1、 第四講第四講 酶化學酶化學 一、概述一、概述酶的定義酶的定義: :細胞產生的生物催化劑細胞產生的生物催化劑, ,主要是蛋白質主要是蛋白質, ,少量少量為核酸。為核酸。已經發現已經發現40004000多種酶，獲得數百種酶被結晶多種酶，獲得數百種酶被結晶并應用于科學研究或醫學檢驗等中，數十種并應用于科學研究或醫學檢驗等中，數十種酶被應用于生產實踐；而且，每年都有新酶酶被應用于生產實踐；而且，每年都有新酶被發現。被發現。作為生物催化劑，酶催化化學反應有以下特點作為生物催化劑，酶催化化學反應有以下特點: : 1.1.催化效率高催化效率高反應速率高達反應速率高達10108 810102020，比非生物

2、催化劑高，比非生物催化劑高10107 710101313。例如例如, ,過氧化氫分解成氧和水過氧化氫分解成氧和水以鐵為催化劑，反應速率為以鐵為催化劑，反應速率為6 61010-4-4；用過氧化氫酶；用過氧化氫酶催化，速率為催化，速率為6 610106 6。n高度專一性高度專一性n即一種酶只作用于一種底物或一類底物即一種酶只作用于一種底物或一類底物n絕對專一性絕對專一性n只作用于一種底物只作用于一種底物相對專一性相對專一性 作用于一種以上的底物。作用于一種以上的底物。基團專一性基團專一性主要選擇化學鍵兩端的基團主要選擇化學鍵兩端的基團, ,而對化學鍵不甚敏感而對化學鍵不甚敏感; ;如如-D-D-

3、葡萄糖苷酶，要求葡萄糖苷酶，要求-葡萄糖苷鍵的一端必須是葡萄糖苷鍵的一端必須是葡萄糖；葡萄糖；鍵專一性鍵專一性嚴格要求作用的化學鍵，對其兩端的基團無要求嚴格要求作用的化學鍵，對其兩端的基團無要求; ;如脂肪酶只要求酯鍵。如脂肪酶只要求酯鍵。立體異構專一性立體異構專一性對有立體異構體的底物對有立體異構體的底物( (手性碳原子導致手性碳原子導致) )，酶只作，酶只作用于其中的一個異構體。用于其中的一個異構體。例如，例如，L-L-氨基酸氧化酶只對氨基酸氧化酶只對L-L-氨基酸氧化脫氨，對氨基酸氧化脫氨，對D-D-氨基酸則無作用；氨基酸則無作用；L-L-延胡索酸酶只催化延胡索酸酶只催化L-L-延胡索酸

4、加水生成蘋果酸。延胡索酸加水生成蘋果酸。n作用條件溫和作用條件溫和n一般在常溫下進行一般在常溫下進行, ,n例如水解淀粉：若用酸水解例如水解淀粉：若用酸水解, ,需要需要245245294kPa294kPa壓壓力和力和140140150150的高溫及耐酸設備的高溫及耐酸設備; ;n而用淀粉酶水解而用淀粉酶水解, ,則僅需在則僅需在65,65,一般設備即可。一般設備即可。受到嚴格控制受到嚴格控制多種因素影響到酶催化的反應活性多種因素影響到酶催化的反應活性例如堿性蛋白酶，在例如堿性蛋白酶，在pH8.5pH8.5活性最大，活性最大，pH8pH8時活時活力即下降為力即下降為75%75%左右；左右； p

5、H6.5pH6.5時已經沒有活力。時已經沒有活力。來源廣泛來源廣泛例如蛋白酶，有植物、動物、微生物等來源例如蛋白酶，有植物、動物、微生物等來源二、酶的命名二、酶的命名n包括習慣命名及系統命名包括習慣命名及系統命名n習慣命名習慣命名n根據酶作用的底物、或酶的來源等來命名根據酶作用的底物、或酶的來源等來命名n例如淀粉酶或霉菌淀粉酶或高溫淀粉酶或堿性蛋例如淀粉酶或霉菌淀粉酶或高溫淀粉酶或堿性蛋白酶白酶n習慣命名簡單、易懂、應用歷史長，但缺乏系統習慣命名簡單、易懂、應用歷史長，但缺乏系統性，不容易區別。性，不容易區別。系統命名系統命名由于不斷發現新酶，習慣命名已經不能適應酶學發展由于不斷發現新酶，習慣

6、命名已經不能適應酶學發展的需要。的需要。19611961年，國際生物化學聯合會酶學委員會年，國際生物化學聯合會酶學委員會（Enzyme CommissionEnzyme Commission，E.C.E.C.）建議對現有的酶進行系）建議對現有的酶進行系統命名，即：統命名，即：每種酶都給出一個系統名稱和習慣名稱，每種酶都給出一個系統名稱和習慣名稱，用文字表示系統名稱，要包括：用文字表示系統名稱，要包括：酶的底物；酶的底物；底底物之間用物之間用隔開；隔開；催化反應的性質。催化反應的性質。此外，還應寫出此外，還應寫出底物的構型。底物的構型。如谷丙轉氨酶，其系統名稱為如谷丙轉氨酶，其系統名稱為L-L-

7、丙氨酸丙氨酸-酮戊二酸酮戊二酸氨基轉移酶。氨基轉移酶。如果酶的一個底物是水，則可以省略，如葡萄糖如果酶的一個底物是水，則可以省略，如葡萄糖-內酯水解酶。內酯水解酶。國際系統命名（學名）國際系統命名（學名）根據酶的國際系統分類法根據酶的國際系統分類法, ,將所有已知的酶按照其催化將所有已知的酶按照其催化的反應類型，分成六大類，分別用的反應類型，分成六大類，分別用1 1、2 2、3 3、4 4、5 5、6 6的的編號表示。編號表示。根據底物分子中被作用的基團或鍵的性質，將每一大根據底物分子中被作用的基團或鍵的性質，將每一大類分若干亞類；每一亞類又分成若干亞亞類；類分若干亞類；每一亞類又分成若干亞亞

