1、 分子生物學 復習中心法則DNARNA蛋白質復制轉錄翻譯逆轉錄RNA復制Part A. 復制復制通論n1.半保留復制n2.半不連續復制n3.復制起點固定, 雙向, 等速復制. n4.復制中的信號: (1)復制 起點: 原核ori, 真核ARS (2) 復制終點 原核和真核復制的主要差異n復制起點( 原核1, 真核多);n復制次數(原核多次, 真核1次)n真核S期復制, 端粒的復制 復制的幾種特殊形式復制的幾種特殊形式n環狀DNA復制 (1) 型 -雙向, 大腸桿菌(正常); (2) 滾環型-單向,切割, X174; (3) D-環型-單向, 線粒體.n病毒中存在全保留復制方式, 逆轉錄復制方式

2、.復制中信號保真復制中信號保真 (原核為例原核為例)n1. 復制中, 復制酶35外切酶的矯正功能;n2. 復制后的二次矯正( 母鏈甲基化).DNA的轉座的轉座n轉座: 染色體上可自主復制和移動一段核酸序列.n分類(1) 復制性轉座( TnA)-拷貝(2) 非復制性轉座( IS )-整個移動 1.很小,1kb 左右,編碼轉座酶; 2.末端有倒置重復序列,其外側還有一小段正置重復序列(轉座時, 復制靶序列形成) 3.,特定IS,靶序列一樣; 不同IS,靶序列不一樣Part B. 轉錄轉錄轉 錄 通 論一一. RNA轉錄的一般過程轉錄的一般過程 1.模板識別 2.轉錄起始 3.通過啟動子 4.轉錄的

3、延伸 5.終止二二.轉錄的原料轉錄的原料: 1.RNA聚合酶; 2.雙鏈DNA模板; 3. NTPs ; 4.輔助因子三三. 轉錄的方向轉錄的方向: 5 3 (模板鏈 / 編碼鏈)四四. 轉錄中模板上的信號轉錄中模板上的信號: (保守序列保守序列) 啟動子( promotor), 終止子( terminator) 調控序列( 操縱子 operator, 增強子 enhancer )五.不對稱轉錄一.原核生物轉錄的特點 RNA聚合酶聚合酶( 2 ): 全酶全酶 = 核心酶核心酶 + 提高酶與啟動子序列的親和力(103),降低與非特異序列的親和力(104),啟動子（啟動子（promoter）nPr

4、ibnow box即即 -10 boxn-10 box與與-35 box的最佳距離為的最佳距離為17 1 bpn+1 一般為一般為A (mRNA轉錄起始點轉錄起始點)n越接近保守序列越接近保守序列, 起動子越強起動子越強.轉錄終止 (終止子)(1)不依賴于不依賴于 因子的終止因子的終止強終止子強終止子 =“ 一段反向互補序列一段反向互補序列 “ + “一段富含一段富含T的區域的區域”(2)依賴于依賴于 因子的終止因子的終止.; 弱終止子弱終止子 =“ 一段反向互補序列一段反向互補序列 “ 不依賴于不依賴于 因子的終止因子的終止依賴于依賴于 因子的終止因子的終止二.真核生物mRNA轉錄nRNA聚

5、合酶IInII類啟動子:增強子(沉默子)n無方向, 位置, 距離的限制n具有組織特異性n有時兩者可相互轉換.n不屬于啟動子, n能調節基因的轉錄.n起動子,增強子與沉默子都屬于順式作用元件.真核生物的轉錄因子n起始,延伸, 終止都需要因子的幫助.(與原核轉錄的區別)n分為: (1) 通用轉錄因子-都需要 (2) 基因特異轉錄因子-調控轉錄起始轉錄起始轉錄終止n沒有明確的終止子,但有終止信號n轉錄會在AATAAA下游0.5-2kb處終止(AATAAA下游15-30bp加PolyA)前體前體mRNA的加工的加工(時序性時序性)n(1) 5加帽 (轉錄早期進行30 nt)n(2) 3加尾 (前體mR

