1、引物設計原則及設計引物設計原則及設計軟件軟件引物（primers) 引物是人工合成的兩段寡核苷酸序列，一個引物與感興趣區域一端的一條DNA模板鏈互補，另一個引物與感興趣區域另一端的另一條DNA模板鏈互補。3355Sense primerAntisense primerSense primerAntisense primer選擇模板序列保守區域選擇模板序列保守區域1、引物設計原則 引物長度 堿基分布的均衡性 Tm值 引物二級結構 引物3端 引物5端 引物的內部穩定性 自由能分布引物長度 一般引物的長度為15-30 bp，常用的長度為18-21bp。過長或過短都不合適，為過長會導致其延伸溫度大于7

2、4，不適于Taq DNA聚合酶進行反應，長度大于24 核苷的引物并不意味著更高的特異性，而且比短序列雜交慢，從而降低了產量。引物過短會引起錯配現象，一般來說引物長度大于16bp是必要的（18bp的序列在人類基因組中只會出現一次）。決定引物退火溫度（決定引物退火溫度（Tm值）最重要的因素就是引物的長度值）最重要的因素就是引物的長度Tm =（g + C）* 4 +（a + T）* 2 同一堿基連續出現不應超過5個 GC含量一般40-60%，以45-55為宜 GC含量太低導致引物Tm值較低，使用較低的退火溫度不利于提高PCR的特異性 GC含量太高也易于引發非特異擴增。堿基分布的均衡性有一些模板本身的

3、有一些模板本身的GC 含量偏低或偏高，導致引物的含量偏低或偏高，導致引物的GC含量不能在上述范圍含量不能在上述范圍內，這時應盡量使上下游引物的內，這時應盡量使上下游引物的GC 含量以及含量以及Tm 值保持接近值保持接近（上下游引物的（上下游引物的GC含量不能相差太大）含量不能相差太大），以有利于退火溫度的選擇。，以有利于退火溫度的選擇。引物Tm值 一般要求：55-65。 應盡可能保證上下游引物Tm值一致，一般差異控制在2 以內。 （引物的退火溫度相差小于5一般不會影響PCR的產率，理想情況下一對引物的退火溫度是一樣的，可以在5580間變化，有說接近72為最佳） 上下游引物Tm值與產物Tm值一般

4、應控制在20 以內。 一般采用較低引物Tm值-5作為PCR退火溫度。一對引物的一對引物的GC含量和含量和Tm值應該協調。若是引物存在嚴重的值應該協調。若是引物存在嚴重的GC傾向或傾向或AT傾向則可以傾向則可以在引物在引物5端加適量的端加適量的A、T或或G、C尾巴。若尾巴。若G+C含量太低，可在含量太低，可在5端加上一些端加上一些G或或C，若若GC含量太高，可在含量太高，可在5端加上一些端加上一些A或或T。引物二級結構 引物二聚體（引物間不應多于4個連續堿基的同源性或互補性 ） 盡可能避免兩個引物分子之間3端有較多堿基互補 發夾結構（引物自身連續互補堿基不能大于3bp ） 尤其是要避免引物3端形

5、成發夾結構，否則將嚴重影響DNA聚合酶的延伸。（兩項結構的能值以不超過4.5為好，引物中間或5端可適當放寬）兩引物之間不應該存在互補性，尤應避免兩引物之間不應該存在互補性，尤應避免3端的互補重疊以防引物二聚體的形成。一端的互補重疊以防引物二聚體的形成。一般情況下，一對引物間不應多于般情況下，一對引物間不應多于4個連續堿基的同源性或互補性。個連續堿基的同源性或互補性。引物3端 引物的延伸從3端開始，因此3端的幾個堿基與模板DNA均需嚴格配對，不能進行任何修飾，否則不能進行有效的延伸，甚至導致PCR擴增完全失敗。 引物3端的堿基一般不用A（3端堿基序列最好是G、C、CG、GC）。另外引物間3端的互

6、補、二聚體或發夾結構也可能導致PCR反應失敗。3端的連續端的連續3 3個個G 或或C ，如如GGG或或CCC，會導致引物在會導致引物在G+CG+C富集序列區錯誤富集序列區錯誤引發引發引物5端 引物5端可以有與模板DNA不配對堿基（對對PCR 影響不影響不大）大），常在5端引入修飾位點或標記物。 5端加上限制性核酸內切酶位點序列（酶切位點5端加上適當數量的保護堿基）。 5端的某一位點修改某個堿基，人為地在產物中引入該位點的點突變以作研究。 5端標記放射性元素或非放射性物質（如生物素、地高辛等）。雙酶切位點，有利于定向克隆，2-3個保護堿基，一般加CG。計算引物Tm 值時并不包括這些序列，但是應該