8、類；此外，每個酶還賦予一個發現編號。此外，每個酶還賦予一個發現編號。系統命名的酶由系統名（學名）和一個編號組成，這系統命名的酶由系統名（學名）和一個編號組成，這樣一個酶由樣一個酶由4 4個數字的組合表征。個數字的組合表征。例如例如E.C.1.1.1.27 E.C.1.1.1.27 ；習慣名；習慣名: :乳酸脫氫酶乳酸脫氫酶; ;E.C.E.C.國際生物化學聯合會酶學委員會國際生物化學聯合會酶學委員會第一個第一個1 1表示該酶為氧化還原酶類表示該酶為氧化還原酶類; ;第二個第二個1 1表示該酶為氧化還原酶類中的第一亞表示該酶為氧化還原酶類中的第一亞類類, ,催化醇氧化催化醇氧化; ;第三個第三個

9、1 1表示該酶屬于氧化還原酶類第一亞類表示該酶屬于氧化還原酶類第一亞類中的第一亞亞類，催化醇脫氫中的第一亞亞類，催化醇脫氫; ;第四個數字表第四個數字表示該酶的編號。示該酶的編號。酶催化的反應酶催化的反應氧化還原酶類（氧化還原酶類（E.C.1）n該類酶催化下列反應該類酶催化下列反應n不僅包括脫氫酶、氧化酶，還包括過氧化物酶、加氫酶等不僅包括脫氫酶、氧化酶，還包括過氧化物酶、加氫酶等A2H+BA+B2HA2H+A+O2H2O22H+2A+O2H2O2A轉移酶類轉移酶類E.C.2E.C.2A+BABCC+水解酶類水解酶類E.C.3E.C.3AH2O+BAOH+BH裂合酶類裂合酶類 催化底物的裂解或

10、逆反應。底物裂解時，一分為二，催化底物的裂解或逆反應。底物裂解時，一分為二，產物中往往留下雙鍵。在逆反應中，催化某一基團加產物中往往留下雙鍵。在逆反應中，催化某一基團加到這個雙鍵上。到這個雙鍵上。 ABA+B異構酶類異構酶類E.C.5E.C.5n催化各種同分異構體的相互轉變催化各種同分異構體的相互轉變AB合成酶類合成酶類 催化由兩種或兩種以上的底物合成一種物質的反應，且催化由兩種或兩種以上的底物合成一種物質的反應，且必須有必須有ATPATP參加。參加。AB+ ATPAB+ADP+Pi如丙酮酸羧化酶催化丙酮酸羧化成草酰乙酸如丙酮酸羧化酶催化丙酮酸羧化成草酰乙酸COOHCCH3COOHCH2COO

11、HCO+丙酮酸羧化酶作用機理O+CO2ATPADP+H3PO4三、酶的輔助因子三、酶的輔助因子僅由蛋白質組成的酶，稱為簡單酶；由蛋白質及非蛋僅由蛋白質組成的酶，稱為簡單酶；由蛋白質及非蛋白小分子組成的酶，稱結合酶；白小分子組成的酶，稱結合酶；結合酶中的蛋白部分稱酶蛋白，結合酶中的蛋白部分稱酶蛋白，非蛋白小分子稱輔助非蛋白小分子稱輔助因子因子，它又分為輔酶或和輔基。，它又分為輔酶或和輔基。與酶蛋白松散結合，可用透析法除去的小分子叫輔酶與酶蛋白松散結合，可用透析法除去的小分子叫輔酶，如丙酮酸脫氫酶中的如丙酮酸脫氫酶中的NADNAD+ +。與酶蛋白緊密結合（共價、離子鍵等），不能用透析與酶蛋白緊密結

12、合（共價、離子鍵等），不能用透析法除去的小分子物質叫輔基法除去的小分子物質叫輔基，如羧肽酶中的鋅。，如羧肽酶中的鋅。酶蛋白、輔助因子單獨存在時均無活性，將兩者混酶蛋白、輔助因子單獨存在時均無活性，將兩者混合，則產生有催化活力的全酶。合，則產生有催化活力的全酶。催化反應時，由酶蛋白確定反應的專一性；輔助因催化反應時，由酶蛋白確定反應的專一性；輔助因子則參與穩定酶蛋白構象、或誘導底物分子正確定子則參與穩定酶蛋白構象、或誘導底物分子正確定向、轉移電子、原子、功能基團等。向、轉移電子、原子、功能基團等。n四、酶的活性部位（活性中心）四、酶的活性部位（活性中心）酶催化反應時，僅有其分子上的少數氨基酸殘酶

13、催化反應時，僅有其分子上的少數氨基酸殘基直接參與基直接參與直接參與催化反應的氨基酸殘基稱直接參與催化反應的氨基酸殘基稱酶的活性部酶的活性部位（或活性中心）位（或活性中心）活性部位（活性中心）活性部位（活性中心）有兩個功能區域：一個有兩個功能區域：一個是結合部位，專司與底物結合；是結合部位，專司與底物結合；另一個是催化部位，專司催化作用；另一個是催化部位，專司催化作用；這兩個中心往往這兩個中心往往并不孤立存在或獨立發揮并不孤立存在或獨立發揮作用作用，有時結合中心的基團也兼催化中心，有時結合中心的基團也兼催化中心的功能。的功能。酶結合專一性底物的化學鍵主要就是前面酶結合專一性底物的化學鍵主要就是前

14、面講過的離子鍵、氫鍵、配位鍵及疏水相互講過的離子鍵、氫鍵、配位鍵及疏水相互作用等，作用等，而非共價鍵。而非共價鍵。n結合部位結合部位 n酶分子中與底物結酶分子中與底物結合的部位或區域。合的部位或區域。n酶分子中促使底物發生化學變化的部位酶分子中促使底物發生化學變化的部位。n通常將酶的結合部位和催化部位總稱為酶的活性通常將酶的結合部位和催化部位總稱為酶的活性部位或活性中心。部位或活性中心。n結合部位決定酶的專一性結合部位決定酶的專一性n催化部位決定酶所催化反應的性質。催化部位決定酶所催化反應的性質。催化部位催化部位n調控部位調控部位n酶分子中還存在與調節劑結合的部位，結合后引起酶分酶分子中還存在

