1、7/4/2022 6:15 PM歡迎同學們聽課！Slide 1本課程內容本課程內容 第一章第一章 緒論緒論 第二章第二章 基因克隆的工具酶基因克隆的工具酶 第三章第三章 基因工程的載體基因工程的載體 第四章第四章 目的基因的制備目的基因的制備 第五章第五章 目的基因導入和重組子的篩選目的基因導入和重組子的篩選 第六章第六章 外源基因的表達外源基因的表達 第七章第七章 基因操作的基本技術基因操作的基本技術 第八章第八章 植物基因工程及應用植物基因工程及應用 第九章第九章 動物基因工程及應用動物基因工程及應用 第十章第十章 醫學基因工程及應用醫學基因工程及應用7/4/2022 6:15 PM歡迎同

2、學們聽課！Slide 2第五章第五章 目的基因導入和重組子的篩選目的基因導入和重組子的篩選5.1 DNA片段的連接重組片段的連接重組5.2 受體細胞選擇的基本原則受體細胞選擇的基本原則5.3 基因轉移基因轉移5.4 重組子的篩選重組子的篩選7/4/2022 6:15 PM歡迎同學們聽課！Slide 35.1 DNA片段的連接重組片段的連接重組5.1.1 DNA連接類型連接類型5.1.2 DNA片段之間連接的方式片段之間連接的方式5.1.3 DNA重組中需注意的問題重組中需注意的問題7/4/2022 6:15 PM歡迎同學們聽課！Slide 4DNA分子連接分子連接 不同的不同的DNA片段（目的

3、基因和載體）經適片段（目的基因和載體）經適當酶切后，在當酶切后，在連接酶連接酶的作用下，連接在一起構的作用下，連接在一起構建成重組建成重組DNA分子分子 。7/4/2022 6:15 PM歡迎同學們聽課！Slide 55.1.1 DNA重組（連接）的類型重組（連接）的類型 插入重組插入重組: 載體上只有唯一的酶識別位點載體上只有唯一的酶識別位點 隨機（非定向）插入隨機（非定向）插入 置換重組置換重組 (1) 載體上有兩個同樣的酶識別位點載體上有兩個同樣的酶識別位點 隨機（非定向）置換隨機（非定向）置換 (2) 載體上有兩個不同的酶識別位點載體上有兩個不同的酶識別位點 定向置換定向置換7/4/2

4、022 6:15 PM歡迎同學們聽課！Slide 65.1.2 DNA片段之間連接的方式片段之間連接的方式 具互補黏性末端片段之間的連接具互補黏性末端片段之間的連接 具平末端具平末端DNA片段之間的連接片段之間的連接 DNA片段末端修飾后進行的連接片段末端修飾后進行的連接 DNA片段加片段加linker or adaptor后的連接后的連接7/4/2022 6:15 PM歡迎同學們聽課！Slide 75.1.3 DNA重組中需注意的問題重組中需注意的問題兩端具相同粘性末端的兩端具相同粘性末端的DNA分子會發生自分子會發生自身環化。身環化。對于置換重組，需將切割的對于置換重組，需將切割的DNA分

5、子經過分子經過凝膠電泳分離，回收目的片段。凝膠電泳分離，回收目的片段。無論單酶切還是雙酶切，目的無論單酶切還是雙酶切，目的DNA分子均分子均可能發生串聯，必需檢測重組可能發生串聯，必需檢測重組DNA插入片插入片段的分子大小。段的分子大小。7/4/2022 6:15 PM歡迎同學們聽課！Slide 85.2 受體細胞及其選擇的基本原則受體細胞及其選擇的基本原則5.2.1 受體細胞受體細胞5.2.2 受體細胞選擇的基本原則受體細胞選擇的基本原則7/4/2022 6:15 PM歡迎同學們聽課！Slide 95.2.1 受體細胞受體細胞 受體細胞受體細胞（receptor cell）：）：又稱為宿又稱