6、NA加polyA)n (3) 切除內含子n (4) 編輯和修飾 5 cap的特殊結構和功能的特殊結構和功能n3 m7GpppNmNm-3 (G的方向與的方向與N的方向相反的方向相反,通過通過5-5相連相連)功能功能: (1) 保護mRNA (2) 提高翻譯能力（效率） (3) 有利于mRNA在細胞內的運輸（運出細胞核） (4) 使mRNA前體的能正確剪接 (第一個內含子)npoly(A)的功能(1) 保護保護mRNA：延長其壽命（半衰期）(2) 提高提高mRNA的翻譯能力的翻譯能力：能與poly(A)結合蛋白 結合，促進翻譯，促進mRNA與核糖體結合(3) poly(A)能促進最后一個內含子的

7、剪接能促進最后一個內含子的剪接(3) RNA剪接（剪接（RNA splicing）n剪接信號(屬于內含子的邊界) 主要: GU-AG (剪切體) 次要: AU-AC 自我剪切的I, II內含子n剪接體: snRNAs (核小分子RNA)參與特殊剪接方式n選擇性剪接選擇性剪接: 一個基因轉錄出來的RNA前體，通過不同的剪接方式（選擇不同的外顯子）而形成不同的成熟mRNA，產生不同的蛋白質n反式剪接反式剪接: 參與剪接的外顯子并不在同一個基因中（即在不同的RNA分子中）RNA編輯n在特定位點: 改變,插入,刪除核苷酸.n在轉錄后進行，沿3 5方向進行;n由gRNA（guide RNA，向導RNA）

8、指導進行;n因是RNARNA, 存在 G-U 配對.Part C. 翻譯翻譯蛋白翻譯通論n一.合成過程n1. 翻譯的起始-2. 肽鏈的延伸-3. 肽鏈的終止及釋放n二. 蛋白質生物合成體系n 1、mRNA; 2、核糖體; 3、tRNA; 4、起始因子、延長因子和終止因子; 5、氨基酰-tRNA 合成酶n三.氨基酸的活化與搬運n AA-tRNAn四. 蛋白質前體的加工, 折疊n五. 蛋白的定向轉運n六. 蛋白的降解密碼子的特點密碼子的特點n遺傳密碼遺傳密碼：三聯體密碼三聯體密碼n遺傳密碼的特點：遺傳密碼的特點：n連續性連續性n有起始密碼有起始密碼(AUG, (AUG, (原核中也用原核中也用GU

9、G)GUG)和終止密碼和終止密碼(UAA,UAG,UGA)(UAA,UAG,UGA)n簡并性簡并性n擺動性擺動性n通用性通用性n偏好性偏好性 tRNA反密碼子堿基反密碼子堿基IUG mRNA密碼子堿基密碼子堿基A,C,UA,GC ,U密碼子與反密碼子配對的密碼子與反密碼子配對的擺動現象擺動現象核糖體A位A位P位P位大亞基大亞基小亞基小亞基mRNAmRNAtRNA：接合器n一種一種tRNA只能與一種氨基酸結合，一種氨基酸可與幾種只能與一種氨基酸結合，一種氨基酸可與幾種tRNA結合。結合。(tRNA數目數目20)n結合位點為：結合位點為：3端端CCA-OH。nAla-tRNAala;n起始起始tR

10、NA fmet-tRNAfmet： (原核生物）原核生物） Met-tRNAimet 起始起始tRNA (真核生物）真核生物）n met-tRNAemet;攜帶延長中的肽鏈上的蛋氨酸攜帶延長中的肽鏈上的蛋氨酸(真核生物）真核生物）tRNA的二級結構的二級結構 和三級結構和三級結構三葉草型三葉草型倒倒 L 型型氨基酰-tRNA合成酶n既能識別特定的氨基酸，又能識別轉運該氨基酸的tRNA。n氨酰tRNA合成酶的專一性很高，共有20種，每一種只用于單一種氨基酸與相應tRNA的結合 (氨基酸專一, tRNA有多個).n氨基酸+ATP+tRNA 氨基酰-tRNA +AMP +PPin氨基酰-tRNA合成

11、酶可發揮較對功能，使誤載的氨基酰-tRNA從tRNA上釋下，保證遺傳信息翻譯的準確性。n1. tRNA裝載裝載 在氨酰tRNA合成酶（aminoacyl-tRNA synthetase）的作用下，使氨基酸連接到tRNA 3端的腺苷酸上，形成氨酰tRNA (fmet-tRNA)n2. 核糖體解離核糖體解離n翻譯起始復合物首先是在核糖體小亞基上組裝起來n每一次翻譯后，核糖體的大小亞基必須解離，以讓新的翻譯起始復合物形成n核糖體解離需要起始因子（initiation factors，IF）的協助原核生物的蛋白翻譯原核生物的蛋白翻譯n3. mRNA與小亞基結合。 AUG上游上游813個堿基處存在個堿基