15、與調節劑結合的部位，結合后引起酶分子空間構象的變化，對酶起激活或抑制作用。子空間構象的變化，對酶起激活或抑制作用。酶的必需基團酶的必需基團必需基團是指使酶表現催化活性所必需的部必需基團是指使酶表現催化活性所必需的部分。分。包括活性部位以及參與維持酶空間構象包括活性部位以及參與維持酶空間構象的氨基酸殘基或基團的氨基酸殘基或基團。n酶活性部位的必需基團主要包括：酶活性部位的必需基團主要包括：n親核基團：例如絲氨酸的羥基，半胱氨酸的巰親核基團：例如絲氨酸的羥基，半胱氨酸的巰基和組氨酸的咪唑基。基和組氨酸的咪唑基。n酸堿基團：天門冬氨酸和谷氨酸的羧基，賴氨酸堿基團：天門冬氨酸和谷氨酸的羧基，賴氨酸的氨

16、基，酪氨酸的酚羥基，組氨酸的咪唑基酸的氨基，酪氨酸的酚羥基，組氨酸的咪唑基等。等。H2NCHCCH2OHOOHOHH2NCHCCH2OHOSHSHH2NCHCCH2OHONNHNNHH2NCHCCH2OHOCH2COHOH2NCHCCH2OHOCOHOCOOHH2NCHCCH2OHOCH2CH2CH2NH2NH2H2NCHCCH2OHOOHOH溶菌酶活性中心圖溶菌酶活性中心圖lX-X-衍射分析發現；胰蛋白酶、胰彈性酶和衍射分析發現；胰蛋白酶、胰彈性酶和胰凝乳蛋白酶的作用機理相似。因為這三胰凝乳蛋白酶的作用機理相似。因為這三個酶的氨基酸順序有個酶的氨基酸順序有40%40%是相同的，特別是是相同的

17、，特別是活性部位中活性部位中Ser195Ser195周圍的氨基酸順序，周圍的氨基酸順序，Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-ProGly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro。三個酶都具有三個酶都具有SerSerHisHisAspAsp催化三組合結構，催化三組合結構，因此有相似的催化機理。因此有相似的催化機理。三個酶剛分泌時均無活性，須經過單一肽鏈的斷三個酶剛分泌時均無活性，須經過單一肽鏈的斷裂而被激活。裂而被激活。他們的差異在于其與底物結合專一性的差異；即他們的差異在于其與底物結合專一性的差異；即結合底物的口袋上的差異。結合底物的口袋上的差異。胰蛋白酶胰蛋白酶羧基端為羧基端為LysLy

18、s，ArgArg的肽鍵的肽鍵凝乳蛋白酶凝乳蛋白酶羧基端為羧基端為PhePhe，TyrTyr，TrpTrp及有大及有大的疏水側鏈的氨基酸如蛋氨酸的疏水側鏈的氨基酸如蛋氨酸彈性蛋白酶彈性蛋白酶羧基端為羧基端為AlaAla。五、酶的作用機制五、酶的作用機制酶催化與活化能酶催化與活化能n催化過氧化氫分解催化過氧化氫分解n加熱使過氧化氫分解，活化能為加熱使過氧化氫分解，活化能為7534875348焦耳焦耳/ /摩爾摩爾n以膠態鈀為催化劑，活化能降低至以膠態鈀為催化劑，活化能降低至4897648976焦耳焦耳/ /摩爾；摩爾；n過氧化氫酶催化，活化能降低至過氧化氫酶催化，活化能降低至83728372焦耳焦

19、耳/ /摩爾。摩爾。n過氧化氫酶的作用，使活化能降低至無催化劑時的過氧化氫酶的作用，使活化能降低至無催化劑時的11%11%，其反應速度增加其反應速度增加1 1億倍以上。億倍以上。中間產物學說中間產物學說n當酶與底物相遇時，首先形成不穩定的酶當酶與底物相遇時，首先形成不穩定的酶底物復合物，底物復合物，底物分子處于活化狀態，即反應活化能降低；然后復合物底物分子處于活化狀態，即反應活化能降低；然后復合物分解，生成產物；酶脫落，再與底物結合。分解，生成產物；酶脫落，再與底物結合。nE + S = ES P + EE + S = ES P + En光譜法已經找到一些中間產物的證據。光譜法已經找到一些中間

20、產物的證據。n如過氧化物酶如過氧化物酶H2O2復合物；過氧化物酶為鐵卟啉蛋白，復合物；過氧化物酶為鐵卟啉蛋白，有特征吸收光譜。有特征吸收光譜。n加加H2O2前前4 4個吸收峰（個吸收峰（645645、 583583、 548548、 498498）n加入加入H2O2后，吸收光譜發生明顯改變，變為兩個吸收峰后，吸收光譜發生明顯改變，變為兩個吸收峰（561561、 530.5530.5）n再加入供氫體抗壞血酸等，體系光譜又發生變化，重新出再加入供氫體抗壞血酸等，體系光譜又發生變化，重新出現在現在645645、 583583、 548548、 498498的吸收峰。的吸收峰。H2O2+抗壞血酸-2H

21、過氧化物酶脫氫抗壞血酸2H2O+n誘導契合學說誘導契合學說n19581958年，由年，由KoshlandKoshland提出，要點是：提出，要點是：n酶活性中心的結構有柔性，與底物結合時，受到底酶活性中心的結構有柔性，與底物結合時，受到底物的誘導，酶構象相應發生改變，從而引起活性部物的誘導，酶構象相應發生改變，從而引起活性部位有關基團空間位置的變化，以便與底物的敏感鍵位有關基團空間位置的變化，以便與底物的敏感鍵正確的契合，形成酶正確的契合，形成酶- -底物中間復合物。底物中間復合物。n近年來用近年來用X-X-射線，核磁共振，差示光譜等手段證明射線，核磁共振，差示光譜等手段證明了這種中間產物的存

22、在。了這種中間產物的存在。n如醇脫氫酶（如醇脫氫酶（ADHADH）的底物）的底物NADHNADH在游離狀態下，在游離狀態下，在在340nm340nm有一吸收峰，加入酶后吸收峰移至有一吸收峰，加入酶后吸收峰移至328nm328nm，再加入巰基試劑對氯汞苯甲酸，又使，再加入巰基試劑對氯汞苯甲酸，又使吸收峰回到吸收峰回到340nm340nm。n電子顯微鏡下也觀察到羧肽酶電子顯微鏡下也觀察到羧肽酶A A的某些殘基和的某些殘基和底物甘氨酰底物甘氨酰酪氨酸結合；以及溶菌酶的最小酪氨酸結合；以及溶菌酶的最小六糖底物躺在酶分子表面狹長凹穴中的證據。六糖底物躺在酶分子表面狹長凹穴中的證據。4、過渡態互補學說、過

