1、供體細胞的聚合操作青島農業大學動物生殖發育與基因工程研究所陳波 flamingcb1、在聚合前，先平衡鋪有瓊脂的30mm培養皿：在培養皿中鋪上一層薄薄的瓊脂，待瓊脂凝固后，向其中加入1ml 含10% FCS的MEM培養液，放入37、飽和濕度、5%CO2培養箱中。如此反復洗3次，每次15min以上。2、把待聚合的細胞混合均勻，轉移到0.5ml離心管中（注意用BSA培養液洗下平皿中剩余的細胞），3500rpm，離心3min，棄上清。3、加入400l BSA培養液洗滌細胞（去除消化液），3500rpm，離心3min，棄上清，盡量把上清吸干凈。4、加入BSA培養液100l重懸細胞，加入0.02g植物凝

2、集素，使其終濃度為0.2mg/ml，混勻。37、飽和濕度、5%CO2培養箱平衡10min，平衡過程中震蕩數次以利于細胞充分吸附植物凝集素。5、12000rpm，離心10s，將離心管旋轉180，12000rpm，離心30s。6、取一個200ul槍頭，用刀片傾斜著削去一部分（就像注射器針尖的切面），以便能將組織完整吸入而不損傷其結構。把離心管中的組織塊用槍吸到平衡好的30mm 培養皿中，加入適量含10% FCS的MEM培養液，在保證組織不至于懸浮在培養液中的前提下盡量多加一些這點很重要！將培養皿倒置放入37、飽和濕度、5%CO2培養箱培養。7、培養24h后的聚合卵巢會開始漸漸聚攏，形成圓餅狀；培養

3、48h后的聚合卵巢則形成圓球形，明顯高出培養液液面，邊緣形成清晰的界面，用鑷子可以反復夾起而不變形。聚合的卵巢一定要培養到供體有穩定的形狀后再移植，否則在腎包囊的壓力下供體會被壓扁而無法成團，也就無法支持卵泡發生（這是血的教訓）！8、聚合出的組織不能超過2mm3，否則營養無法輸送到組織內部，在供體與受體建立起新的血管聯系之前，供體內部會壞死！附件：植物凝集素的配制：1、試劑信息：索萊寶進口分裝：P8090-5植物血球凝集素 PPHA-P Sigma 5mg2、5mg/ml植物凝集素儲存液的配制： PHA-P 5mg 0.01M PBS（超純水配制） 1ml配制時，直接向試劑管內加1mlPBS，

4、蓋上蓋子，反復顛倒數十下后靜置數分鐘待藥品溶解，5000rpm離心10s。配好后用PCR管每管50l分裝，4保存。使用濃度：0.2mg/ml（即每100l使用4l）。聚合卵巢的腎囊移植手術操作青島農業大學動物生殖發育與基因工程研究所陳波 flamingcb1、選取8-12周大，體型適中，反應敏捷，正常發情且未合籠的健康母鼠作為受體。周齡偏小的小鼠其腎囊較脆弱，不利于植入操作。2、根據小鼠的體重，腹腔注射6mg/ml的戊巴比妥鈉麻醉劑使小鼠麻醉，麻醉劑的用量為0.85mg/10g體重（一般為410ul-430ul，不會超過500ul）。使用avertin做麻醉劑時：成年CD-1母鼠用量為520u

5、l左右；成年CD-1公鼠為1ml左右；SCID Beige鼠用量在410左右。注射手法見下圖：麻醉后有必要對麻醉效果進行評價：l 如果給小鼠剪毛和剪開皮膚時不會劇烈反抗（輕微放抗是正常的），眼睛、腳掌和尾巴血色充盈，則視為麻醉效果較好；l 如果麻醉效果不好，可視具體情況追加麻醉劑，補加麻醉劑最好在剪開腹膜之前進行；l 如果麻醉過度，則小鼠毫不反抗，并且全身血色漸漸退去，眼睛、腳掌和尾巴漸漸發暗，則視為麻醉過度，應放棄該受體，重新麻醉；l 如果麻醉后或手術過程中，小鼠呼吸困難（此時會做幾次連續深度呼吸）、呼吸停止或排尿，則受體即將死亡。3、用酒精濕潤小鼠背側皮膚，以術剪減去小鼠背側毛，范圍為距切

6、口周圍1cm為宜。4、在小鼠背側中線與卵巢大概所處位置的水平線的交點處，沿脊柱由下至上縱向剪開一個1.5cm左右長的切口（不要太大，切口上緣可用于輔助固定牽出后的腎臟），直至小鼠脊柱背側隆起，如下圖綠線所示：5、用鑷子撕開皮膚與腹膜之間的粘連，注意此時小鼠反應較為強烈，屬正常表現。6、觀察受體腹膜上血管的走向，選定向哪一側的腎臟植入卵巢：不植入卵巢的一側在卵巢正上方的腹膜上剪開一個0.5cm左右的切口用于卵巢摘除；植入卵巢的一側在腎臟正上方的腹膜上以剪刀剪開一個1cm左右的切口此切口的位置和大小很重要：切口下端在腎臟下端，上端到小鼠最后一肋的內側。如果切口大小合適，腎臟遷出后不會縮回體腔。注意

