1、第五章 微生物營養與生長營養(nutrition)：微生物體從外部環境中攝取對其生命活動必須的能量和物質，以滿足正常生長和繁殖需要的一種最基本的生理功能。第一節 微生物的營養及其對微生物生長的影響 一、微生物的營養因子 營養物質（nutrient）：能夠滿足微生物生長、提供構建細胞成份的原料或提供能量的物質稱為大量營養元素：需要量較高的營養物質，濃度通常要達到10-310-4mol/L或更高，包括C、H、O、N、P、S 、K+、Na+、Ca2+、Mg2、Fe2+。微量營養元素：需要量較少的營養物質稱, 環境中微量元素所需濃度通常為10-610-8 mol/L, 包括Mn2+、Co2+、Zn2+

2、、Cu2+、Mo2+、Ni2+等。（一）碳源(carbon source) 提供微生物營養所需碳元素的營養源。 有機碳源：蛋白質，核酸，淀粉，葡萄糖等 無機碳源： CO2 , Na2CO3 , CaCO3等 速效碳源: 葡萄糖可以被迅速分解利用，是速效碳源遲效碳源: 淀粉等多糖類物質，需要分泌胞外酶進行 水解才能被吸收利用，是遲效碳源。 異養微生物：必須利用有機碳源 自養微生物：能利用無機碳源糖類： 葡萄糖，果糖，麥芽糖，蔗糖，淀粉，半乳糖，乳糖，甘露糖，纖維二糖，纖維素，半纖維素，甲殼素，木質素，等 有機酸： 乳酸，檸檬酸，延胡索酸，低級脂肪酸，高級脂肪酸，氨基酸，等 醇類： 乙醇，等 脂類

3、： 脂肪，磷脂，等 烴類： 天然氣，石油，石油餾分，石蠟油 ，等 CO2 碳酸鹽： NaHCO3, CaCO3, 白堊，等 其他： 芳香族化合物，氰化物，蛋白質，肽，核酸微生物可利用的碳源(化合物分類)不同種類微生物利用碳源物質的能力有差異。在微生物研究和發酵試驗中，常常需要研究微生物培養的最佳碳源 有機氮源：牛肉膏、蛋白胨、黃豆粉、玉米漿、尿素等 無機氮源：KNO3、(NH4)2SO4、NH3等 氣態氮源：大氣N2（二）氮源(nitrogen source)凡能提供微生物營養所需氮元素的營養源。氮源一般不作能源。 速效氮源 遲效氮源 氨基酸自養型微生物 氨基酸異養型微生物生理酸性鹽: 微生物

4、代謝后形成酸性物質的某些無機氮源如 硫酸銨。生理堿性鹽: 微生物代謝后產生堿性物質的某些無機氮源如 硝酸鈉。 不同種類微生物對不同碳源物質的利用能力不一樣。在微生物培養和發酵研究中，也需要研究微生物培養的最佳碳源（三）無機鹽 (inorganic salts)所需濃度在10-3-10-4M 的元素為大量元素所需濃度在10-6-10-8M 的元素為微量元素一類對微生物正常代謝必不可少且又不能從簡單的碳源，氮源自行合成的、所需極微量的有機物。培養基中生長因子來源：酵母膏、玉米漿、麥芽汁等。(四) 生長因子(growth factor)作用：輔酶或酶活化所需。狹義：維生素 廣義：維生素、氨基酸、堿基

5、、脂肪酸等 生長因子自養型微生物（auxoautotrophs) 生長因子異養型微生物（auxoheterotrophs) 營養缺陷型微生物（nutritional deficiency)變株 生長因子過量合成型微生物 能為微生物的生命活動提供最初能量來源的化學物質或輻射能。（五）能源(energy source)異養微生物的碳源同時也是能源無機物：化能自養微生物的能源（不同于碳源）能源譜化學物質輻射能：光能自養和光能異養微生物的能源有機物：化能異養微生物的能源（同碳源） 依碳源不同： 異養型(heterotrophs): 不能以CO2為主要或唯一碳源 自養型(autotrophs): 能以C