12、處存在SD序列能與小亞基中序列能與小亞基中16S rRNA 3端序列互補端序列互補。n4、fmet-tRNA的結合： fMet-tRNA進入小亞基的P位, 反密碼子與mRNA起始密碼子配對; n5、大亞基結合n6. 延伸延伸Step 1：進位 (注冊) (1) 一個新的氨酰tRNA結合到核糖體的A位 (2) 校對（proofreading）:如錯誤的氨酰 tRNA進入了A位 （反密碼子與密碼子不能很好配對），可進行校正. Step 2：轉肽 大亞基的23S rRNA, 肽基轉移酶, 形成肽鍵Step 3：移位nmRNA與肽基tRNA（peptidyl-tRNA）移動1個密碼子的距離，使肽基tR

13、NA進入P位，而原在P位的tRNA離開核糖體n7. 終止終止(1) 翻譯到達終止密碼子終止密碼子后，釋放因子及GTP結合到核糖體的相應位點，促使肽鏈與tRNA的連結斷開(2) 接著釋放因子和tRNA從核糖體解離(3) 最后，核糖體與mRNA解離，核糖體大小亞基解離真核生物蛋白質合成的特點n起始階段（1）在核內合成mRNA前體，加工并與多種蛋白質結合成核蛋白顆粒，轉入胞漿。起始時其二級結構需要松解，并放出多余的蛋白質。（2）Met-tRNAiMet（3） 起始復合物：40S-mRNA-Met-tRNAiMet（4）沒有SD序列。5cap 和3 ployA參與形成翻譯起始復合物.起始密碼子的尋找-

14、掃描模型模型n掃描（scanning）n找到起始密碼子后，再加上核糖體大亞基，就可開始翻譯n第一個AUG不一定是起始密碼n與在其周圍，往往有共同序列Kozak 序列CCRCCAUGG (R,嘌呤)n還與高級結構有關（1）N末端的甲酰甲硫氨酸（原核）或甲硫氨酸（真核）的切除; （2）二硫鍵的形成二硫鍵的形成（3）修飾：磷酸化、糖基化、甲基化、乙基化、羥基化等）修飾：磷酸化、糖基化、甲基化、乙基化、羥基化等（4）多聚蛋白前體的切割）多聚蛋白前體的切割, 切除新生肽鏈中非功能片段切除新生肽鏈中非功能片段, 信號肽的處理信號肽的處理.（5）蛋白質剪接：除去蛋白質內含子（）蛋白質剪接：除去蛋白質內含子（

15、intein） (6) 新生肽鏈的折疊 (7) 亞單位聚合肽鏈的翻譯后加工蛋白的定向轉運機制n1.信號肽假說n(1)分泌蛋白 翻譯-轉運同步機制n(2)細胞器(葉綠體, 線粒體等) 翻譯后轉運機制n(3)膜蛋白(ER等) 兩者兼有n(4)核定位 翻譯后轉運機制n2. 信號肽, 導肽, 核定位信號的特點蛋白質的降解n細菌: Lon蛋白酶n真核: 泛素(ubiquitin) 降解n(1) 泛素, 76氨基酸;n(2) 成熟蛋白N端第一個氨基酸嚴重影響蛋白的壽命.(精氨酸,賴氨酸最不穩定, 2-3min)n(3)需要E1, E2, E3三個降解因子參與和ATP.n(4)泛素標記后, 運送到蛋白降解體

16、系降解.Part D. 基因表達調控基因表達調控基因表達調控通論n基因表達的時間性及空間性基因表達的時間性及空間性n基因表達方式基因表達方式 （1）管家基因與奢侈基因）管家基因與奢侈基因 （2）誘導和阻遏表達）誘導和阻遏表達n基因表達的調控方式：基因表達的調控方式：多級調控，多級調控， 轉錄調控最重要轉錄調控最重要n影響基因表達的因素：影響基因表達的因素： （1）原核）原核: 營養狀況營養狀況, 環境因素環境因素; （2）真核）真核: 激素水平激素水平, 發育階段發育階段.一. 原核生物基因表達的調控n轉錄與翻譯相耦聯。n分為：（1） 轉錄水平的調控：轉錄水平的調控：操縱子操縱子 （2）翻譯水

