1、1第七章第七章 RNA生物合成生物合成 及后加工及后加工DNARNA蛋 白 質復 制轉 錄翻 譯逆 轉 錄R N A復 制http:/ 第一節：轉錄概述第一節：轉錄概述 第二節：第二節：RNA合成的酶學合成的酶學 第三節：啟動子和終止子第三節：啟動子和終止子 第四節：轉錄過程第四節：轉錄過程 第五節：原核和真核第五節：原核和真核mRNA的特征的特征 第六節：第六節：RNA轉錄后的加工轉錄后的加工3第一節第一節 轉錄概述轉錄概述4一、轉錄一、轉錄 生物體以生物體以DNA為模板合成為模板合成RNA的過程叫做的過程叫做轉錄轉錄(transcription) 。 基因表達基因表達(gene expre

2、ssion):基因所貯存的遺傳信息基因所貯存的遺傳信息通過轉錄和翻譯產生具有生物功能的多肽和蛋白通過轉錄和翻譯產生具有生物功能的多肽和蛋白質的質的過程。過程。 階段特異性（時間特異性）階段特異性（時間特異性） 組織特異性（空間特異性）組織特異性（空間特異性）5 轉錄是基因表達的第一步，也是最關鍵轉錄是基因表達的第一步，也是最關鍵的一步的一步。轉錄調控蛋白。轉錄調控蛋白(Regulatory protein)決定了一個基因能否被決定了一個基因能否被RNA聚合酶轉錄。生聚合酶轉錄。生物體基因表達調控的第一步也就是決定是否物體基因表達調控的第一步也就是決定是否要讓該基因轉錄。對于大多數基因來說，這要

3、讓該基因轉錄。對于大多數基因來說，這是最重要的調控機制，在有些情況下甚至是是最重要的調控機制，在有些情況下甚至是唯一的調控機制。唯一的調控機制。6 RNA分為分為3種種:（1）信使）信使RNA分子分子(mRNA)，含有一條或多條多，含有一條或多條多肽鏈的氨基酸順序的肽鏈的氨基酸順序的信息；信息；（2）轉運）轉運RNA(tRNA),可以閱讀可以閱讀mRNA中的信息中的信息,并在蛋白質合成中攜帶和轉移特定的氨基酸到并在蛋白質合成中攜帶和轉移特定的氨基酸到生長中的多肽生長中的多肽鏈上；鏈上；（3）核糖體）核糖體RNA(rRNA),它與蛋白質結合它與蛋白質結合,形成形成蛋白質合成的蛋白質合成的場所場所

4、 核核糖體。糖體。7二、轉錄單位二、轉錄單位(Transcription unit) DNA雙鏈中按堿基配對規律能指引轉錄生雙鏈中按堿基配對規律能指引轉錄生成成RNA的一股單鏈，稱為的一股單鏈，稱為模模板鏈板鏈（template strand），），也稱作也稱作反義鏈反義鏈（antisense strand）或或負鏈負鏈。相對的另一股單鏈是。相對的另一股單鏈是編編碼鏈碼鏈（coding strand），），也稱為也稱為有有義鏈義鏈（sense strand）或）或正鏈正鏈。 85GCAGTACATGTC 33 c g t c a t g t a c a g 55GCAGUACAUGUC 3NA

5、la Val His Val C編碼鏈編碼鏈模板鏈模板鏈蛋白質蛋白質轉錄轉錄翻譯翻譯9DNA模板與模板與mRNA分分子及多肽鏈之間存在子及多肽鏈之間存在共線性關系。共線性關系。10 RNA合成由合成由RNA聚合酶聚合酶(RNA polymerase)催化。催化。當當RNA聚合酶結合到稱為啟動子聚合酶結合到稱為啟動子(Promoter)的的DNA特異轉錄起始區時，轉錄就開始了。啟動子特異轉錄起始區時，轉錄就開始了。啟動子通常在轉錄起點附近，即位于通常在轉錄起點附近，即位于RNA轉錄產生的第轉錄產生的第一個堿基對附近。一個堿基對附近。 RNA聚合酶從轉錄起始位點聚合酶從轉錄起始位點(Start p