6、O2為主要或唯一碳源依能源不同： 光能營養型(phototrophs): 光反應產能 化能營養型(chemotrophs):物質氧化產能 依生長因子的不同： 原養型(prototroph)或野生型(wild type) 營養缺陷型(auxotroph) 微生物學家通常根據微生物對碳源和能源的利用不同，將它們分為四種類型 二、培養基培養基(culture medium or medium)：是人工配制的、適合微生物生長繁殖或者產生代謝產物的營養基質。 微生物對培養基要求特點：不同的微生物對營養物質的需要是不同的；同一種微生物在不同生長發育階段對營養物質要求有時是不同的；同一種微生物的菌體生長和生

7、產性狀的表現對營養物質的要求也會 表現出不同。 選擇和配制培養基的原則和方法（1）營養物質組成合理，濃度適當，滿足菌體生長需要；（2）在一定條件下，各原料之間不發生化學反應，理化性質相對 穩定；（3）粘度適中，具有適當滲透壓；（4）生產中選用的原材料盡量因地制宜，以降低成本；（5）理化性質適宜，pH、氧化還原電動勢也要滿足一定的要求。培養基按其組成的化學成分是否清楚可以分為：合成培養基、天然培養基；半天然培養基。1、合成培養基（synthetic medium，defined medium）：是一類用多種高純化學試劑培制成的、各成分（包括微量元素）的量都確切知道的培養基。2、天然培養基（com

8、plex medium; undefined medium）：是指利用一些天然原料制作的培養基，人們無法確切知道其成分。3、半合成培養基（semi-defined medium）：是指那些組成成分的部分化學成分清楚，部分化學成分不清楚的培養基。 固體培養基(solid medium)，一般加有凝固劑， 凝固劑含量一般為12。作為凝固劑的條件：不被微生物分解利用，生長溫度范圍內保持固體狀態，凝固點溫度對微生物無害，不因滅菌而破壞，透明度好、配制方便、價格低。常用的為瓊脂。明膠有時也用。由于固體培養基能提供表面，形成單菌落，因此可用于：菌種分離、鑒定、保藏等。 液體培養基(liquid mediu

9、m)，培養基中沒有凝固劑。用途：大量培養微生物，研究生理代謝等。 半固體培養基(semi-solid medium)，凝固劑含量一般約為0.5% 。 用途：觀察細菌的運動，測定噬菌體效價等。按培養基外觀的物理狀態：固體、半固體、液體。培養基固化物瓊脂與明膠的比較化學成分營養價值分解性融化溫度凝固溫度常用濃度透明度粘著力耐加壓滅菌瓊脂聚半乳糖的硫酸酯無罕見960C400C1.52%高強強明膠蛋白質作氮源極易250C200C512%高強弱按照用作培養微生物的種類：常用的細菌培養基有營養肉湯和營養瓊脂培養基；常用的放線菌培養基為高氏1號培養基；常用的酵母菌培養基有馬鈴薯蔗糖培養基和麥芽汁培養基；常用

10、的霉菌培養基有馬鈴薯蔗糖培養基、豆芽汁葡萄糖（或蔗 糖）瓊脂培養基和察氏培養基等。 微生物培養基按用途不同可以分成不同類型 1、孢子培養基(spores formation medium)：供菌體繁殖孢子的培養基。基本配制要求：營養(有機氮源)偏低；無機鹽濃度適量；注意pH和濕度。孢子培養基可以供產生孢子使用，這在工業生產上使用孢子進罐的產品十分重要。2、種子培養基(seed medium)：供孢子發芽、生長和繁殖的培養基。基本要求：采用營養豐富完全的有機氮源；濃度偏稀；無機氮源與有機氮源比例適當。由于種子質量對發酵水平影響大，該培養基還應注意與發酵培養基的關系。3、發酵培養基(ferment

