1、第四章第四章 基因工程常用工具酶基因工程常用工具酶1Manipulating Genes- Transferring GenesExtract DNARestrictionLigationTransformationSelectionCulturing2重組重組DNADNA實驗中常見的主要工具酶實驗中常見的主要工具酶3 我們的基本目的是：把外源基因與載體我們的基本目的是：把外源基因與載體連接在一起形成重組連接在一起形成重組DNA分子，最少需要以分子，最少需要以下下兩類工具兩類工具酶：酶：1、準確切割、準確切割DNA分子的工具（分子的工具（“分子手術刀分子手術刀”） -限制性內切酶限制性內切酶2

2、、DNA片段的連接工具（片段的連接工具（“分子縫合針分子縫合針”） -DNA連接酶連接酶4 本章內容本章內容 第一節 限制性核酸內切酶 一、限制性核酸內切酶的發現 二、I類和III類限制和修飾酶的基本特征 三、II類限制和修飾酶的基本特征第二節 DNA連接酶第三節 其它工具酶 一、聚合酶 二、末端脫氧核苷酰轉移酶(TdT) 三、SI核酸酶 四、Bal31核酸酶 五、堿性磷酸單脂酶 5第一節第一節 限制性內切酶限制性內切酶上海自來水來自海上黃山落葉松葉落山黃識別序列回文結構67u 20世紀70年代病毒學研究中最有深遠影響的發現之一u 在對噬菌體與其寄主相互關系的研究中發現的一、限制性內切酶的發現

3、一、限制性內切酶的發現7限制性內切酶的分類（三大類）限制性內切酶的分類（三大類）I類， II類, III類.I類，III類為限制-修飾酶。兼具限制性內切活性和甲基化活性，都作為亞基的功能單位包含在同一酶分子中。II類限制性內切酶與甲基化酶是分離的，切割位點專一，適合于DNA重組。8原核細胞中限制和修飾系統原核細胞中限制和修飾系統 I類酶 II類酶 III類酶 酶分子 三亞基雙功能 內切酶與甲基化酶分離 二亞基雙 能識別位點 二分非對稱序列 4-6bp序列，回文結構 5-7bp非對稱序列切割位點 距識別位點1000bp 在識別位點中或靠識別位點 在識別位點 下游24-26bp限制性反應 互斥 分

4、開反應 同時竟爭與甲基化反應限制作用 需要ATP 需要 需要 不需要 9 二、二、I I類酶，類酶，IIIIII類酶限制類酶限制- -修飾酶基本特怔修飾酶基本特怔 1、I類酶，EcoK，EcoB。（1）異源多聚體，亞基R.M.S分別具有限制,修飾酶的作用，特 異性位點識別活性。（2）I類酶與 DNA識別位點結合依賴亞基 M與輔助因子S腺苷甲硫氨酸(SAM)相互作用。（3）S腺苷甲硫氨酸(SAM)通過變構作用使酶處于活性狀態，酶與 DNA識別位點結合后，根據甲基化狀態發揮相應酶的活性，或限制, 或限修飾，或不限制不限修飾 10112 2、IIIIII類限制修飾酶基本特怔類限制修飾酶基本特怔（1）

5、亞基R，MS亞基組成。MS亞基具有識別和甲基化修飾雙重作用.（2）修飾與限制取決于兩亞基之間的竟爭。（3）切割位點無特異性，只與識別位點的距離有關 MboII 識別 5-AAGA- 3 切割位點 5-GAAGANNNNNNNN/N-3 3-CTTCTNNNNNNN/NN-5121 1、命名原則、命名原則: :Hind 屬屬Haemophilus influenzae d菌菌株株流感嗜血桿菌流感嗜血桿菌d菌菌株的第株的第3種酶種酶 第一個字母是細菌屬名的第一個字母，要大寫； 第2、3個字母是細菌種名的前兩個字母，要小寫； 上述字母都是用斜體。 接著是細菌菌株的第一個字母，用正體字母書寫； 如果同

6、一菌株有不同的內切酶時，按發現次序分別 用羅馬數字、表示。種種菌株菌株序序三、三、 II類限制修飾酶基本特怔類限制修飾酶基本特怔13識別序列特點識別序列特點 回文結構回文結構(palindrome)(palindrome) 即反向重復結構，以即反向重復結構，以DNADNA分子中某一處為軸，其兩分子中某一處為軸，其兩側核苷酸排列呈回文對稱的序列。側核苷酸排列呈回文對稱的序列。 每種限制性內切酶都有一個它所識別、結合并切割每種限制性內切酶都有一個它所識別、結合并切割的特異序列，稱為限制性位點或切點（的特異序列，稱為限制性位點或切點（48bp48bp）。）。2 2、識別序列：、識別序列：BamH14