7、避開受體腹膜上的血管，切口的走向和位置都要根據受體的血管走向靈活調整，剪開任何一個0.3mm粗的動脈都可能導致受體大出血！理想的切口如下圖藍線所示：6、摘除受體兩側的卵巢：用鑷子遷出卵巢，并用止血鉗夾住卵巢的脂肪墊固定。以縫合線在輸卵管處將入巢動脈和輸卵管一起結扎，并用鑷子摘除卵巢。若結扎不成功，受體將在卵巢摘除后大出血。7、在體視鏡下將聚合卵巢植入受體腎包囊下：用5號鐘表鑷子在腎包囊上開一小口，開口不能太大，應該跟供體大小一樣即可，由于腎包囊有彈性，可以比移植管口小一點。用青霉素-生理鹽水濕潤腎包囊這點很重要，腎包囊表面水分蒸發后會變得很硬，移植管無法伸入，供體難以移入切口深部！以移植管吸取

8、待移植的聚合卵巢并植入到受體腎囊下，注意供體應盡量遠離腎囊的開口以免其滑出。植入后，可以使用圓端彎折的粉刺針輔助調整供體的位置。建議在腎臟的上端開口，能有效防止移植物在隨后的操作中滑出。開口時左手使用鈍化的5號鐘表鑷子夾持腎囊，右手使用尖銳的5號鐘表鑷子刺穿腎囊并開口。8、將受體腎臟放回體腔中，注意避免供體在此時被受體腹膜擠壓而滑出！向體腔中注入青霉素-生理鹽水，依次縫合腹膜和皮膚上的切口，在傷口上涂抹碘酒。9、將做完手術的小鼠放回籠中，注意保暖并置于日光燈下待其蘇醒。氣溫較低時，用小太陽供暖。氣溫干燥時注意使用生理鹽水潤濕小鼠眼睛手術過程中小鼠的眼睛是一直睜開的。附件：1、 手術所需的儀器設

9、備：超凈工作臺；4倍放大的體視鏡；無影燈。使用前開紫外照射滅菌30min。2、 手術所需的器械：一對尖端完整的5號鐘表鑷子（用于撕開腎包囊及操作供體）；一把尖端鈍化的5號鐘表鑷子（用于夾持腎包囊，可由廢棄的5號鐘表鑷子改造）；兩把止血鉗（分別用于夾持卵巢脂肪墊和縫合持針）；三把小手術剪（分別用于剪毛，皮膚和腹膜）；三把細尖鑷子（分別用于剪皮膚和腹腔內操作）；4號或更細的縫合線一卷；彎針數枚；一把圓端彎折過的粉刺針（用于植入后調整供體在腎包囊下的位置）。所有器械使用前必需濕熱滅菌并烘干。手術前開紫外燈照射30min。用畢后用酒精棉球擦干凈放回器械盒中。3、 移植管的制作：移植管用于吸入供體，并將

10、供體植入受體腎包囊下。其優點：可以避免用鑷子夾持轉移供體，還可以直接深入切口深部，避免用鑷子將供體擠壓到深部，因而可以保證供體完整植入而不變形；對于比較小的供體，一次可植入數個，提高移植效率。移植管是將一根拉制成特定形狀的玻璃毛細管和注射器用封口膜連接制成。使用時將移植管接在膠皮管一端，另一端接一個帶棉塞的1ml槍頭放在口中操作。用畢后用青霉素-生理鹽水反復洗滌后再用75%酒精洗滌。4、 參考文獻：安德拉斯.納吉等著，孫青原等譯小鼠胚胎操作實驗手冊(第三版)化學工業出版社：此書中詳述了小鼠的IP注射，小鼠手術的基本操作，口吸管的制作及腎囊移植的參考步驟等寶貴信息，施術前請仔細參讀。腎包囊移植教

11、學網址：/tools/mousework/Cunha001/Pages/Written_Method.html 該網址圖解了手術過程，施術前請仔細參讀。另附本文作者基于此技術發表的文章一篇，歡迎大家引用，謝謝：Recovery of functional oocytes from cultured premeiotic germ cells after kidney capsule transplantation. Stem Cells Dev. 2013 Feb 15;22(4):567-80. 鏈接：Avertin儲存液濃度 1.2%工作液濃度 0.2 ml/10g或240 mg/kg儲存液、工作液均4避光保存，使用前現配。儲存液：三溴乙醇Sigma-Aldrich, #T4,840-2 25克 1g 0.80645161g叔戊醇國產分析純 15.5ml 0.62ml 0