23、渡態互補學說n過渡態理論認為：酶與底物的過渡態互補，過渡態理論認為：酶與底物的過渡態互補，親和力最強，釋放出的結合能使親和力最強，釋放出的結合能使ESES復合物的復合物的反應能級降低，有利于底物分子跨越能壘，反應能級降低，有利于底物分子跨越能壘，加速酶促反應，實際上這是誘導契合學說的加速酶促反應，實際上這是誘導契合學說的不同版本。不同版本。例如，咪唑和對例如，咪唑和對- -硝基苯乙酸酯的反應是一個雙分子反應。硝基苯乙酸酯的反應是一個雙分子反應。CH3COONO2NNH.NNHCOCH3+O-NO2+實驗結果指出，分子內咪唑基參與的酯解反應速度實驗結果指出，分子內咪唑基參與的酯解反應速度比相應的

24、分子間反應速度大比相應的分子間反應速度大 24 24 倍。說明咪唑基與倍。說明咪唑基與酯基的相對位置對水解反應速度具有很大的影響。酯基的相對位置對水解反應速度具有很大的影響。NNHCOONO2.ONNH+O-NO2+5、抗體酶、抗體酶n指同時具有抗體及催化功能的蛋白質指同時具有抗體及催化功能的蛋白質n制備方法是：制備方法是：n半抗原（底物類似物）半抗原（底物類似物）+ +蛋白質蛋白質 結合抗結合抗原原 動物免疫動物免疫 單克隆抗體單克隆抗體 O2NOOO+NCO2N-OOOCO2N-OOO+NOH-+PO底物過渡態過渡態類似物酯酶的底物、過渡態及過渡態類似物的結構酶催化機制酶催化機制n酶與底物

25、的鄰近定向酶與底物的鄰近定向n酶催化底物反應，首先要兩者相互接近并形成過酶催化底物反應，首先要兩者相互接近并形成過渡態中間復合物。渡態中間復合物。n生理條件下，細胞中底物濃度多在生理條件下，細胞中底物濃度多在0.001mol/L0.001mol/L左左右。但是，在酶活性部位測到的底物濃度則可達右。但是，在酶活性部位測到的底物濃度則可達到到100mol/L100mol/L。n在活性中心，往往有少量水，當底物到達此部位，在活性中心，往往有少量水，當底物到達此部位，即達到高濃度。即達到高濃度。n試驗表明，酶與底物形成專一復合物時，酶分子試驗表明，酶與底物形成專一復合物時，酶分子與底物分子的構象均改變

26、，使酶分子的結合基團與底物分子的構象均改變，使酶分子的結合基團及催化基團分別與底物敏感鍵正確排列與定位，及催化基團分別與底物敏感鍵正確排列與定位，這就是這就是鄰近定向鄰近定向。n例如碳酸酐酶：例如碳酸酐酶：nCOCO2 2 + H + H2 2O HCOO HCO3 3- - + H + H+ + n該酶由該酶由260260個氨基酸殘基組成，為單肽鏈酶，活性部位個氨基酸殘基組成，為單肽鏈酶，活性部位含含ZnZn2+2+，ZnZn2+2+與活性中心的三個組氨酸殘基與活性中心的三個組氨酸殘基(94(94、9696、119)119)側鏈的氮原子配位，第四個配位體是水或羥基。側鏈的氮原子配位，第四個配

27、位體是水或羥基。H H2 2O + COO + CO2 2 HCO HCO3 3- - + H + H+ +H isH isH isOOHCOH isH isH isOOHCOZ n2 +Z n2 +張力和形變張力和形變nX-X-衍射分析證明：酶和底物結合時，底物分子向酶衍射分析證明：酶和底物結合時，底物分子向酶的活性部位靠近，誘導酶的構象發生變化，特別是的活性部位靠近，誘導酶的構象發生變化，特別是活性部位的變化并與之結合；同時，酶也誘導底物活性部位的變化并與之結合；同時，酶也誘導底物分子的敏感鍵變形，由基態變成易變化的過渡態，分子的敏感鍵變形，由基態變成易變化的過渡態，從而加速反應進行。從而

28、加速反應進行。n例如羧肽酶例如羧肽酶A An專一從羧基端水解肽鏈，若羧基端為芳香族氨基專一從羧基端水解肽鏈，若羧基端為芳香族氨基酸或有大的非極性側鏈的氨基酸時最快。酸或有大的非極性側鏈的氨基酸時最快。羧肽酶羧肽酶A A是如何識別多肽底物的羧基端的氨基酸？底物是是如何識別多肽底物的羧基端的氨基酸？底物是苯甲酰甘氨酰酪氨酸。酶與底物結合時；苯甲酰甘氨酰酪氨酸。酶與底物結合時；nTyrTyr248248酚羥基酚羥基移動移動1.2nm1.2nm，與底物末端羧基形成氫鍵，與底物末端羧基形成氫鍵nArgArg145145移動移動0.2nm0.2nm使其胍基與底物末端羧基形成形成鹽鍵使其胍基與底物末端羧基形

29、成形成鹽鍵nAsnAsn144144的側鏈酰胺基也與末端羧基形成氫鍵的側鏈酰胺基也與末端羧基形成氫鍵 結果使底物結果使底物C-C-端的疏水殘基端的疏水殘基進入酶的疏水口袋進入酶的疏水口袋內內n底物末端肽鍵上的羰基與底物末端肽鍵上的羰基與ArgArg127127側鏈的正電荷側鏈的正電荷形成鹽鍵形成鹽鍵n與鋅離子配位的與鋅離子配位的水分子水分子與鄰近的與鄰近的GluGlu270270形成氫鍵結合而形成氫鍵結合而被激活。被激活。酸堿催化酸堿催化n酸堿催化是有機反應中最普遍，最有效的催酸堿催化是有機反應中最普遍，最有效的催化方式。化方式。n在酶催化的反應中，以廣義酸或堿催化反應，在酶催化的反應中，以廣