17、平的調控）翻譯水平的調控n啟動子對轉錄的影響啟動子對轉錄的影響 （1）啟動子決定轉錄方向及模板鏈）啟動子決定轉錄方向及模板鏈 (2) 啟動子決定轉錄效率啟動子決定轉錄效率 n原核基因 轉錄水平轉錄水平 的調控操縱子 =啟動子 + 操縱基因 + 結構基因轉錄的調控機制n1.負轉錄調控 (1) 負控誘導: (2) 負控阻遏:n2.正轉錄調控 (1)正控誘導: (2)正控阻遏:A. 負控誘導:細菌中的轉錄調控系統細菌中的轉錄調控系統轉錄的調控機制 (范例)n乳糖操縱子調控的機制 (分解代謝)n色氨酸操縱子的調控機制(合成代謝)mRNA-半乳糖苷乙酰轉移酶-半乳糖苷通透酶-半乳糖苷酶翻譯轉錄無活性的阻

18、遏蛋白誘導物阻遏蛋白阻遏物蛋白亞基有誘導物時lac ALac YLac ZOPi基因CAPcAMPCAP-cAMPRNA聚合酶阻遏蛋白 阻遏物蛋白亞基無誘導物時lac ALac YLac ZOPi基因-35-100CAPcAMPORNA聚合酶結合無葡萄糖:有葡萄糖:cAMPcAMP(促進轉錄)(不促進轉錄)色氨酸操縱子(The trp Operon)ntrp操縱子阻遏型操縱子The more stable structureThe less stable structure前導肽的翻譯 (轉錄翻譯偶聯)A位A位P位P位大亞基大亞基小亞基小亞基mRNAmRNA衰減子形成的動態特征翻譯水平的調控n

19、（一）、（一）、 SD 序列對翻譯的影響序列對翻譯的影響 n（二）、核糖體合成反饋抑制（二）、核糖體合成反饋抑制 n（三）、（三）、 mRNA 的穩定性的穩定性 n（四）、反義（四）、反義 RNA(antisense) 的調控的調控 n (五) 稀有密碼子n (六) 重疊基因二.真核生物基因表達的調控nDNA水平的調控水平的調控*n轉錄水平的調控轉錄水平的調控n轉錄后水平的調控轉錄后水平的調控*n翻譯水平的調控翻譯水平的調控n翻譯后水平的調控翻譯后水平的調控*DNA水平的調控n染色質的丟失染色質的丟失n基因擴增基因擴增n基因重排基因重排nDNA甲基化甲基化 (表達降低表達降低, X染色體失活中

20、心染色體失活中心)n染色體結構染色體結構 (常染色質常染色質 和和 異染色質異染色質)轉錄水平的調控-最重要n轉錄起始轉錄起始n順式作用元件順式作用元件 和和 反式作用因子反式作用因子;n以正調控為主以正調控為主反式作用因子特點n三個功能結構域：三個功能結構域： (1) DNA識別結合域識別結合域； (2) 轉錄活性域轉錄活性域 (3) 結合其他蛋白的結合域結合其他蛋白的結合域n能識別并結合順式作用元件能識別并結合順式作用元件n正調控與負調控正調控與負調控反式作用因子結構域的模式nDNA結合域結合域n轉錄活化結構域轉錄活化結構域(1) 酸性酸性-螺旋結構域螺旋結構域(2) 富含谷氨酰胺結構富含

21、谷氨酰胺結構域域(3) 富含脯氨酸結構域富含脯氨酸結構域(1) 鋅指結構鋅指結構(2) 螺旋螺旋-轉角轉角-螺旋螺旋(HTH)(3) 亮氨酸拉鏈亮氨酸拉鏈(4) 螺旋螺旋-環環-螺旋螺旋(HLH)(5) 堿性堿性螺旋螺旋轉錄起始的調控n反式作用因子的活性調節反式作用因子的活性調節n反式作用因子與順式作用元件反式作用因子與順式作用元件, 通過成環等方式通過成環等方式調控調控n反式作用因子間存在組合式調控反式作用因子間存在組合式調控.(1) 合成后即有活性：需要時合成，可迅速降解(2) 共價修飾：磷酸化-去磷酸化，糖基化(3) 配體結合：如激素與受體的結合(4) 蛋白質與蛋白質相互作用：二聚體轉錄