6、為宿主細胞或寄主細胞（主細胞或寄主細胞（host cell） 從實驗技術上講從實驗技術上講：是能攝取外源：是能攝取外源DNA并使其穩定維持的細胞。并使其穩定維持的細胞。 從實驗目的上講從實驗目的上講：是有應用價值和理論：是有應用價值和理論研究價值的細胞。研究價值的細胞。7/4/2022 6:15 PM歡迎同學們聽課！Slide 105.2.2 受體細胞選擇的原則受體細胞選擇的原則 外源外源DNA分子能穩定存在，限制酶缺陷型；分子能穩定存在，限制酶缺陷型； 重組基因缺陷型；重組基因缺陷型； 易于轉化易于轉化/ 轉導；轉導； 易篩選易篩選 遺傳穩定性高，易于擴大培養；遺傳穩定性高，易于擴大培養；

7、安全性高；安全性高； 內源蛋白酶基因缺失或缺陷；內源蛋白酶基因缺失或缺陷； 遺傳密碼無明顯偏好性；遺傳密碼無明顯偏好性； 具有較好的轉譯加工機制；具有較好的轉譯加工機制； 較高的理論和實踐應用價值。較高的理論和實踐應用價值。7/4/2022 6:15 PM歡迎同學們聽課！Slide 115.3 基因轉移（基因轉移（gene transfer） 載體與目的基因連接后，體系中可能存在下列分載體與目的基因連接后，體系中可能存在下列分子：子：a. a. 未連接的載體分子未連接的載體分子b. b. 未連接的未連接的DNADNA片段片段c. c. 載體的自連載體的自連d. d. 含有錯誤插入片段的重組含有

8、錯誤插入片段的重組DNADNA分子分子e. e. 重組重組DNADNA分子分子轉化過程中，這些分子同時被轉移到宿主細轉化過程中，這些分子同時被轉移到宿主細胞內。未連接的分子即使被細菌攝取，只有在特胞內。未連接的分子即使被細菌攝取，只有在特殊的條件下才能復制，寄主的酶可降解這些殊的條件下才能復制，寄主的酶可降解這些DNADNA片片段。自連的載體和錯誤插入的重組質粒可以進入段。自連的載體和錯誤插入的重組質粒可以進入7/4/2022 6:15 PM歡迎同學們聽課！Slide 12 宿主細胞進行正常的復制。因此，需要將宿主細胞進行正常的復制。因此，需要將重組克隆鑒定出來。重組克隆鑒定出來。 把重組把重

9、組DNA導入受體細胞進行擴增導入受體細胞進行擴增 根據所用載體的特性選擇適宜的受體細胞根據所用載體的特性選擇適宜的受體細胞及選擇適宜的重組及選擇適宜的重組DNA導入的方式：轉化、導入的方式：轉化、轉染和轉導。轉染和轉導。7/4/2022 6:15 PM歡迎同學們聽課！Slide 135.3 基因轉移（基因轉移（gene transfer）5.3.1 重組質粒重組質粒DNA分子轉化大腸桿菌分子轉化大腸桿菌5.3.2 重組重組 噬菌體噬菌體DNA分子轉導大腸桿菌分子轉導大腸桿菌5.3.3 重組重組DNA分子轉入真核細胞分子轉入真核細胞7/4/2022 6:15 PM歡迎同學們聽課！Slide 14

10、5.3.1 重組質粒重組質粒DNA分子轉化大腸桿菌分子轉化大腸桿菌5.3.1.1 細菌轉化的機制細菌轉化的機制5.3.1.2 化學轉化法化學轉化法（CaCl2誘導大腸桿菌轉化法）誘導大腸桿菌轉化法）5.3.1.3 電激法（電穿孔轉化法）電激法（電穿孔轉化法）5.3.1.4 轉化率的計算及其影響因素轉化率的計算及其影響因素7/4/2022 6:15 PM歡迎同學們聽課！Slide 155.3.1.1 細菌轉化的機制細菌轉化的機制 轉化轉化(transformation)： 重組質粒重組質粒DNA分子通過與膜蛋白結合進入受體分子通過與膜蛋白結合進入受體細胞，并在受體細胞內穩定維持和表達的過程稱為細