30、義酸或堿催化反應，即酶分子的氨基酸殘基在特定條件下，通過即酶分子的氨基酸殘基在特定條件下，通過給出質子或接受質子，催化化學反應。給出質子或接受質子，催化化學反應。廣義酸基團廣義酸基團 廣義堿基團廣義堿基團（質子供體）（質子供體） （質子受體）（質子受體）His His 是酶分子中最活潑的酸堿催化氨基酸殘基，其咪唑基在生是酶分子中最活潑的酸堿催化氨基酸殘基，其咪唑基在生理條件下，既可給出質子，又可獲得質子。理條件下，既可給出質子，又可獲得質子。-COOH, -NH3, -SH,+OHNHNH+-COO , -NH2, -S , -.-O-NHN:n例如，胰凝乳蛋白酶的活性部位由例如，胰凝乳蛋白酶

31、的活性部位由SerSer195195，HisHis5757，AspAsp102102三個氨基酸殘基組成，三個氨基酸殘基組成，X-X-衍射分析表明，衍射分析表明，SerSer195195和和HisHis5757鄰近，鄰近，AspAsp102102在蛋白質分子內部，也在蛋白質分子內部，也靠近靠近HisHis5757，這三個氨基酸殘基構成了催化組合。，這三個氨基酸殘基構成了催化組合。n沒有底物時，沒有底物時，HisHis5757是非離子化的。是非離子化的。親核攻擊親核攻擊（5 5）金屬離子的催化作用）金屬離子的催化作用六、酶促反應速度及其影響因素酶促反應速度及其影響因素酶促反應速度的測量酶促反應速度

32、的測量單位時間內測定底物的減少量或產物的增加量。單位時間內測定底物的減少量或產物的增加量。反應進程曲線反應進程曲線: :以產物的生成量對反應時間作圖。以產物的生成量對反應時間作圖。一般是測定其初速度。一般是測定其初速度。酶濃度的影響酶濃度的影響n在酶的最適條件下，若底物濃度足夠大，足以使酶在酶的最適條件下，若底物濃度足夠大，足以使酶得以飽和，此時，反應速度與酶濃度成正比，即；得以飽和，此時，反應速度與酶濃度成正比，即；Ev酶濃度的影響圖酶濃度的影響圖底物濃度的影響底物濃度的影響底物濃度的影響是指在酶濃度、底物濃度的影響是指在酶濃度、pHpH、溫度等、溫度等都不變的條件下進行都不變的條件下進行v

33、S一級反應混合級反應Vmax零級反應米氏方程米氏方程nMichaelisMichaelis和和 MentenMenten根據中間產物學說推導了表示底物濃根據中間產物學說推導了表示底物濃度和反應速度關系的公式，稱米氏方程。度和反應速度關系的公式，稱米氏方程。E + S ES E + Pk3k2k1v= vmaxSKm+SK1ES=k2ES+k3ESkm=ESES=Et-ESSESv= k3ES v=EtSES=Km+Sk3EtSKm+S = vmaxSKm+S米氏方程的意義和測定米氏方程的意義和測定n由米氏方程可知，當反應速度達到最大反應速度一半時，即由米氏方程可知，當反應速度達到最大反應速度一

34、半時，即v=1/2Vv=1/2Vmaxmax時時nK Km m= =S Sn米氏常數的數學涵義是反應速度為最大反應速度一半時的底物濃度。一米氏常數的數學涵義是反應速度為最大反應速度一半時的底物濃度。一般用般用mol/Lmol/L或或mmolmmol/L/L表示。表示。n不同酶的不同酶的K Km m不同，同一酶不同底物不同，同一酶不同底物KmKm也不同，但是，對一種底物，一種也不同，但是，對一種底物，一種酶的酶的K Km m是一個特征常數。通過測定是一個特征常數。通過測定K Km m，可以確定酶。，可以確定酶。nK Km m不是不是ESES的解離常數，但是，當的解離常數，但是，當K K2 2KK

35、3 3時，時，K Km mKK2 2 / K / K1 1，可用來表示酶，可用來表示酶與底物的親和力，與底物的親和力，K Km m大，表示弱；大，表示弱；K Km m小，表示強。小，表示強。V=Vmax SKm + SK Km m和和V Vmaxmax的求法的求法A A 雙倒數作圖法雙倒數作圖法n一一1/v1/v對對1/1/S S做圖，縱軸截距為做圖，縱軸截距為1/V1/Vmaxmax橫軸截距為橫軸截距為-1/ K-1/ Km m，直，直線斜率為線斜率為K Km m/V/Vmaxmax。n雙倒數法做圖有以下幾個缺點；雙倒數法做圖有以下幾個缺點；n外推至外推至-1/ K-1/ Km m時，通常到

36、了紙的邊緣甚至重新做圖；時，通常到了紙的邊緣甚至重新做圖；n低底物濃度下測定往往不準確，需從低濃度到高濃度全面選擇；低底物濃度下測定往往不準確，需從低濃度到高濃度全面選擇；n與其它作圖法比較，線性偏離少，不利于觀察酶的作用機制與其它作圖法比較，線性偏離少，不利于觀察酶的作用機制 1 1 K Km 1 1m 1 1 = = + + V V V Vmaxmax S S V Vmaxmax-4-202468100.00.20.40.60.81.01/S(1/mmol.L-1)1/v-1/Km斜率斜率=Km/Vmax1/VmaxB Eadie-HofsteeB Eadie-Hofstee做圖法做圖法n

37、該法將雙倒數方程兩邊同時乘以該法將雙倒數方程兩邊同時乘以v vV Vmaxmax得到得到nv = -Kv = -Km mv/v/S S + V+ Vmaxmaxnv v對對v/v/S S做圖，得一直線，斜率為做圖，得一直線，斜率為-K-Km m ，縱軸截，縱軸截距為距為V Vmaxmax，橫軸截距為，橫軸截距為V Vmaxmax/ K/ Km m。v/SvVmax-KmpHpH對酶作用的影響對酶作用的影響最適最適pHpH：指酶表現最大活力時的酸度。：指酶表現最大活力時的酸度。npHpH作用機制；影響蛋白的穩定、活性部位基團解離、作用機制；影響蛋白的穩定、活性部位基團解離、底物分子解離。底物分子

38、解離。v6pH10最適最適pHpH動物酶多在動物酶多在6.56.58 8；植物和微生物酶：多在；植物和微生物酶：多在4.54.56.56.5。最適最適pHpH受底物種類，濃度，緩沖液等的影響。例如細受底物種類，濃度，緩沖液等的影響。例如細菌蛋白酶對明膠，菌蛋白酶對明膠，7.07.0，對蠶蛹蛋白，對蠶蛹蛋白，8.58.5。最適溫度vt溫度對酶作用的影響溫度對酶作用的影響n最適溫度下，與溫度升高成正比，系數為最適溫度下，與溫度升高成正比，系數為1-21-2。超過則下降。超過則下降n最適溫度：酶促反應速度較長時間保持最大值時的溫度。最適溫度：酶促反應速度較長時間保持最大值時的溫度。n動物酶一般為動物

