中加入2 L的上步中得到的連接混合物，輕輕旋轉(zhuǎn)以混合內(nèi)容物，冰浴上放置30 min。（2）將該EP管放入預加溫至42的水浴中，放置90s，快速轉(zhuǎn)移到冰浴中，使細胞冷卻12 min。 （3）向EP管加入900 L LB培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)移至37搖床上，150r/min，溫育45 min以復蘇菌株。（4）將200L上述培養(yǎng)物加到含100g/mL氨卞青霉素的LB平板上（平板表面涂有20mg/mL的X-gal 40L和20mg/mL的IPTG 40L）

22、，以玻璃涂布棒輕輕地將轉(zhuǎn)化細胞平鋪于瓊脂平板表面。（5）將平板置于室溫下至液體被完全吸收，倒置平皿，37過夜培養(yǎng)；水浴溫度要準確，熱擊時不要搖動EP管UNIQ-10柱式質(zhì)粒小量抽提將過夜培養(yǎng)的12ml細菌12,000rpm離心15秒，徹底去除上清。加入100l Solution I，用槍頭或振蕩器充分懸浮細菌。加入200 l Solution II，立即溫和混勻（傾斜45度角，順一個方向，慢慢旋轉(zhuǎn)離心管），使細菌裂解，室溫放置2分鐘。加入350l Solution III，立即上下顛倒510次，使之充分中和，室溫放置2分鐘。12,000rpm，離心5分鐘。 將步驟5中上清轉(zhuǎn)移到套放于2.0-m

23、l收集管內(nèi)的UNIQ-10柱中，8,000rpm室溫離心15秒。棄收集管中的廢液，將UNIQ-10柱放入同一支收集管中，吸取500l Wash Solution到UNIQ-10柱，10,000rpm室溫離心30秒。重復步驟7。棄收集管中的廢液，將UNIQ-10柱放入同一支收集管中，10,000rpm室溫離心30秒以徹底去除Wash Solution。將UNIQ-10柱放入新的潔凈1.5-ml離心管中，加50l Elution Buffer，室溫放置2分鐘后，10,000rpm室溫離心1分鐘。離心管中的溶液即為所抽提的質(zhì)粒DNA。注意：對于低拷貝數(shù)的質(zhì)粒，請用25ml細胞，同時按比例相應(yīng)提高So

24、lution I，II和III的用量。在執(zhí)行步驟5后，將上清分批加入到UNIQ-10柱中，重復步驟6，直至處理完所有樣品。不能劇烈混合，否則會出現(xiàn)基因組DNA污染。不要吸取沉淀，否則會出現(xiàn)基因組 DNA和蛋白質(zhì)污染。：（1）如果要提高質(zhì)粒的濃度，可以用30l Elution Buffer，37或50下放置2分鐘，10,000rpm室溫離心1分鐘。（2）5580洗脫可提高回收率1020個百分點。PCR篩選1、調(diào)整模板（ pMal-ade重組質(zhì)粒）濃度至 5 ng/ L。2、按下列體系配制反應(yīng)混合液，混勻， Template DNA 1.0 L（ 20 ng ）10 buffer 2.0 LMgC

25、l2（25mmol/L） 1.5 LPrimer 1 (10mol/L) 0.5 LPrimer 2 (10mol/L) 0.5 LdNTPs （2mmol/L） 2.0 LTaq酶 （5U/L） 0.5L加ddH2O至 20L外源基因的特異引物：引物1（5-CCG GAA TTC TTG AAT AAA GAA GCG CTA GTC3）和引物2（5-CGG GGA TCC GTC GAC TTA TTG CAG TGA TAT GTG TTG3）。3PCR 反應(yīng)循環(huán)條件設(shè)置 94變性反應(yīng)1min； 55退火反應(yīng)45s； 72延伸反應(yīng)1min。 進行25個循環(huán)后，最后一個循環(huán)72延長至10m

26、in。迅速冷卻4。 4、檢測 加 2L溴酚藍和10L 反應(yīng)產(chǎn)物，混勻，取 15L 反應(yīng)產(chǎn)物點樣電泳。5、成像分析 在 1% 的瓊脂糖凝膠上點樣電泳0.51h，電泳結(jié)束后EB 染色1520min，凝膠成像分析結(jié)果。 pMD18-T VectorpMD18-T Vector是一種高效克隆PCR產(chǎn)物(TA Cloning) 的專用載體。這種載體由pUC18載體改建而成，在pUC18載體（參見第12章基因工程的載體）的多克隆位點處的XbaI和SalI識別位點之間插入了EcoR V識別位點，用EcoR V進行酶切反應(yīng)后，再在兩側(cè)的3端添加T 而成。因大部分耐熱性DNA聚合酶進行PCR反應(yīng)時都有在PCR產(chǎn)

27、物的3末端添加一個 A 的特性，所以使用這種制品可以大大提高PCR產(chǎn)物的連接、克隆效率。 EcoR V -T-cloning sitecDNA文庫應(yīng)用分離新基因的方法發(fā)現(xiàn)并分離克隆新基因始終是分子生物學研究的主要任務(wù)和目的，雖然cDNA文庫的用途很多，但是，應(yīng)用于分離新基因是其最重要的用途。前述的不管是哪種類型的cDNA文庫，都可以用于分離新基因，只是使用的方法有差異。分離方法主要有兩種：第一，對于非全長 cDNA文庫，即不管是經(jīng)典的cDNA文庫方法或差減法構(gòu)建的cDNA文庫，需要利用已經(jīng)獲得的新cDNA序列片段，通過RACE方法獲得新基因的全長序列。第二，利用全長cDNA文庫與目的基因片段作

28、為探針的雜交篩選。從非全長cDNA文庫中篩選新基因 3.1.1RACE法 RACE文庫即快速擴增cDNA末端法 (RapidAmplificationofcDNAEnd，RACE)只需知道m(xù)RNA內(nèi)很短的一段序列即可擴增出其 cDNA的5(5RACE)和3端(3RACE)。該法的主要特是利用一條根據(jù)已知序列設(shè)計的特異性引物和一條與 mRNA的PolyA(3RACE)或加至第一鏈cDNA3端的同聚尾(5RACE)互補的通用引物，由于同聚體并非良好的PCR引物，同時為了便于RACE產(chǎn)物的克隆，可向同聚體引物的5端內(nèi)加入一內(nèi)切酶位點。所用的cDNA模板可以使用多聚dT引物延伸合成(3，5-RACE均可)。當RACEPCR產(chǎn)物為復雜的混合物時，可取部分產(chǎn)物作模板，用另一條位于原引物內(nèi)側(cè)的序列作為引物與通用引物配對進行另一輪PCR(巢式PCR