7、 3 3、切割方式、切割方式 A以酶切特點來分 同位酶：識別相同序列，切點不同。 同裂酶：識別位點相同，酶的來源不同。 同尾酶：識別位點不同，切出片段有相同末端序列。 B以切出片段末端性質不同可分，粘性末端和平末端。 粘性末端：（Cohesive Ends）兩個突出末端可退火互補 DNA是分子重組的基礎15同裂酶同裂酶 又稱異源同工酶。指來源不同，但具有相同的識別序列。 在切割DNA時，其切割點可以是相同的，產生平頭末端，稱為同識同切； 切割點也可以是不同的，產生3或5粘性末端，稱為同識異切。 16同裂酶同裂酶同識同識同同切切5-TTT3-AAAAAA-3TTT-5+Aha Dra 5-TTT

8、3-AAAAAA-3TTT-517同裂酶同裂酶同識同識異異切切GCCATGGTACCGGGTACCCCATGGGGTACCCCATGG+Kpn I5-G3-CCATGGTACC-3G-5+Asp718 I5-3-3-55-3-3-55-3-3-518同同 尾尾 酶酶GCCTAGGATCCGGATCCTAGGATCCTAG5-3-3-5Mbo BamH Bgl5-3-3-55-A3-TT-3A-5 同尾酶同尾酶 指來源不同，但識別與切割順序有一定的相關性的一類酶。它們作用后產生相同的粘性末端。19可變酶可變酶可變酶 識別順序中的一個或幾個堿基是可變的，并且識別順序往往超過6個堿基對。 如， Bs

9、tp，其識別順序為GGTNACC。20Bam HCCCGGGGCCTAGGATCC GGGATCCCCTAGGSam ICCCGGGGGGCCCGGGCCC平末端（平末端（Blunt end）：）：粘性末端（粘性末端（Sticky end）：）：交錯切割交錯切割切口：切口：平端切口、粘端切口平端切口、粘端切口21幾個常用限制性內切酶及其切幾個常用限制性內切酶及其切點點22 DNA分子的兩條脫氧核苷酸長鏈是反向平行的，一條鏈是53方向，另一條是35方向。在一般表示DNA分子堿基序列的圖中，上邊一條鏈是53方向，下邊一條是35方向。限制性內切酶的識別序列也是有方向性的，通常寫出的限制酶的識別序列是

10、專指53那條鏈上的堿基序列。23 如果用一種限制酶，切割兩種不同的DNA時，產生相同的末端，混合后“退火”，這兩種不同的DNA分子彼此可以連接，形成重組DNA分子。24限制性內切酶的剪切方式限制性內切酶的剪切方式25 Yu Zheng, et al. Using shotgun sequence data to find active restriction enzyme genes. Nucleic Acids Res., 2009, 37: e1. Whole genome shotgun sequence analysis has become the standard method f

11、or beginning to determine a genome sequence. The preparation of the shotgun sequence clones is, in fact, a biological experiment. It determines which segments of the genome can be cloned into Escherichia coli and which cannot. By analyzing the complete set of sequences from such an experiment, it is

12、 possible to identify genes lethal to E. coli. 26 Among this set are genes encoding restriction enzymes which, when active in E. coli, lead to cell death by cleaving the E. coli genome at the restriction enzyme recognition sites. By analyzing shotgun sequence data sets we show that this is a reliabl

13、e method to detect active restriction enzyme genes in newly sequenced genomes, thereby facilitating functional annotation. Active restriction enzyme genes have been identified, and their activity demonstrated biochemically, in the sequenced genomes of Methanocaldococcus jannaschii, Bacillus cereus A