6、oint)開始沿模開始沿模板邊移動邊合成板邊移動邊合成RNA，直至終止序列。從啟動子，直至終止序列。從啟動子延伸到終止子延伸到終止子(Terminator)所跨越的部分稱為一所跨越的部分稱為一個個轉錄轉錄單位單位。 1112 位于起始位點之前的序列稱為轉錄單位的位于起始位點之前的序列稱為轉錄單位的上游上游(Upstream)，起始位點之后，起始位點之后(在轉錄序列之內在轉錄序列之內)的序的序列被稱為列被稱為下游下游(Downstream)。按照書寫規范，轉。按照書寫規范，轉錄是從左錄是從左(上游上游)向右向右(下游下游)進行的，與進行的，與mRNA 的通的通常書寫形式：常書寫形式：5-3方向一

7、致。方向一致。 堿基的位置以起始位點為準，轉錄起始位點被定堿基的位置以起始位點為準，轉錄起始位點被定為為+1，位于其下游的堿基序數按順序值遞增。起，位于其下游的堿基序數按順序值遞增。起始位點前的一個堿基的位置被定義為始位點前的一個堿基的位置被定義為-1，越靠近轉，越靠近轉錄起始位點上游，堿基負值也越大。錄起始位點上游，堿基負值也越大。 13 轉錄的直接產物被稱為轉錄的直接產物被稱為初始轉錄本初始轉錄本(primary transcript) 。它包含一條從啟動子延伸到終止子含。它包含一條從啟動子延伸到終止子含有有5端及端及3端的端的RNA。 初始轉錄本通常不穩定初始轉錄本通常不穩定: 在原核生

8、物中，它或被迅速降解在原核生物中，它或被迅速降解(對于對于mRNA)，或，或被剪接成為成熟產物被剪接成為成熟產物(對于對于rRNA和和tRNA). 在真核生在真核生物中物中,它它或被末端修飾或被末端修飾(主要對于主要對于mRNA)，或被剪接成為成熟產物或被剪接成為成熟產物(對于所有對于所有RNA). 14三、不對稱轉錄三、不對稱轉錄(asymmetric transcription) DNA分子的雙鏈均有轉錄分子的雙鏈均有轉錄功能，但功能，但對于一個特定對于一個特定的的DNA區域或對一個特定區域或對一個特定的的mRNA，只，只能有一條能有一條鏈為模板進行轉錄，這種現象叫鏈為模板進行轉錄，這種現

9、象叫轉錄的不對稱性轉錄的不對稱性,即在即在DNA分子雙鏈上某一分子雙鏈上某一區段，一區段，一股鏈用作模板股鏈用作模板指引轉錄，另一股鏈不指引轉錄，另一股鏈不轉錄。轉錄。 RNA合成過程，天然雙鏈合成過程，天然雙鏈DNA為不對稱轉錄，但為不對稱轉錄，但體外條件下，一般體外條件下，一般DNA的的2條鏈都可以作為模板鏈條鏈都可以作為模板鏈轉錄轉錄RNA，稱為，稱為對稱對稱轉錄轉錄。 155335模板鏈模板鏈編碼鏈編碼鏈（coding strandcoding strand）結構結構基因基因(structural gene)編碼鏈編碼鏈模板鏈模板鏈（template strandtemplate st

10、rand） DNA分子雙鏈上某一區段，一條鏈可轉錄，另一條分子雙鏈上某一區段，一條鏈可轉錄，另一條鏈不轉錄，但模板鏈并非永遠在同一單鏈上。鏈不轉錄，但模板鏈并非永遠在同一單鏈上。16四、四、轉錄的一般特征轉錄的一般特征1. 底物底物: 4種核糖核苷三種核糖核苷三磷酸，磷酸，ATP,GTP, CTP, UTP;2.與與DNA復制一樣，轉錄的方向總是從復制一樣，轉錄的方向總是從53；3. 模板模板:以一條以一條DNA鏈為鏈為模板，按模板，按堿基互補堿基互補規律，在規律，在轉轉錄區錄區轉錄；轉錄；4. 不需要引物不需要引物: RNA聚合酶能起始一條新鏈的合成，聚合酶能起始一條新鏈的合成，起始的核苷酸