11、ation medium)：供菌體生長、繁殖與合成產物之用。基本要求：菌體生長與合成產物所需的元素、化合物以及前體、促進劑等因素的考慮。對于微生物不同的發酵時期，營養要求的分期差異可用補料方式解決。 4、鑒別培養基(differential medium)：微生物往往有特定的代謝過程和產物。在培養基中加上特定的指示劑以鑒別是否產生某步反應的培養基。常見的鑒別培養基有：鑒別革蘭氏陽性與陰性菌的伊紅美藍培養基。5、選擇培養基(selected medium)與富集培養基(enrichment medium)：在進行菌種篩選時，可以在培養基中加入特定的物質，抑制不需要的菌生長，而允許需要的菌生長，這

12、種培養基就稱為選擇培養基。比如在篩選土壤中的酵母菌時，可以加入鏈霉素抑制細菌。向培養基中加入某種適合某一類微生物生長的物質的培養基稱為富集培養基。常見的富集培養基有纖維素富集培養基用作纖維素分解菌的增殖。6、加富培養基(rich medium)：一些微生物在培養時，可能需要加入特定的營養物質，營養比一般培養基豐富，稱為加富培養基。比如培養一些人體病原菌要加入血清，培養一些營養缺限型菌種要加入特定營養成分。三、微生物的培養根據氧氣的需要與否分為兩大類： 好氧培養 厭氧培養 根據培養基的物理特性分為兩大類： 固體培養 液體培養 研究和開發適合微生物生長的培養基是為了在人工控制條件下對微生物進行培養

13、。1）固體好氧培養方法 瓊脂斜面和瓊脂平皿培養1、好氧培養方法 （一）微生物的培養方法香菇固體栽培床2） 液體好氧培養方法 恒溫振蕩培養箱實驗室小型全自動發酵罐2、厭氧培養方法 微生物厭氧培養箱工業發酵車間（二）微生物純培養與混合培養 研究微生物生長通常采用微生物純培養。 微生物學中將在實驗條件下從一個單細胞繁殖得到的后代稱為純培養。 自然環境如土壤和水中，通常棲息著的是許多不同微生物混雜在一起的群體。哪怕是一粒砂或塵土，也常含有多種細菌及其它微生物。這種含有一種以上微生物的培養稱作混合培養。 微生物純培養的分離方法一稀釋涂布法分離微生物微生物純培養的分離方法二稀釋倒平板法分離微生物微生物純培

14、養的分離方法三平板劃線法分離微生物（三）微生物純培養的保藏通過分離純化得到的微生物純培養物，還必須通過各種保藏技術使其在一定時間內不死亡，不會被其它微生物污染，不會因發生變異而丟失重要的生物學性狀，否則就無法真正保證微生物研究和應用工作的順利進行。菌種或培養物保藏是一項最重要的微生物學基礎工作，微生物菌種是珍貴的自然資源，具有重要意義，許多國家都設有相應的菌種保藏機構，例如，中國微生物菌種保藏委員會（CCCCM），美國典型菌種保藏中心（ATCC），荷蘭的霉菌中心保藏所（CBS），英國的國家典型菌種保藏中心（NCTC）以及日本的大阪發酵研究所（IFO）等。國際微生物學聯合會（IAMS）還專門設立

15、了世界菌種保藏聯合會（WFGC），用計算機儲存世界上各保藏機構提供的菌種數據資料，可以通過國際互聯網查詢和索取，進行微生物菌種的交流、研究和使用 。生物的生長一般都需要一定的水分，適宜的溫度和合適的營養，微生物也不例外。菌種保藏就是根據菌種特性及保藏目的的不同，給微生物菌株以特定的條件，使其存活而得以延續。例如利用培養基或宿主對微生物菌株進行連續移種，或改變其所處的環境條件，例如干燥、低溫、缺氧、避光、缺乏營養等，令菌株的代謝水平降低，乃至完全停止，達到半休眠或完全休眠的狀態，而在一定時間內得到保存，有的可保藏幾十年或更長時間。在需要時再通過提供適宜的生長條件使保藏物恢復活力。 菌種保藏原理1