39、酶一般為37375050；植物酶一般為；植物酶一般為50506060。102030405060708090020406080100Temperature OCRelative Activity (%)n最適溫度是在一定條件下確定的，因此改變反應條件，最適溫度是在一定條件下確定的，因此改變反應條件，也會是最適溫度發生變化，例如底物種類，反應時間變也會是最適溫度發生變化，例如底物種類，反應時間變化會使最適溫度變化。化會使最適溫度變化。n機制；在較低溫度時，溫度升高加速酶分子及底物分子機制；在較低溫度時，溫度升高加速酶分子及底物分子運動，從而增加碰撞和擴散的機會；運動，從而增加碰撞和擴散的機會；n隨

40、著溫度增加，酶蛋白變性速度加快，當超過最適溫度隨著溫度增加，酶蛋白變性速度加快，當超過最適溫度后，升高溫度主要使酶蛋白變性，反應速度下降。后，升高溫度主要使酶蛋白變性，反應速度下降。激活劑對酶作用的影響激活劑對酶作用的影響n激活劑：凡能提高酶活力的物質稱激活劑。激活激活劑：凡能提高酶活力的物質稱激活劑。激活劑多為無機離子或簡單的有機物。劑多為無機離子或簡單的有機物。n激活劑對酶的作用有選擇性，一種激活劑對某種激活劑對酶的作用有選擇性，一種激活劑對某種酶起激活作用，而對另一種酶可能起抑制作用。酶起激活作用，而對另一種酶可能起抑制作用。n激活劑的作用機制：無機離子，多作為酶的輔助因子起激活劑的作用

41、機制：無機離子，多作為酶的輔助因子起激活作用，如碳酸酐酶需鋅離子。激活作用，如碳酸酐酶需鋅離子。n還原劑：使酶中的二硫鍵還原成巰基從而提高酶活性，還原劑：使酶中的二硫鍵還原成巰基從而提高酶活性，如木瓜蛋白酶和如木瓜蛋白酶和HcysHcys，GSHGSH。n生物大分子：如一些蛋白激酶激活某些酶，磷酸化酶生物大分子：如一些蛋白激酶激活某些酶，磷酸化酶b b激酶通過加減磷酸基團激活磷酸化酶。激酶通過加減磷酸基團激活磷酸化酶。n絡合劑：解除重金屬對酶的一直而增加酶活力，如絡合劑：解除重金屬對酶的一直而增加酶活力，如EDTAEDTA。抑制劑的作用抑制劑的作用n凡使酶的必需基團或酶活性基團的化學性質改變凡

42、使酶的必需基團或酶活性基團的化學性質改變而降低酶活力甚至使酶完全喪失活性的物質，稱而降低酶活力甚至使酶完全喪失活性的物質，稱抑制劑。抑制劑。n抑制程度以相對活力分數和抑制分數表征抑制程度以相對活力分數和抑制分數表征n相對活力分數（殘余活力分數）相對活力分數（殘余活力分數）=V=Vi i / V / Vo o（V Vi i為加入抑制劑后的反應速度；為加入抑制劑后的反應速度；V Vo o為不加入抑制劑為不加入抑制劑時的反應速度）。時的反應速度）。n抑制分數（指失去活力的分數）抑制分數（指失去活力的分數）nI = 1 I = 1 = 1 - V = 1 - Vi i / V/ Vo o；抑制作用可分

43、為可逆抑制和不可逆抑制。抑制作用可分為可逆抑制和不可逆抑制。 不可逆抑制不可逆抑制n指抑制劑與酶結合后不能用透析等方法除去抑制劑而恢復指抑制劑與酶結合后不能用透析等方法除去抑制劑而恢復酶活性的抑制。酶活性的抑制。n不可逆抑制劑分為非專一性抑制劑及專一性抑制劑，前者不可逆抑制劑分為非專一性抑制劑及專一性抑制劑，前者作用于酶的一類或幾類基團，這些基團包含了必需基團，作用于酶的一類或幾類基團，這些基團包含了必需基團，作用后引起酶的失活；作用后引起酶的失活；n后者專一性的作用于酶活性部位，使酶失活。為研究酶活后者專一性的作用于酶活性部位，使酶失活。為研究酶活性部位的重要試劑。兩類抑制劑在工農業生產、國

44、防及酶性部位的重要試劑。兩類抑制劑在工農業生產、國防及酶學研究中具有重要意義。學研究中具有重要意義。n非專一性抑制劑非專一性抑制劑 A A 有機磷化物有機磷化物n常見的有常見的有DFPDFP，敵敵喂，敵百蟲，對硫磷等，通式為；，敵敵喂，敵百蟲，對硫磷等，通式為；R1R2OPXOOn這些磷化物作用于蛋白酶或脂肪酶活性中這些磷化物作用于蛋白酶或脂肪酶活性中心的心的Ser-OHSer-OH，從而使酶失活。，從而使酶失活。n例如抑制膽堿酯酶活性，使乙酰膽堿不能例如抑制膽堿酯酶活性，使乙酰膽堿不能分解為乙酸和膽堿而積累，導致以乙酰膽分解為乙酸和膽堿而積累，導致以乙酰膽堿為傳導介質的神經系統處于過渡興奮狀

45、堿為傳導介質的神經系統處于過渡興奮狀態，即態，即神經中毒神經中毒。又稱為神經毒劑。又稱為神經毒劑。有機氯和有機砷化物有機氯和有機砷化物n這類抑制劑作用于這類抑制劑作用于HcysHcys-SH-SH，抑制含巰基的酶。例如對，抑制含巰基的酶。例如對氯汞苯甲酸（氯汞苯甲酸（PCMBPCMB）n這類抑制劑可以通過加入過量的含巰基化合物，例如這類抑制劑可以通過加入過量的含巰基化合物，例如HcysHcys，還原型，還原型GSHGSH等加以解除。等加以解除。ESH ClHgCOO-HgCOO-+ESHCln路易斯毒氣（路易斯毒氣（CHClCHCl=CHAsCl=CHAsCl2 2）是有機砷化合物，它與酶）是