11、胞，并在受體細胞內穩定維持和表達的過程稱為轉化。轉化。自然界中，轉化并不是細菌或的遺傳信息的主自然界中，轉化并不是細菌或的遺傳信息的主要方式，實驗室中只有小部分的細菌可以很容易的要方式，實驗室中只有小部分的細菌可以很容易的轉化，進一步的研究發現，這類細菌含有轉化，進一步的研究發現，這類細菌含有DNADNA結合和結合和吸收的代謝機制。正常條件下，大部分細菌包括大吸收的代謝機制。正常條件下，大部分細菌包括大腸桿菌，只能吸收有限的腸桿菌，只能吸收有限的DNADNA，為了提高轉化效率，為了提高轉化效率，建立了一系列的轉化方法：建立了一系列的轉化方法：a. a. 熱激法轉化感受態細胞熱激法轉化感受態細胞

12、 b. PEGb. PEG介導的原生質體轉化介導的原生質體轉化 7/4/2022 6:15 PM歡迎同學們聽課！Slide 16c. c. 高壓電穿孔法轉化高壓電穿孔法轉化 d. d. 顯微注射法轉化顯微注射法轉化 e. e. 接合轉化接合轉化 f. f. 噬菌體轉染噬菌體轉染7/4/2022 6:15 PM歡迎同學們聽課！Slide 17表表4 41 1 大腸桿菌常用轉化方法的比較大腸桿菌常用轉化方法的比較轉轉 化化 方方 法法轉轉 化化 效效 率率Ca Ca 誘誘 導導10107-87-8原生質體轉化原生質體轉化10105-65-6噬菌體轉化噬菌體轉化10107-87-8電電 穿穿 孔孔

13、法法10106-96-9（100Kb100Kb）結結 合合 轉轉 化化10104-54-57/4/2022 6:15 PM歡迎同學們聽課！Slide 185.3.1.2 化學轉化法（化學轉化法（CaCl2誘導大腸桿菌轉誘導大腸桿菌轉化法）化法） 原理：原理：0C、低濃度（、低濃度（50100 mM）CaCl2，Ca2+改改變細胞膜的磷脂層結構，提高膜的通透性，而且增強變細胞膜的磷脂層結構，提高膜的通透性，而且增強進入細胞的進入細胞的DNA分子抗分子抗DNase的能力。的能力。 特點：特點：操作簡便，不需特殊儀器，一般實驗室均可進操作簡便，不需特殊儀器，一般實驗室均可進行。轉化率在行。轉化率在5

14、 1062 107個轉化子個轉化子/ g質粒質粒DNA范圍范圍內，完全可滿足常規克隆的需要。內，完全可滿足常規克隆的需要。7/4/2022 6:15 PM歡迎同學們聽課！Slide 195.3.1.2 化學轉化法（化學轉化法（CaCl2誘導大腸桿菌轉化法）誘導大腸桿菌轉化法） 感受態細胞制備：感受態細胞制備： 感受態細胞感受態細胞：指處于能吸收周圍環境：指處于能吸收周圍環境中中DNA分子的生理狀態的細胞。分子的生理狀態的細胞。 菌種活化、培養、收菌和進行菌種活化、培養、收菌和進行CaCl2處理。處理。 DNA分子轉化感受態細胞：分子轉化感受態細胞： 冰浴、冰浴、42C熱激、熱激、37 C恢復、

15、涂板培恢復、涂板培養。養。7/4/2022 6:15 PM歡迎同學們聽課！Slide 205.3.1.3 電激法（電穿孔轉化法）電激法（電穿孔轉化法） 原理原理：利用高壓電脈沖作用，在細菌細胞膜上進行電穿孔利用高壓電脈沖作用，在細菌細胞膜上進行電穿孔（electroporation），形成可逆的瞬間通道，促進外源），形成可逆的瞬間通道，促進外源DNA的有效吸收。的有效吸收。 特點特點： 1. 感受態細胞制備簡單；感受態細胞制備簡單； 2. 轉化率高達轉化率高達1091010個轉化子個轉化子/ g質粒質粒DNA； 3. 用途廣泛，但需特殊儀器電激儀。用途廣泛，但需特殊儀器電激儀。 除感受態細胞制