14、TCC 10987 and Methylococcus capsulatus. 27四、酶切反應體系四、酶切反應體系 DNA或RNA.測濃度 緩沖液（Mg2+)10 雙蒸水 酶（含甘油）28部分消化和完全消化部分消化和完全消化構建載體時，若目的基因內部存在與多克隆位構建載體時，若目的基因內部存在與多克隆位點相同酶切位點時，可以考慮使用部分酶切點相同酶切位點時，可以考慮使用部分酶切29 常用限制性核酸內切酶的特性常用限制性核酸內切酶的特性微生物名稱微生物名稱酶名稱酶名稱識別順序識別順序同裂酶同裂酶同尾酶同尾酶Bacillus amyloliquefaciens H解淀粉芽孢桿菌解淀粉芽孢桿菌Ba

15、mHGGATCCBstBgl MboBacillius globigil球芽孢桿菌球芽孢桿菌Bgl ACATCTEscherichia coli RY13大腸桿菌大腸桿菌EcoRGAATTCHaemophilus influenzae流感嗜血菌流感嗜血菌Hind AAGCTTHsuProvidencia stuartii 164普羅威登細菌普羅威登細菌PstCTGCAGSalpStreptomyces albusSubspecies pathocidicus白色鏈球菌白色鏈球菌SalGTCGACAvaXho30(1)限制性內切酶能夠識別和切割單鏈DNA，例如有些酶能夠識別和切割非回文序列，但這

16、種酶在基因工程應用不夠廣泛限制性內切酶能否切割單鏈？限制性內切酶能否切割單鏈？(2)基因工程中的限制性內切酶主要主要是識別和切割雙鏈DNA，因為大多數限制內切酶是以二聚體二聚體的形式與DNA結合，酶與DNA形成穩定的化合物，產生反應，也有部分酶是以單體單體的形式與DNA結合31第二節第二節 DNADNA連接酶連接酶- “- “分子縫合針分子縫合針”DNA連接酶（DNA Ligase）： 催化兩條DNA鏈的3-OH和5-P之間形成磷酸二酯鍵而把兩個DNA分子連接在一起。例如:T4 DNA連接酶。32外源基因與載體的連接方式：外源基因與載體的連接方式：（1 1）粘性末端連接）粘性末端連接方式： 同

17、一限制性內切酶切點的連接 不同限制性內切酶切點的連接33（2 2）平端連接）平端連接適用于： 限制性內切酶作用產生的平端 粘端經特殊酶處理變為平端34（3 3）同聚物加尾連接）同聚物加尾連接 由末端轉移酶（Terminal transferase）作用，在DNA片段末端加上同聚物序列，制造出粘性末端再連接。35（4 4）人工接頭）人工接頭 平端加上帶有新的酶切位點的寡核苷酸，再用限制酶切產生粘性末端，進行連接。36第三節第三節 其它工具酶其它工具酶 修補工具酶 DNA聚合酶I 可被枯草桿菌蛋白酶或胰蛋白酶降解為2個片段，其中帶有C末端的大片段叫DNA聚合酶I 大片段（Klenow片段）。它具有

18、53聚合酶活性或3-5外切酶活性。而N端小片段只具有5-3 外切酶活性。37 KlenowKlenow大片段大片段-補平補平或標記標記限制酶切割產生的3凹端，例 5-TTCGGACTACG-3 3-AAGCCTGATGCCAT-5 T4 噬菌體DNA 聚合酶具有5-3聚合酶活性或3-5外切酶活性。其3-5外切酶活性比Klenow片段強200倍。38 末端加工酶S1核酸酶， 堿性磷酸單脂酶 末端轉移酶 催化DNA鏈的3-OH端加脫氧核糖核苷酸(dNTP)的聚合反應，使載體和待克隆基因接上互補的同聚體尾部（人工加polyA 或polyT 尾）反轉錄酶(用原核系統表達具內含子的真核基因)39去磷酸化

19、酶：載體去磷酸化防治自身環化核酸酶S1 用途：1. 除去雙鏈DNA的粘性末端以產生 平末端；2. 除去cDNA合成時形成的發夾結構；3. 分析RNA的莖環結構以及DNA- RNA分子的雜交情況等。 40 功能： 催化脫氧核糖核苷酸轉移到單鏈或雙鏈DNA分子的3-OH末端上。1. 底物是單鏈DNA或有3突出末端的 雙鏈 DNA。OH53Mg2+dNTP53(A、G、C、T)nnppi53OHMg2+dNTPnppi53(A、G、C、T)n41 2.底物是平端或3 凹端的雙鏈DNA。53Co2+dNTP53(A、G、C、T)nnppi53Co2+dNTPnppi53OHOH(A、G、C、T)n42 用途： 1. 主要作用是在載體或目的基因 3末