11、一般是嘌呤核苷酸（占起始的核苷酸一般是嘌呤核苷酸（占90%左右）左右） ，而且將在而且將在RNA鏈的鏈的5末端保持這一三磷酸基團；末端保持這一三磷酸基團； 17RNA合成主要包括四個合成主要包括四個步驟：步驟：（1）RNA聚合酶結合于聚合酶結合于DNA上的特定位點上的特定位點（2）起始）起始（3）鏈的延長）鏈的延長（4）鏈的終止和釋放）鏈的終止和釋放 1819第二節第二節 RNA合成的酶學合成的酶學20 RNA聚合酶是轉錄過程中最關鍵的酶，聚合酶是轉錄過程中最關鍵的酶，主要以雙鏈主要以雙鏈DNA為模板，以四種核苷三磷為模板，以四種核苷三磷酸作為活性前體，并以酸作為活性前體，并以Mg2+/Mn2

12、+為輔助因為輔助因子，催化子，催化RNA鏈的起始、延伸和終止，它鏈的起始、延伸和終止，它不需要任何引物，催化生成的產物是與不需要任何引物，催化生成的產物是與DNA模板鏈互補的模板鏈互補的RNA。21一、一、E.coli RNA聚合酶聚合酶 E.coli RNA聚合酶聚合酶由由6個個亞基組成（亞基組成（5個多肽鏈），個多肽鏈），即即2 四個亞基的分子量分別為四個亞基的分子量分別為36.5KDa、150 KDa、160KDa和和82 KDa，整個酶分子的分子量，整個酶分子的分子量為為465KDa； 分別是基因分別是基因rpoA、rpoB、rpoC和和rpoD的的產物；產物； 與與RNA聚合酶相結合

13、的一個很小的蛋白質聚合酶相結合的一個很小的蛋白質(MW10KDa)，叫做，叫做亞基，其功能尚不清楚，有人認亞基，其功能尚不清楚，有人認為為亞基對于亞基對于RNA聚合酶的結構和功能沒有太大聚合酶的結構和功能沒有太大的影響。的影響。 22原原核生物的核生物的 RNA聚合酶聚合酶亞單位亞單位 分子量分子量亞單亞單位數位數組分組分功能功能365122核心酶核心酶決定哪種基因被轉決定哪種基因被轉錄錄1506181核心酶核心酶與轉錄全過程有關與轉錄全過程有關1556131核心酶核心酶結合結合DNA模板模板110001核心酶核心酶未知未知702631因子因子辨認起始點辨認起始點23 這樣這樣的酶稱為的酶稱為

14、全酶全酶，RNA聚合酶是指聚合酶是指全酶。從全酶中去除全酶。從全酶中去除亞基后的其余部分亞基后的其余部分（2 ）稱為稱為核核心酶心酶； 核心酶核心酶 core enzyme 全酶全酶 holoenzyme24 亞基的最主要功能亞基的最主要功能是識別啟動子，細胞內是識別啟動子，細胞內DNA雙鏈雙鏈的哪條鏈被轉錄，即轉錄的方向、轉錄起點的選擇的哪條鏈被轉錄，即轉錄的方向、轉錄起點的選擇都與都與亞基亞基有關；有關； 不同的不同的亞基識別不同類型的啟動子，可借以調節基亞基識別不同類型的啟動子，可借以調節基因轉錄，而核心酶相同，即哪條鏈被轉錄，起始點因轉錄，而核心酶相同，即哪條鏈被轉錄，起始點在什么地方

15、靠在什么地方靠亞基識別，與核心酶亞基識別，與核心酶無關。無關。 亞基是酶的別構效應物，使酶專一性識別模板上的亞基是酶的別構效應物，使酶專一性識別模板上的啟動子。啟動子。25 核心酶在核心酶在T7噬菌體噬菌體DNA上約有上約有1300個結合位個結合位點，平均結合常數為點，平均結合常數為2X1011；亞基（因子）可以亞基（因子）可以極大地提高極大地提高RNA聚合酶對啟動子區聚合酶對啟動子區DNA序列的親序列的親和力，酶底結合常數提高和力，酶底結合常數提高103倍，酶底復合物的半倍，酶底復合物的半衰期可達數小時甚至數十小時。衰期可達數小時甚至數十小時。因子還能使因子還能使RNA聚合酶與模板聚合酶與模