16、. 傳代培養保藏 2. 冷凍保藏 196液氮保藏 70低溫冰箱 2030的普通冰箱 3. 干燥保藏法 沙土管保存冷凍真空保藏 四、微生物對營養物質的吸收 （一）被動運輸 被動運輸（passive transport）依賴物質的擴散作用，不消耗能量，只有當細胞外物質濃度高于細胞內濃度時才發生。 1、單純擴散 單純擴散（simple diffusion）實際上是物質的自由擴散，是物質從高濃度擴散到低濃度的過程，其速率和細胞內外該物質的濃度梯度有關。1）需要該營養物質在細胞內外有足夠高的濃度梯度；2）單純擴散作用不能使擴散過程加速；3）對可擴散物質也沒有選擇性；4）不需要載體，可自由穿過細胞膜的物質

17、都可通過單純擴散作用進入細胞。但實際上只有極少數物質可自由穿過細胞，如H2O，CO2，O2等小分子就是通過單純擴散作用進入細胞的。 2、促進擴散 促進擴散（facilitated diffusion）是在載體蛋白(carrier protein)的幫助下，物質由高濃度擴散到低濃度的不消耗能量的過程。載體蛋白鑲嵌在質膜中。可以在物質濃度高的細胞一側結合該分子，然后穿過細胞膜在濃度低的一側釋放該分子，由于不消耗能量，僅僅協助物質從高濃度向低濃度擴散，因此稱為促進擴散。1）促進擴散作用可以加快擴散速度。2）促進擴散作用具有飽和效應，促進擴散隨著物質濃度增加，但是促進擴散最高濃度達到一定的程度，則擴散

18、速率達到一個穩定速度后就不再增加，運載蛋白處于飽和狀態；3）促進擴散作用需要運載蛋白，運載蛋白具有溶質特異性；4）促進擴散作用不消耗能量，膜兩邊的濃度梯度是其運動的動力，如果物質濃度梯度消失，則物質運輸的動力將消失。 促進擴散在原核生物物質吸收中不是很多，已知在E. coli 和其它一些細菌中，甘油可以通過促進擴散進入細胞內。在真核生物中，很多營養物質是通過促進擴散來吸收的，它常用來運輸不同的糖和氨基酸。促進擴散示意圖胞外細胞膜胞內 （二）主動運輸 促進擴散雖然已有很高的效率，但是外界物質低于內部溶質時，則不能發揮作用。微生物常生活在營養物質極低的環境中。在這種環境中，它必須能夠將營養物質運輸

19、到體內。這樣協助擴散是不夠的，必須要通過主動運輸（active transport）。 主動運輸就是細胞利用質膜上特異性運載蛋白和代謝能量，逆濃度梯度將物質從細胞外運輸到細胞內的過程。 主動運輸主要有三種類型： 離子偶聯運輸（ion-coupled transport） ABC運輸（ABC transport） 基團移位(group translocation)。 1、離子偶聯運輸 離子偶聯運輸是通過電子傳遞或膜ATP酶質子泵所建立的跨膜電化學梯度（質子或鈉離子梯度）所驅動，也就是說在離子偶聯運輸發生之前，先要建立跨膜電化學梯度。離子偶聯運輸僅僅需要跨膜運輸蛋白參與，與其它類型的主動運輸方式相

20、比較簡單，故又稱簡單運輸（simple transport）。離子偶聯運輸又可分為單向運輸（uniport）、同向運輸(symport)、逆向運輸(antiport)三種類型。單向運輸：是指以向膜一側單方向運輸一種物質；同向運輸：是指向膜一側運輸一種物質的同時，伴隨著向同一側運輸另一種物質（通常是質子）；逆向運輸：是指向膜一側運輸一種物質的同時，向膜另一側（相反方向）運輸另一種物質。 細胞內細胞外(或細菌周質空間)電子轉運1. 電子轉移能被用來將質子泵出膜外2. 質子梯度通過反運輸機制將鈉離子逐出膜外 3. 鈉離子與載體蛋白復合物相結合4. 溶質結合位點的形狀發生改變，而與溶質(如糖和氨基酸)結合5. 載體蛋白的構象發生改變，鈉離子在膜內釋放，隨后溶