46、有機砷化合物，它與酶的巰基結合導致中毒。解毒的方法同有機氯化合物。的巰基結合導致中毒。解毒的方法同有機氯化合物。n例如：巰基丙醇例如：巰基丙醇EAsCHCHClESHSHSSAsCHCHCl+ClClHClESSAsCHCHClCH2SHCHSHCH2OHESHSHCH2CHSSAsCHCHClCH2OH+C 重金屬重金屬n如如AgAg+ +、CuCu2+2+、HgHg2+2+、PbPb2+2+、FeFe3+3+等等。在高濃度時，。在高濃度時，能使蛋白質和酶變性失活；在低濃度時，則抑制能使蛋白質和酶變性失活；在低濃度時，則抑制某些酶有作用。某些酶有作用。n可用螯合劑（如可用螯合劑（如EDTAE

47、DTA等）解毒。等）解毒。ESHSH+ Hg2+ESSHg+ 2H烷基化試劑烷基化試劑n這類試劑有一個活潑的鹵素原子，具體的有碘這類試劑有一個活潑的鹵素原子，具體的有碘乙酸、碘乙酰胺和乙酸、碘乙酰胺和2 2，4-4-二硝基氟苯等。作用的二硝基氟苯等。作用的基團有巰基，氨基，羧基，咪唑基等。基團有巰基，氨基，羧基，咪唑基等。ESHICH2CONH2HICH2CONH2ES+氰化物、硫化物和氰化物、硫化物和COCOn能與酶中金屬離子形成穩定的絡合物，抑制酶活能與酶中金屬離子形成穩定的絡合物，抑制酶活力。例如，氰化物與鐵卟啉酶中的鐵絡合，使酶力。例如，氰化物與鐵卟啉酶中的鐵絡合，使酶失活而阻止細胞呼

48、吸。失活而阻止細胞呼吸。青霉素青霉素n青霉素是一種非專一性的不可青霉素是一種非專一性的不可逆抑制劑，它與糖肽轉肽酶活逆抑制劑，它與糖肽轉肽酶活性部位的性部位的Ser-OHSer-OH形成共價結合，形成共價結合，使酶失活。而該酶在細菌細胞使酶失活。而該酶在細菌細胞壁合成中使肽聚糖交聯，一旦壁合成中使肽聚糖交聯，一旦該酶失活，細菌細胞壁的合成該酶失活，細菌細胞壁的合成即受阻，細胞生長被損害，從即受阻，細胞生長被損害，從而起到抗菌作用。而起到抗菌作用。2. 2. 可逆抑制可逆抑制n抑制劑與酶結合后能用透析等方法除去抑制劑而抑制劑與酶結合后能用透析等方法除去抑制劑而恢復酶活性恢復酶活性n分為競爭性抑制

49、、非競爭性抑制和反競爭性抑制。分為競爭性抑制、非競爭性抑制和反競爭性抑制。n競爭性抑制競爭性抑制；指抑制劑與底物結構類似，與底；指抑制劑與底物結構類似，與底物競爭酶的活性部位，從而降低酶反應活性。物競爭酶的活性部位，從而降低酶反應活性。ESE SEPIE Ik1k2k3kiki 1ki 2+=ki 2ki 1， 為 E I 的 解 離 常 數ki為 抑 制 劑 常 數 ，vVmaxSKmIKi+1=（）111VmaxvVmaxSKmIKiS+1=（）-4-202468100.00.20.40.60.81.01/S(1/mmol.L-1)1/v1/Vmax競爭性抑制劑競爭性抑制劑無抑制劑無抑制劑

50、n競爭性抑制作用改變了競爭性抑制作用改變了K Km m，但不改變，但不改變V Vmaxmax。磺胺類藥物。磺胺類藥物NNNNH2NOHCH2NHCORR=NHCHCH2CH2CO-OCOOH2-氨 基 -4-羥 基 -6-甲 基 蝶 啶對 -氨 基 苯 甲 酸谷 氨 酸蝶 酸谷 氨 酸葉 酸1258104葉 酸 的 基 本 結 構 和 功 能 位 點延胡索酸鹽延胡索酸鹽丙二酸丙二酸戊二酸戊二酸草酰琥珀酸草酰琥珀酸 草酸鹽草酸鹽琥珀酸鹽琥珀酸鹽非競爭性抑制作用非競爭性抑制作用n底物和抑制劑與酶結合于不同位點，底物和酶結底物和抑制劑與酶結合于不同位點，底物和酶結合后還可以同抑制劑結合，抑制劑與酶結

51、合后也合后還可以同抑制劑結合，抑制劑與酶結合后也可以和底物結合，形成酶可以和底物結合，形成酶- -底物底物- -抑制劑三元復合抑制劑三元復合物。當結合上抑制劑后三元復合物不能轉變成產物。當結合上抑制劑后三元復合物不能轉變成產物。這種抑制稱非競爭性抑制作用。物。這種抑制稱非競爭性抑制作用。扭曲扭曲ESE SEPIE I+SE I S+IKiKiK mK mSvSKm +=VmaxIKi+1）（）vVm axSK mIKi+1=（）111Vm axIKi+1）（n非競爭性抑制劑存在時，非競爭性抑制劑存在時，VmaxVmax減小減小1+1+I I/Ki/Ki倍，但倍，但KmKm不變。不變。-4-20

52、2468100.00.20.40.60.81.01/S(1/mmol.L-1)1/v非非競爭性抑制劑競爭性抑制劑無抑制劑無抑制劑-1/km有非競爭性抑制有非競爭性抑制劑時劑時, ,其縱軸截距其縱軸截距和直線斜率增大，和直線斜率增大，并將隨著并將隨著I I增增大而增大，這是大而增大，這是用來判斷是否非用來判斷是否非競爭性抑制劑的競爭性抑制劑的一個根據。一個根據。反競爭性抑制作用反競爭性抑制作用n抑制劑只與抑制劑只與ESES復復合物結合，但復合物結合，但復合物不能轉變成合物不能轉變成產物，這種抑制產物，這種抑制稱反競爭性抑制。稱反競爭性抑制。底物不存在時，底物不存在時，抑制劑不能結合抑制劑不能結合