16、板DNA上非特異性位點的結合常數降低上非特異性位點的結合常數降低1 04倍 ， 使 酶 底 復 合 物 的 半 衰 期 小 于倍 ， 使 酶 底 復 合 物 的 半 衰 期 小 于 1 秒 。秒 。26 枯草桿菌中有枯草桿菌中有6種不同相對分子質量的種不同相對分子質量的因子，其中因子，其中55是主要存在形式，出現在營是主要存在形式，出現在營養細胞中，養細胞中，29則主要出現在胞子形成階段，則主要出現在胞子形成階段，參與胞子形成期基因轉錄的調控。在大腸參與胞子形成期基因轉錄的調控。在大腸桿菌中，最常見的調控因子是由桿菌中，最常見的調控因子是由rpoD基因基因所編碼的所編碼的70。27 由由rpo

17、H編碼的編碼的32是與熱休克啟動子所是與熱休克啟動子所控制的基因轉錄密切相關。由控制的基因轉錄密切相關。由rpoN編碼的編碼的54則參與細胞的氮代謝。由則參與細胞的氮代謝。由T4噬菌體所編噬菌體所編碼的碼的55能與大腸桿菌能與大腸桿菌RNA聚合酶的核心酶聚合酶的核心酶結合，啟動結合，啟動T4晚期基因的轉錄。晚期基因的轉錄。28 亞基亞基參與底物的結合（包括前體核苷三磷酸以及參與底物的結合（包括前體核苷三磷酸以及已經形成的已經形成的RNA鏈），催化磷酸二酯的鏈），催化磷酸二酯的形成；形成； 在在E.coli 細胞里，某些藥物如利福霉素類藥物細胞里，某些藥物如利福霉素類藥物（抑制（抑制RNA合成的

18、起始）和鏈霉溶菌素（抑制合成的起始）和鏈霉溶菌素（抑制RNA鏈的延伸）能有效抑制鏈的延伸）能有效抑制RNA合成，試驗證明，合成，試驗證明，這這2種藥物均作用于種藥物均作用于亞基；同時，發現亞基；同時，發現亞基與前亞基與前體核苷三磷酸有很強的親和力體核苷三磷酸有很強的親和力 。29 亞基亞基參與反義鏈結參與反義鏈結合。合。 在離體轉錄試驗中，肝素在離體轉錄試驗中，肝素(heparin)能抑制轉錄作能抑制轉錄作用，人們發現肝素是與用，人們發現肝素是與亞基緊密結合的。亞基緊密結合的。亞亞基是堿性最強的亞基，而肝素是一種酸性的粘多基是堿性最強的亞基，而肝素是一種酸性的粘多糖，正好與核酸競爭糖，正好與核

19、酸競爭亞基，從而妨礙亞基，從而妨礙亞基與亞基與反義鏈的結合。反義鏈的結合。30 亞基亞基可能參與全酶和啟動子的牢固可能參與全酶和啟動子的牢固結合。這結合。這一牢固一牢固結合需要結合需要DNA雙螺旋的局部雙螺旋的局部解鏈；當解鏈；當RNA聚合酶核聚合酶核心酶沿著模板移動、進行心酶沿著模板移動、進行RNA鏈的延鏈的延伸時，需伸時，需要不要不斷地在前面解開雙斷地在前面解開雙螺旋，在螺旋，在后面恢復雙后面恢復雙螺旋，這螺旋，這些些作用可能與兩個作用可能與兩個亞基的功能亞基的功能有關。有關。 RNA聚合酶僅僅是復雜的轉錄機構的核心部分。除聚合酶僅僅是復雜的轉錄機構的核心部分。除了了RNA聚合酶之外，還需

20、要其他一些輔助的蛋白質聚合酶之外，還需要其他一些輔助的蛋白質因子。如在轉錄終止時發生作用的釋放因子因子。如在轉錄終止時發生作用的釋放因子(因子因子)和抗終止因子等。參與起始作用的和抗終止因子等。參與起始作用的因子習慣上算作因子習慣上算作RNA聚合酶的成分，其實也是一種輔助聚合酶的成分，其實也是一種輔助因子。因子。31二、真核生物二、真核生物的的RNA聚合酶聚合酶 真核細胞中有三種真核細胞中有三種RNA聚合酶聚合酶，即即RNA聚合酶聚合酶、RNA聚合酶聚合酶、RNA聚合聚合酶酶； 這些名稱最早是依據它們從這些名稱最早是依據它們從DEAE纖維素柱上洗脫的先后順纖維素柱上洗脫的先后順序而定出來的。后