7、對其進行互補性和內部二級結構的檢測。 引物的內部穩定性 過去認為，引物3端應牢牢結合在模板上才能有效地進行延伸，故3端最好為G或C。 現在的觀點認為，引物的5端應是相對穩定結構，而3端在堿基配對的情況下最好為低穩定性結構，即3端盡可能選用A或T（有說不適宜用A），少用G或C。 若模板不很清楚，引物若模板不很清楚，引物3端最后一個堿基最好為端最后一個堿基最好為T，其次是其次是G或或C，而而不選不選A，國外資料表明，當末位為國外資料表明，當末位為T時，即使在錯配的情況下也能引發鏈的時，即使在錯配的情況下也能引發鏈的合成，而末位為合成，而末位為A時，錯配時引發大大降低，時，錯配時引發大大降低，G G

8、或或C居中，可見，模板很清居中，可見，模板很清楚時選楚時選A可以提高特異性可以提高特異性。自由能分布G 值是指DNA 雙鏈形成所需的自由能，該值反映了雙鏈結構內部堿基對的相對穩定性（結合的強弱程度結合的強弱程度）。一般情況下，引物的G值最好呈正弦曲線形狀，即5端和中間G值較高，而3端G值相對較低，且不要超過9 （絕對值，一般考慮末端5個堿基的G。此值的大小對擴增有較大的影響，負值大，則3末端穩定性高，擴增效率更高，同時也更易于異位引發。因此在復雜模板的擴增體系中，3末端5聚體的G應大于-9.0kcal/mol） ，如此則有利于正確引發反應而可防止，如此則有利于正確引發反應而可防止錯誤引發。錯誤

9、引發。引物的3端的G 值過高，容易在錯配位點形成雙鏈結構并引發DNA 聚合反應。（能值越高越容易結合能值越高越容易結合）33末端雙鏈的末端雙鏈的GG是是0 02 2 kcal/molkcal/mol時，時，PCRPCR產量幾乎達到百分之百，隨產量幾乎達到百分之百，隨著其絕對值的增加產量逐漸下降，在著其絕對值的增加產量逐漸下降，在6 6時只有時只有40%40%、到、到8 8時少于時少于20%20%、而、而1010時接近于時接近于0 0。引發效率（引物唯一性） 選用的引物序列就應當是唯一的，即在模板中沒有重復序列 好的設計工具會提供一個引物異位引發的評價指標，好的設計工具會提供一個引物異位引發的評

10、價指標，如如Oligo 6.0 Oligo 6.0 的的false priming efficiencyfalse priming efficiency，即異位引發即異位引發效率，這個值是由程序根據引物自身二級結構的能量、錯效率，這個值是由程序根據引物自身二級結構的能量、錯配的類型、錯配離配的類型、錯配離33末端的距離等因素綜合計算而得出，末端的距離等因素綜合計算而得出，當此值大于當此值大于200200時便很有可能引發擴增。如所用工具無量時便很有可能引發擴增。如所用工具無量化指標，則可依據經驗，當引物與模板在非預期位置退火，化指標，則可依據經驗，當引物與模板在非預期位置退火，超過超過70%70

11、%的堿基能互補配對，或引物的堿基能互補配對，或引物3 3末端連續末端連續8 8個或以個或以上堿基配對，則認為有引發的可能。上堿基配對，則認為有引發的可能。2、引物設計軟件、引物設計軟件 Oligo 6 （引物評價）* Primer Premier （自動搜索）* Vector NTI Suit （綜合分析） Primer Express(實時定量PCR引物和探針設計) Omiga Dnastar Primer3 （在線服務）*3、同源序列比較、同源序列比較 NCBINCBI的的BLASTBLAST; ExPASy的Alignment GeneDoc 3.2 Clustal X Vector N

12、TI Omiga，Bioxm ，LaserGene，pcgene等引物同源性分析 用BlastBlast軟件進行同源性比較 盡可能選擇與非目的基因同源性小的序列作為引物 選擇3端與非目的基因不同源的序列作為引物 選擇兩個引物3端與同一非目的基因不同源的序列作為引物參數設置默認引物長度 - 默認值為25引物對搜索最大值 - 默認值為100核酸濃度 -默認值為250 pM單價離子濃度 - 默認值為50 mM游離Mg2+離子濃度 - 默認值為1.5 mM評分參數Rating parameters 評分參數窗口是用來設定二級結構在引物評分中的權重系數二級結構越穩定引物評分就會越低相對于在引物中間形成的

13、二級結構來說3 末端的二級結構對PCR擴增的影響會更大為了將這一效應計算在內軟件將3 末端的二級結構的自由能數值G減去1 這一修正會使3 末端的二級結構顯得更加穩定參數設置載入序列Preimer Premier 啟動界面Load sequence粘貼序列窗口這一窗口使得一段核酸序列通過選擇以四種不同的方式粘貼上去（CTRL-V）基本信息Sequence nameOriginal sequenceUse these two button to translate the DNA seq to a protein seq or a protein seq to a DAN seq 8種密碼子偏好Choose a function 引物設計界面First you can design the primer manuallySense st