22、后水平的調控nmRNA的選擇性剪接 mRNA 運輸的控制n轉錄后的基因沉默*（RNA干涉, RNAi）翻譯水平的調控n翻譯起始的調控翻譯起始的調控: (1) 激活隱蔽mRNA (2)阻遏蛋白的調控 (3)翻譯起始因子的調控 (4) 5AUG對翻譯的調控作用 (5) mRNA5 端非編碼區長度對翻譯的影響nmRNA穩定性調節穩定性調節n小分子小分子RNA對翻譯水平的影響對翻譯水平的影響翻譯后水平的調控n新生肽鏈的水解新生肽鏈的水解: 肽鏈肽鏈N端的第一個氨基酸決定蛋白的半衰期端的第一個氨基酸決定蛋白的半衰期n肽鏈中氨基酸的共價修飾肽鏈中氨基酸的共價修飾: 磷酸化磷酸化*、甲基化、酰基化、甲基化、

23、酰基化n通過信號肽分揀、運輸、定位通過信號肽分揀、運輸、定位Part E. 分子免疫學分子免疫學n1.非特異性免疫細胞 (與抗原無關) 天然殺傷細胞 ( NK細胞 )n2.特異性免疫細胞 (1) B細胞-產生抗體, 體液免疫 (2) T細胞 -細胞免疫.抗原的性質: 免疫原性 + 反應原性 = 完全抗原(僅有) 反應原性 = 半抗原 (用于檢測)(僅有) 免疫原性 = X抗原表位n1. B細胞抗原表位-抗體識別位點（）位于分子表面(親水）（）包括線形表位和非線形表位（空間構型）（）8氨基酸T細胞抗原表位-細胞免疫識別位點（）可位于分子內部（）都是線形表位（連續氨基酸序列）（）CD8+ : 91

24、 氨基酸 (與MHC I結合呈遞)CD4+: 氨基酸 (與MHC II結合呈遞)B細胞抗原表位二抗體n四肽鏈結構,兩條重鏈（H）和兩條輕鏈（L）n重鏈穩定區的分子結構: 分為五類：IgG、IgA、IgM、IgD、IgE;n輕鏈可分為兩型：、型n三個高變區與抗原表位結合n木瓜蛋白酶水解IgG 得到兩個相同的Fab段和一個Fc段。免疫球蛋白的特性與功能1.結合特性: (1) 抗原結合特性-高變區 (2) 補體 結合特性- 重鏈保守區 (3) 與NK細胞表面受體作用 *其它: 與二抗作用(重鏈保守區) Protein A, protein G (重鏈保守區)2. 生物功能: (本身僅有結合活性,發揮

25、功能需要其它分子,細胞參與) (1) 清除異源細胞- 補體參與, 破壞細胞; ADCC:抗體依賴的細胞介導的細胞毒作用 調理作用 (2) 清除異源分子-調理作用 (3) 中和作用, 封閉受體結合位點. (病毒) (4)通過胎盤, 被動免疫 (IgG)抗體的個性IgG (1) 血液中最主要的免疫球蛋白(75%) (2) IgG是唯一能通過胎盤的抗體IgM (1) 為五聚體，是分子量最大的Ig (2) IgM是個體發育過程最早能產生的抗體 (3) IgM是抗原刺激后出現最早的抗體，故檢測IgM水平可用于傳染病的早期診斷lgA 主要存在于初乳、唾液、淚液，以及呼吸道消化道和泌尿生殖道黏膜表面的分泌液中抗體多樣性的遺傳學基礎n1.基因重排 (隨機不精確): (1)輕鏈V 區重排: VL-JL (2)重鏈V區重排: VH-DH-JHn 2. VDJ基因片段的多樣性, 基因重排的多樣性 輕鏈重鏈相互隨機配對 重鏈V區的N區隨機插入VH-N-DH-N-JH 體細胞突變(B細胞V基因區突變)一種B細胞只表達一種特異抗體n等位排斥: 兩條同源染色體上的免疫球蛋白等位基因,只有一條表達.n同型排斥: 輕鏈表達,只生成一種鏈(、), 不能同時表達鏈和鏈.n多克隆抗體 多個抗原決定基機體多種抗體的混合物n單克隆抗體（monoclonal antibody）為只