21、來發現不同生物的三種序而定出來的。后來發現不同生物的三種RNA聚合酶的洗脫順聚合酶的洗脫順序并不相同，因而改用三種不同的序并不相同，因而改用三種不同的RNA聚合酶聚合酶對于對于-鵝膏蕈堿鵝膏蕈堿(-amanitine)的敏感性不同來進行區別。的敏感性不同來進行區別。RNA聚合酶聚合酶I基本不受基本不受-鵝膏蕈堿的抑制，在大于鵝膏蕈堿的抑制，在大于103 mol/L時才表現出輕微的抑制時才表現出輕微的抑制作用；作用；RNA聚合酶聚合酶對于對于-鵝膏蕈堿最為敏感，鵝膏蕈堿最為敏感，在在10-9-10-8mol/L濃度下就會被抑制；濃度下就會被抑制；RNA聚合酶聚合酶的敏感性介于的敏感性介于RNA聚

22、聚合酶合酶和和之間，之間，在在10-5-10-4 mol/L時表現抑制作用。時表現抑制作用。32 真核生物的真核生物的RNA聚合酶聚合酶 種類種類 對鵝膏蕈對鵝膏蕈堿堿的的反應反應 rRNAsnRNAmRNA 5S-rRNA tRNA耐受耐受極敏感極敏感中度敏感中度敏感轉錄產物轉錄產物33 RNA聚合酶聚合酶主要存在于主要存在于核仁中，其核仁中，其功能是合成功能是合成5.8 S rRNA、18S rRNA和和28S rRNA； RNA聚合酶聚合酶存在于存在于核質中，其核質中，其功能是合成功能是合成mRNA以以及及snRNA； RNA聚合酶聚合酶也存在于也存在于核質中，其核質中，其功能是合成功能

23、是合成tRNA和和5S rRNA以及轉錄以及轉錄Alu序列。序列。 34 在細胞質中也能發現一些在細胞質中也能發現一些RNA聚合酶聚合酶，它是從，它是從細胞核中滲漏出來的。細胞核中滲漏出來的。 三種主要的三種主要的RNA聚合酶的分子量都在聚合酶的分子量都在500 KDa左左右右(14S-15S)，每種酶分子含有兩個大亞基和，每種酶分子含有兩個大亞基和48個小亞基，每個小亞基的分子量為個小亞基，每個小亞基的分子量為10 KDa-90KDa。 像原核生物一樣，不同種類的基因需要不同的蛋像原核生物一樣，不同種類的基因需要不同的蛋白質輔助因子協助白質輔助因子協助RNA聚合酶進行工作聚合酶進行工作 。3

24、53036 細菌細菌RNA聚合酶的核心酶可以獨立合成聚合酶的核心酶可以獨立合成RNA，它由，它由亞基的兩個拷貝和亞基的兩個拷貝和、各一個拷貝組成；該酶各一個拷貝組成；該酶與真核生物的聚合酶有密切聯系：與真核生物的聚合酶有密切聯系： 大亞基大亞基和和與與Pol 的大亞基的大亞基RPB1及及RPB2同源；同源；亞基與亞基與RPB11及及RPB3同源；同源；亞基與亞基與RPB6同源。同源。 原則上，細菌的核心酶能夠在原則上，細菌的核心酶能夠在DNA分子的任何一點分子的任何一點開始轉錄，但在細胞內，聚合酶只在啟動子處起始開始轉錄，但在細胞內，聚合酶只在啟動子處起始轉錄由于轉錄由于起始因子的加入。此為起