16、備及轉化與化學法不同之外，其余步驟包除感受態細胞制備及轉化與化學法不同之外，其余步驟包括所設轉化對照與化學法相均相同括所設轉化對照與化學法相均相同。7/4/2022 6:15 PM歡迎同學們聽課！Slide 215.3.1.4 轉化率的計算及其影響因素轉化率的計算及其影響因素 轉化率：轉化率： 是指是指DNA分子轉化受體菌獲得轉化子的效率。分子轉化受體菌獲得轉化子的效率。 轉化率計算：轉化率計算： 轉化子總數轉化子總數/DNA分子總數或質量分子總數或質量 或或 轉化子總數轉化子總數/受體細胞數受體細胞數 實際中按轉化子總數實際中按轉化子總數/DNA分子質量分子質量( g)計算計算7/4/202

17、2 6:15 PM歡迎同學們聽課！Slide 22影響轉化效率的因素影響轉化效率的因素受體細胞的感受態，它決定轉化因子能否被吸收進入受體細胞； 受體細胞的限制酶系統和其他核酸酶，它們決定轉化因子在整合前是否被分解； 受體和供體染色體的同源性，它決定轉化因子的整合；重組DNA 分子大小重組DNA純度、濃度7/4/2022 6:15 PM歡迎同學們聽課！Slide 235.3.2 重組重組 噬菌體噬菌體DNA分子轉導大腸桿菌分子轉導大腸桿菌 轉染轉染(transfection)： 采用與質粒采用與質粒DNA轉化受體細胞相似的方法，轉化受體細胞相似的方法，將重組將重組 噬菌體噬菌體DNA分子直接導入

18、受體細胞中的過分子直接導入受體細胞中的過程，稱為轉染。程，稱為轉染。 效率較低，效率較低，103104個噬菌斑個噬菌斑/ g DNA ，較難，較難滿足一般實驗要求，實踐中少用。滿足一般實驗要求，實踐中少用。 轉導轉導(transduction)： 是指通過是指通過 噬菌體（病毒）顆粒感染宿主細胞噬菌體（病毒）顆粒感染宿主細胞的途徑把外源的途徑把外源DNA分子轉移到受體細胞內的過程。分子轉移到受體細胞內的過程。 效率高，可達效率高，可達103104個噬菌斑個噬菌斑/ g DNA，需需進行體外包裝。進行體外包裝。7/4/2022 6:15 PM歡迎同學們聽課！Slide 24 體外裝配（體外裝配（

19、in vitro packaging）： DNA的轉染的轉染效率不高，如果將重組的效率不高，如果將重組的分子裝配成頭分子裝配成頭-尾結尾結構的病毒粒子，將極大的提高效率。構的病毒粒子，將極大的提高效率。7/4/2022 6:15 PM歡迎同學們聽課！Slide 25噬菌體轉化大腸桿菌的方法7/4/2022 6:15 PM歡迎同學們聽課！Slide 26噬菌體轉化大腸桿菌的方法7/4/2022 6:15 PM歡迎同學們聽課！Slide 27噬菌體的體外裝配 有兩種不同的系統可以應用：一種是cos位點突變的噬菌體的單品系系統。另一種系統需要兩種不同的缺陷品系一個是基因D的突變體，另一個品系是基因E

20、的突變體，由于蛋白質合成的缺陷。體外的裝配過程可以利用兩種不同培養物的混合物，含有完整的外殼蛋白，完成裝配過程。將裝配的噬菌體接入細菌就可以完成正常的侵染過程。7/4/2022 6:15 PM歡迎同學們聽課！Slide 28噬菌體體外裝配的兩種系統7/4/2022 6:15 PM歡迎同學們聽課！Slide 29噬菌斑 和M13噬菌體都能形成噬菌斑，形成的是真正的噬菌斑(透明)，是由于細胞的裂解引起的；而M13的噬菌斑是渾濁的，因為細胞并未裂解，它引起的是細菌生長的減慢，而使細菌的濃度低于周圍細胞。7/4/2022 6:15 PM歡迎同學們聽課！Slide 30重組噬菌體的鑒定 （一）利用插入失