53、活性部位活性部位抑制劑只能與抑制劑只能與ESES復合物結合復合物結合vVmaxSKm+=111VmaxIKi+1）（SvSKm +=VmaxIKi+1）（八、酶的別構（變構）效應八、酶的別構（變構）效應n1.1.別構效應及別構酶別構效應及別構酶n別構調節：別構調節：酶的非催化部位與化合物可逆非共價酶的非催化部位與化合物可逆非共價結合，導致構象改變，由此改變酶的催化能力，結合，導致構象改變，由此改變酶的催化能力，該作用稱為酶的別構調節。該作用稱為酶的別構調節。n可通過該方式調節活力的酶稱為別構酶（變構可通過該方式調節活力的酶稱為別構酶（變構酶）。酶）。2.2.效應物及別構效應效應物及別構效應n效

54、應物：與酶非活性部位可逆結合、導致活性變化。效應物：與酶非活性部位可逆結合、導致活性變化。n效應物通常是小分子代謝物或輔助因子，與酶分子的別構效應物通常是小分子代謝物或輔助因子，與酶分子的別構中心結合后使酶的構象發生改變，從而使酶活性中心對底中心結合后使酶的構象發生改變，從而使酶活性中心對底物的結合及催化作用受到影響，從而調節酶促反應速度或物的結合及催化作用受到影響，從而調節酶促反應速度或代謝過程。這種代謝過程。這種現象現象稱為別構效應。稱為別構效應。n正別構效應；效應物與酶結合后增加反應速度。正別構效應；效應物與酶結合后增加反應速度。n負別構效應：效應物與酶結合后降低反應速度。負別構效應：效

55、應物與酶結合后降低反應速度。n前者對底物或效應物濃度變化敏感，濃度稍變化即改變酶前者對底物或效應物濃度變化敏感，濃度稍變化即改變酶活力。后者不敏感，達到相同速度要更高底物濃度。活力。后者不敏感，達到相同速度要更高底物濃度。n別構酶的動力學不符合米氏方程，其鑒別可用兩種方式別構酶的動力學不符合米氏方程，其鑒別可用兩種方式nHillHill系數系數n來源于研究血紅蛋白與氧結合的關系，用被底物飽和的百來源于研究血紅蛋白與氧結合的關系，用被底物飽和的百分比分比Y Y對反應速度對反應速度S S作圖，得作圖，得S S型曲線。其經驗公式為：型曲線。其經驗公式為：nLgYLgY/ /（1-Y1-Y）=nlg=

56、nlgS S-lgK-lgK；K K為平衡常數。為平衡常數。n以以LgYLgY/ /（1-Y1-Y）對對lglgS S做圖，得一條直線，其斜率為做圖，得一條直線，其斜率為n n，稱為稱為HillHill系數。米氏酶系數。米氏酶HillHill系數系數=1=1；正別構效應酶；正別構效應酶HillHill系系數數 1 1；負別構效應酶；負別構效應酶 1 1。3.3.別構酶的判斷別構酶的判斷定量判斷法定量判斷法RsRs= =（酶與底物結合達（酶與底物結合達90%90%飽和度飽和度時的底物濃度）時的底物濃度）/ /（酶與底物結合達（酶與底物結合達10%10%飽和度飽和度時的底物濃度）時的底物濃度）Rs

57、Rs=81=81，米氏酶；，米氏酶；RsRs 8181，正別構效應酶；，正別構效應酶；RsRs 8181，負別構效應酶。，負別構效應酶。S90% VS10% V= 81S90% VS10% V81S90% VS10% V81第八節第八節 酶活力測定酶活力測定 一、酶活力一、酶活力n又稱酶活性，是指酶催化一定的化學反應的能力。又稱酶活性，是指酶催化一定的化學反應的能力。n酶活力大小可用在一定的條件下，酶催化某一化學反應的酶活力大小可用在一定的條件下，酶催化某一化學反應的速度來表示。所以酶活力的測定，實際上就是測定酶所催速度來表示。所以酶活力的測定，實際上就是測定酶所催化的化學反應的速度。化的化學

58、反應的速度。n反應速度用單位時間內底物的減少量或產物的生成量來表反應速度用單位時間內底物的減少量或產物的生成量來表示。一般用單位時間內產物生成量來表示酶催化的反應速示。一般用單位時間內產物生成量來表示酶催化的反應速度比較合適。度比較合適。二、酶活力單位二、酶活力單位n酶活力高低用酶活力單位來表示，即酶活力單位是酶活力高低用酶活力單位來表示，即酶活力單位是表示酶量多少的單位。表示酶量多少的單位。n在實際工作中，酶活力單位往往與所用的測定方法、在實際工作中，酶活力單位往往與所用的測定方法、反應條件等因素有關。因此，酶活力單位以前有很反應條件等因素有關。因此，酶活力單位以前有很多表示方法。多表示方法

59、。例如乳酸脫氫酶活力定義：例如乳酸脫氫酶活力定義：2525，pH7.5pH7.5，每分鐘，每分鐘A A340340nmnm增加增加0.10.1個單位或個單位或0.50.5個單位為一個活力單位。個單位為一個活力單位。該酶活性也可用丙酮酸的增加量來表示；在最適條該酶活性也可用丙酮酸的增加量來表示；在最適條件下，每分鐘增加件下，每分鐘增加10mol10mol或或5mol/L5mol/L丙酮酸為一個丙酮酸為一個活力單位。活力單位。19611961年，國際生物化學學會（年，國際生物化學學會（IUBIUB）酶學委員會建議）酶學委員會建議用國際單位（用國際單位（IUIU）。）。n（IUIU）指在最適條件下，

60、每分鐘催化指在最適條件下，每分鐘催化1mol1mol底物減少或底物減少或1mol1mol產物生成所需要的酶量。產物生成所需要的酶量。n如果酶的底物中有一個以上的可被作用的鍵或基如果酶的底物中有一個以上的可被作用的鍵或基團，則一個國際單位指的是每分鐘催化團，則一個國際單位指的是每分鐘催化1mol1mol的的有關基團或鍵的變化所需的酶量，溫度一般規定有關基團或鍵的變化所需的酶量，溫度一般規定為為2525。19721972年，（年，（IUBIUB）推薦使用一種新的單位）推薦使用一種新的單位KatalKatal，簡稱，簡稱KatKat，來表示活力單位。以使，來表示活力單位。以使活力單位與國際單位制中的