25、始因子的加入。此為全酶全酶。37 大腸桿菌最常見的大腸桿菌最常見的因子為因子為70。70 識別的啟動子識別的啟動子有以下共同特征：兩段有以下共同特征：兩段6個核苷酸長的保守序列個核苷酸長的保守序列,其中心分別位于起始位點上游約其中心分別位于起始位點上游約10bp和和35bp處，處，被被1719個核苷酸的非特異序列隔開個核苷酸的非特異序列隔開。38第第三節三節 啟動子和終止子啟動子和終止子39 啟動子啟動子是基因轉錄起始所必需的一段是基因轉錄起始所必需的一段DNA序列，一般位于結構基因的上游，是序列，一般位于結構基因的上游，是DNA分子與分子與RNA聚合酶特異結合而起始轉錄的聚合酶特異結合而起始

26、轉錄的部位。部位。 啟動子本身不被轉錄。啟動子本身不被轉錄。40一、原核生物的啟動子結構一、原核生物的啟動子結構 原核生物原核生物啟動子有啟動子有4 個保守特征：個保守特征：起始位點、起始位點、-10 區、區、-35 區以及區以及-10 和和-35 區之間的間隔區之間的間隔距離。距離。411. 起起始位點通常都是嘌呤堿基始位點通常都是嘌呤堿基 (90%)原核典型的啟動子轉錄啟始位點、原核典型的啟動子轉錄啟始位點、-10 區、區、-35 區區 42 保守序列保守序列 （一一致性序列）致性序列）開始轉錄開始轉錄T T G A C AA A C T G T-35 區區(Pribnow box)T A

27、 T A A T A T A T T A -10 區區1-30-5 010-10-40-205 3 3 5 432. Pribnow框框 Pribnow框：在框：在原核生物啟動子原核生物啟動子-10區域的一段核區域的一段核苷酸序列中，大多包含苷酸序列中，大多包含TATAAT序列或是稍有不序列或是稍有不同的變化形式，是同的變化形式，是RNA聚合酶牢固結合的位點，聚合酶牢固結合的位點，此段序列稱為此段序列稱為Pribnow框。由于其中心在框。由于其中心在-10位點位點附近，所以又稱為附近，所以又稱為-10序列。不同的啟動子，其位序列。不同的啟動子，其位置略有不同，一般都在置略有不同，一般都在-4到

28、到-13的范圍之內。的范圍之內。44 一致序列一致序列 ：T80A95T45A60A50T9645 其中帶有底線的其中帶有底線的T稱為稱為保守保守T,它存在于目前已知它存在于目前已知的幾乎所有啟動子中的幾乎所有啟動子中,一般位于一般位于-6到到-9位點。頭兩位點。頭兩個核苷酸是個核苷酸是TA的也占的也占3/4以上；以上； Pribnow框是框是RNA聚合酶的牢固結合位點（簡稱聚合酶的牢固結合位點（簡稱結合結合位點）；位點）； 由于由于RNA聚合酶的誘導作用，在富含聚合酶的誘導作用，在富含AT的的Pribnow框內的框內的DNA雙螺旋首先雙螺旋首先“熔解熔解”。DNA雙螺旋在起始點周圍大約雙螺旋

29、在起始點周圍大約14 bp的距離內分開以形的距離內分開以形成轉錄泡，即與成轉錄泡，即與RNA聚合酶形成開放式啟動子復聚合酶形成開放式啟動子復合體，使合體，使RNA聚合酶定向移動而行使其轉錄功能。聚合酶定向移動而行使其轉錄功能。463. Sextama框框 對于大多數啟動子，在對于大多數啟動子，在RNA聚合酶覆蓋的部分還聚合酶覆蓋的部分還有一個重要的區域，叫做有一個重要的區域，叫做Sextama框框,其位置在其位置在-35附近，因附近，因此此又叫又叫 -35序列。序列。 -35序列是序列是RNA聚合酶初始結合位點，聚合酶初始結合位點，RNA聚合聚合酶依靠其酶依靠其亞基亞基(因子因子)識別該識別該

30、位點，因位點，因此又稱為此又稱為RNA聚合酶識別聚合酶識別位點。位點。 一致序列為一致序列為：T82T84G78A65C54A45 47 RNA聚合酶先結合于聚合酶先結合于-35序列，然后才結合于序列，然后才結合于-10序列。序列。 有實驗表明，有實驗表明，亞基識別亞基識別-35序列并與之結合。由序列并與之結合。由于于RNA聚合酶分子很長，大約能覆蓋聚合酶分子很長，大約能覆蓋70bp的的DNA序列。因此酶分子上的一個適合部位就能達到序列。因此酶分子上的一個適合部位就能達到-10 序列區域。酶分子一旦與序列區域。酶分子一旦與-10序列結合以后序列結合以后，亞亞基就立即從識別位點上解離下來基就立即