21、活鑒定M13噬菌體，多種噬菌體載體都含有lacZ基因，可以通過插入失活鑒定重組噬菌體。（二）噬菌體的cI基因的插入失活噬菌體載體在cI基因位點上含有單一的酶切位點，該位點上插入外源基因可以導致該基因的失活，引起表現型的變化。正常的噬菌斑是渾濁的，但重組的噬菌斑是清亮的。（三）利用Spi(sensitive to P2 inhibition)表型選擇一般來講，噬菌體不能侵染已被P2噬菌體侵染的大腸桿菌細胞，因此噬菌體被稱為Spi+（對P2前噬菌體抑制敏感），插入新的DNA后，能變成spi-，可以侵染含有P2噬菌體的細菌，只有重組子是Spi-可以形成噬菌斑，因此可以很方便的選擇出來。7/4/202

22、2 6:15 PM歡迎同學們聽課！Slide 31 （四）根據基因組的大小篩選裝配系統，只有37kb-52kb的DNA分子可以進入頭部結構，小于37kb的不能裝配。許多構建的載體切除了部分DNA，因而小于37kb，只有插入外源DNA分子后才能被裝配到頭部結構中，使載體的長度等于或大于37kb。對于這樣的噬菌體載體，只有重組的噬菌體才能進行正常的復制。7/4/2022 6:15 PM歡迎同學們聽課！Slide 32利用lacZ基因的插入失活篩選重組噬菌斑 7/4/2022 6:15 PM歡迎同學們聽課！Slide 335.3.3 重組重組DNA分子轉入真核細胞分子轉入真核細胞 重組重組DNA分子

23、導入植物細胞分子導入植物細胞植物基因工植物基因工程程( (見后面第八章見后面第八章) ) 重組重組DNA分子導入哺乳動物細胞分子導入哺乳動物細胞動物基動物基因工程因工程( (見后面第九章見后面第九章) )7/4/2022 6:15 PM歡迎同學們聽課！Slide 345.4 重組子篩選的方法重組子篩選的方法5.4.1 遺傳表型直接檢測法遺傳表型直接檢測法5.4.2 依賴重組子結構特征分析的篩選法依賴重組子結構特征分析的篩選法5.4.3 基因表達產物分析法基因表達產物分析法5.4.4 DNA序列測定序列測定法法7/4/2022 6:15 PM歡迎同學們聽課！Slide 355.4.1 遺傳表型直

24、接檢測遺傳表型直接檢測法法 根據載體的選擇標記的初步篩選根據載體的選擇標記的初步篩選 根據插入序列的表型特征篩選重組子根據插入序列的表型特征篩選重組子7/4/2022 6:15 PM歡迎同學們聽課！Slide 36 通過插入失活可以初步篩選重組子，但篩選到的克隆是否插入了正確的片段，還需要進一步的鑒定，鑒定的方法主要有如下幾種情況：1 限制性內切酶法：外源片段通過特定的酶切位點插入到載體上，因此，可以通過這些限制性酶酶切重組質粒，電泳分析插入片段長度是否正確。2 PCR法：如果已知插入DNA片段的某些序列，就可以通過PCR的方法進行鑒定3 菌落原位雜交法：將在后面的章節中提到。4 基因產物檢測

25、法：如果使用的是表達載體，那么就可以通過鑒定基因產物的方法鑒定正確的克隆。7/4/2022 6:15 PM歡迎同學們聽課！Slide 37抗藥性選擇標記插入失活抗藥性選擇標記插入失活/插入表達篩選法插入表達篩選法 pBR322有許多單一切點的限制性位點，可以用來切開分子插入新的DNA片段。如BamH I可以從四環素位點切開，使該基因不能表達，但仍能表達氨芐抗性基因，對四環素是敏感的。篩選重組pBR322 按照以下方法進行，將轉化細胞培養于氨芐培養基中，只有轉化細胞可以生長形成克隆，影印到四環素培養基上，不能在該培養基上生長的菌落可能就是目的克隆。這屬于負向選擇 7/4/2022 6:15 PM