31、從識別位點上解離下來 。48 -35序列的重要性還在于，這一序列的核苷酸結構序列的重要性還在于，這一序列的核苷酸結構在很大程度上決定了啟動子的強度。在很大程度上決定了啟動子的強度。RNA聚合酶聚合酶很容易識別強啟動子很容易識別強啟動子,而對弱啟動子的識別較差。而對弱啟動子的識別較差。 Pribnow框和框和Sextama的堿基序列通過影響開放性的堿基序列通過影響開放性啟動子復合物的形成速度而控制轉錄。啟動子復合物的形成速度而控制轉錄。 這兩個序列是決定啟動子強度的重要因素，細胞可這兩個序列是決定啟動子強度的重要因素，細胞可以由此來調節單位時間內所轉錄的以由此來調節單位時間內所轉錄的mRNA分子

32、數，分子數，從而控制蛋白質的合成速度。從而控制蛋白質的合成速度。49 啟動子的強度指一個啟動子在一定的時間啟動子的強度指一個啟動子在一定的時間內可以起始轉錄物的多少；具有與共有序內可以起始轉錄物的多少；具有與共有序列近似序列的啟動子列近似序列的啟動子“更強更強”。 啟動子的強度受以下因素影響：啟動子最啟動子的強度受以下因素影響：啟動子最初與聚合酶的結合程度、對異構化作用的初與聚合酶的結合程度、對異構化作用的支持效率，以及此后聚合酶逃離的難易程支持效率，以及此后聚合酶逃離的難易程度。度。504. -10 和和-35 區之間間隔距離區之間間隔距離 在在90%啟動子中，啟動子中，-35 和和-10

33、區之間的分隔區之間的分隔距離在距離在16 到到19bp 之間。個別例外的可以小之間。個別例外的可以小于于15 或者大于或者大于20bp。盡管間隔區的真實序。盡管間隔區的真實序列并不重要，但其距離大小保持兩個位點列并不重要，但其距離大小保持兩個位點恰當分隔，從而在適合恰當分隔，從而在適合RNA 聚合酶的幾何聚合酶的幾何結構方面是很重結構方面是很重要的。要的。51幾種啟動子的幾種啟動子的Sextama框、框、Pribnow框以及框以及二者之間的距離二者之間的距離 52二、真核生物的啟動子結構二、真核生物的啟動子結構 真核生物真核生物有三種有三種RNA聚合酶，每一種都有自己聚合酶，每一種都有自己的啟

34、動子類型：的啟動子類型： RNA聚合酶聚合酶只轉錄只轉錄rRNA（合成（合成5.8S rRNA、18S rRNA和和28S rRNA），只），只有一種啟動子類型。有一種啟動子類型。 RNA聚合酶聚合酶負責蛋白質編碼基因（合成負責蛋白質編碼基因（合成mRNA和和snRNA） ，其啟動子結構最復雜。，其啟動子結構最復雜。 RNA聚合酶聚合酶負責合成負責合成tRNA和和5S rRNA，其啟動，其啟動子常位于轉錄的子常位于轉錄的DNA序列之內，稱為序列之內，稱為下游啟動子下游啟動子。531. RNA聚合酶聚合酶的啟動子的啟動子 RNA聚合酶聚合酶轉錄轉錄rRNA，大多數真核生物，大多數真核生物rRNA

35、基因啟動子可以分為兩個部分：核心元件，位于基因啟動子可以分為兩個部分：核心元件，位于轉錄起始點周轉錄起始點周圍（圍（-40+5），又稱），又稱近啟動子近啟動子，其，其功能決定轉錄起始的精確位置；功能決定轉錄起始的精確位置；-165-40稱為稱為遠遠啟動子啟動子（上游控制元件），其功能是影響轉錄的（上游控制元件），其功能是影響轉錄的頻率。頻率。 每每種生物都有特定的轉錄因子與種生物都有特定的轉錄因子與RNA聚合酶聚合酶結合，因此，結合，因此，RNA聚合酶聚合酶的啟動子具有明顯的啟動子具有明顯的種族特異性。的種族特異性。 542. RNA聚合酶聚合酶的啟動子結構的啟動子結構 1）轉錄起始位點：）轉