26、歡迎同學們聽課！Slide 38根據載體的選擇標記的初步篩選根據載體的選擇標記的初步篩選 抗藥性選擇標記插入失活抗藥性選擇標記插入失活/插入表達篩選法插入表達篩選法 -半乳糖苷酶顯色反應篩選法（半乳糖苷酶顯色反應篩選法（ 互補篩選）互補篩選） 利用報告基因篩選植物轉化細胞利用報告基因篩選植物轉化細胞 利用遺傳選擇標記篩選哺乳底物轉基因細胞利用遺傳選擇標記篩選哺乳底物轉基因細胞7/4/2022 6:15 PM歡迎同學們聽課！Slide 397/4/2022 6:15 PM歡迎同學們聽課！Slide 40利用tetR的插入失活篩選重組克隆7/4/2022 6:15 PM歡迎同學們聽課！Slide

27、41抗藥性選擇標記插入表達篩選抗藥性選擇標記插入表達篩選法法 正向選擇正向選擇 重組子在培養基上能生長，而非重組子不能生長重組子在培養基上能生長，而非重組子不能生長。7/4/2022 6:15 PM歡迎同學們聽課！Slide 42 -半乳糖苷酶顯色反應篩選法（半乳糖苷酶顯色反應篩選法（ 互補篩選）互補篩選） 載體：含有載體：含有-半乳糖苷酶基因半乳糖苷酶基因lacZ的調控序列和頭的調控序列和頭146個個aa的編碼序列的編碼序列宿主：缺失了宿主：缺失了lacZ基因，可編碼基因，可編碼-半乳糖苷酶半乳糖苷酶C端端序列序列-互補：互補：lacZ基因上基因上缺失近操縱基因區段缺失近操縱基因區段的突變體

28、可以的突變體可以與與帶有完整的近操縱基因區段帶有完整的近操縱基因區段的的-半乳糖苷酶隱性突變半乳糖苷酶隱性突變體之間實現互補。體之間實現互補。在這樣的系統中，轉化質粒的細菌獲得了在這樣的系統中，轉化質粒的細菌獲得了amp抗性，抗性，自連質?？梢院铣烧５拿?，而重組質粒的細菌不能合自連質粒可以合成正常的酶，而重組質粒的細菌不能合成正常的酶。在培養基中添加酶的誘導物成正常的酶。在培養基中添加酶的誘導物IPTG，乳糖，乳糖的類似物的類似物X-gal乳糖酶作用下顯示藍色，藍斑是載體自乳糖酶作用下顯示藍色，藍斑是載體自連產物，而白色克隆是重組質粒。這一系統稱為連產物，而白色克隆是重組質粒。這一系統稱為l

29、ac selection。7/4/2022 6:15 PM歡迎同學們聽課！Slide 43 X-gal是5-溴-4-氯-3-吲哚-b-D-半乳糖（5-bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galactoside)以半乳糖苷酶（b-galactosidase)水解后生成的吲哚衍生物顯藍色。IPTG是異丙基硫代半乳糖苷（Isopropylthiogalactoside)，為非生理性的誘導物，它可以誘導lacZ的表達。 7/4/2022 6:15 PM歡迎同學們聽課！Slide 44利用lacZ基因的插入失活篩選重組子7/4/2022 6:15 PM歡迎同學們聽課！Slide 4

30、5植物轉基因載體的選擇標記植物轉基因載體的選擇標記/報告基因報告基因 新霉素磷酸轉移酶新霉素磷酸轉移酶(neomycin phosphotransferaser-II, NPTII)基因基因: 抗新霉素（抗新霉素（neomycin）或卡那霉素）或卡那霉素（kanamycin） 潮霉素磷酸轉移酶潮霉素磷酸轉移酶(hygromycin phosphotransferase, HPT)基因基因: 抗卡那霉素或潮霉素（抗卡那霉素或潮霉素（ hygromycin ） 氯霉素乙酰轉移酶氯霉素乙酰轉移酶(chloraphenicol acetyltransferase, CAT)基因基因: 抗氯霉素抗氯霉素

31、 -葡萄糖酸苷酶葡萄糖酸苷酶( -Glucuronidase, GUS)基因基因: 熒光檢測或組織化學檢測，非正向選擇熒光檢測或組織化學檢測，非正向選擇 抗除草劑抗除草劑bar基因：基因： 抗抗PPT（L-谷氨酸的類似物）谷氨酸的類似物）7/4/2022 6:15 PM歡迎同學們聽課！Slide 46動物轉基因載體的選擇標記基因動物轉基因載體的選擇標記基因 氯霉素乙酰轉移酶氯霉素乙酰轉移酶(chloraphenicol acetyltransferase, CAT)基因基因: 抗氯霉素抗氯霉素 新霉素磷酸轉移酶新霉素磷酸轉移酶(neomycin phosphotransferaser-II,

32、NPTII)基因基因: 抗新霉素（抗新霉素（neomycin）或卡那霉素）或卡那霉素（kanamycin） 胸苷激酶基因（胸苷激酶基因（ thymidine kinase, TK ） 二氫葉酸還原酶二氫葉酸還原酶(dihydrofolate reductase, DHFR)基因基因 黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖基轉移酶黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖基轉移酶 (XGPRT)7/4/2022 6:15 PM歡迎同學們聽課！Slide 475.4.2 依賴重組子結構特征分析的篩選法依賴重組子結構特征分析的篩選法5.4.2.1 菌落裂解瓊脂糖凝膠電泳快速檢測法菌落裂解瓊脂糖凝膠電泳快速檢測法5.4.2.2 限制性內切酶

33、酶切分析檢測限制性內切酶酶切分析檢測5.4.2.3 PCR法檢測法檢測5.4.2.4 核酸分子雜交檢測法核酸分子雜交檢測法7/4/2022 6:15 PM歡迎同學們聽課！Slide 485.4.2.1 瓊脂糖凝膠電泳檢測瓊脂糖凝膠電泳檢測 原理原理： 根據外源根據外源DNA片段插入的重組質粒與載體片段插入的重組質粒與載體DNA之間大小的差異來區分重組子和非重組子。之間大小的差異來區分重組子和非重組子。 特點特點： 操作簡單、快捷，成本低，適合大規模篩選。操作簡單、快捷，成本低，適合大規模篩選。特別適用于插入片段較大的重組子的篩選。特別適用于插入片段較大的重組子的篩選。7/4/2022 6:15

34、 PM歡迎同學們聽課！Slide 495.4.2.2 限制性內切酶酶切分析檢測限制性內切酶酶切分析檢測 原理原理： 小量抽提質粒小量抽提質粒DNA，利用限制性內切酶酶切，利用限制性內切酶酶切，通過電泳分析確定是否含有插入片段及其大小、通過電泳分析確定是否含有插入片段及其大小、插入方向。插入方向。 特點特點： 可以區別假陽性重組子，結果判斷較準確，可以區別假陽性重組子，結果判斷較準確，但操作比較復雜，不適用于大規模的篩選。但操作比較復雜，不適用于大規模的篩選。 7/4/2022 6:15 PM歡迎同學們聽課！Slide 505.4.2.3 PCR法檢測法檢測 原理原理： 利用載體上已知序列設計的引物進利用載體上已知序列設計的引物進行行PCR反應，通過電泳分析確定是否含反應，通過電泳分析確定是否含有插入片段及其大小。有插入片段及其大小。 特點特點： 操作簡單，便于大規模篩選，但操作簡單，便于大規模篩選，但Taq酶成本要考慮。酶成本要考慮。7/4/2022 6:15 PM歡迎同學們聽課！Slide 515.4.2.4 核酸分子雜交檢測法核酸分子雜交檢測法 菌落菌落/噬菌斑原位雜交：噬菌斑原位雜交： 直