36、錄起始位點：具有基因表達所需的保守序具有基因表達所需的保守序列，該保守序列的共同序列為列，該保守序列的共同序列為PyPyANT/APyPy（Py指嘧啶指嘧啶C或或T，N為任意為任意堿基），這個保守序列稱為轉錄起始位點。堿基），這個保守序列稱為轉錄起始位點。 轉錄起始位點與轉錄起始位點與TATA框一起組成核心啟動子，框一起組成核心啟動子，啟動位于下游的任意基因的轉錄啟動位于下游的任意基因的轉錄。 552）基本啟動子：）基本啟動子：位于轉錄起始位點上游位于轉錄起始位點上游-25-30范圍的范圍的7bp左右的保守區域，共同序列為左右的保守區域，共同序列為TATAAAA(非模板鏈序列非模板鏈序列)，其

37、中第，其中第5、7位的位的A常常常被常被T取代，該保守區的堿基頻率是取代，該保守區的堿基頻率是T95A87T93A85A63A83A50，這一序列也稱為，這一序列也稱為TATA框框。TATA框是很多真核生物類型框是很多真核生物類型啟動子的核心啟動啟動子的核心啟動子組成部分，與原核生物啟動子子組成部分，與原核生物啟動子-10的序列之間有的序列之間有很大的相似性。差別主要在于轉錄起始點距離的很大的相似性。差別主要在于轉錄起始點距離的不同。不同。 TATA框主要與基因轉錄的起始位點的定位有框主要與基因轉錄的起始位點的定位有關，而與調節轉錄的效率無關。關，而與調節轉錄的效率無關。563）轉錄啟動上游元

38、件：）轉錄啟動上游元件：在許多蛋白質編碼基因在許多蛋白質編碼基因的核心啟動子上游的核心啟動子上游100-200bp范圍內，還存在范圍內，還存在一個轉錄調控區，含有組成啟動子的多個元一個轉錄調控區，含有組成啟動子的多個元件，統稱為上游啟動子元件，這些序列元件件，統稱為上游啟動子元件，這些序列元件的功能主要是提高轉錄的效率和特異性。的功能主要是提高轉錄的效率和特異性。4）轉錄起點下游元件：）轉錄起點下游元件：上游元件和下游元件統上游元件和下游元件統稱為啟動子近端序列元件（稱為啟動子近端序列元件（promoter proximal sequence element, PSE）。）。57 真核生物的核

39、心啟動子真核生物的核心啟動子(core promoter)是指在體外檢是指在體外檢測時，測時，Pol 精確地起始轉錄所需要的最少一組序列精確地起始轉錄所需要的最少一組序列元件；代表性的核心啟動子約有元件；代表性的核心啟動子約有40個核苷酸，向轉錄個核苷酸，向轉錄起始點的上游或下游延伸。核心啟動子中發現的起始點的上游或下游延伸。核心啟動子中發現的4個個元件：元件：TFB識別元件識別元件(TFB recognition element, BRE)、TATA元件元件(盒盒)、起始位點、起始位點(initiator, Inr)和下和下游啟動子元件游啟動子元件(downstream promoter e

40、lement, DPE)。一個啟動子含有其中的一個啟動子含有其中的2或或3個元件。個元件。58 在核心啟動子之外（上游）存在一些在體內進行有在核心啟動子之外（上游）存在一些在體內進行有效轉錄所需的其他序列元件，共同組成調節序列效轉錄所需的其他序列元件，共同組成調節序列(regulatory sequence)，包括：啟動子最近元件，包括：啟動子最近元件(promoter proximal element)，上游激活物序列，上游激活物序列(upstream activator sequence, UAS)，增強子，增強子(enhancer)，以及一列的沉默子，以及一列的沉默子(silencer)

41、、邊界元件、邊界元件(boundary element)和絕緣子和絕緣子(insulator)組成的抑制元組成的抑制元件。所有這些件。所有這些DNA元件都與調節蛋白（激活或抑制元件都與調節蛋白（激活或抑制因子）結合，促進或阻礙從核心啟動子開始的轉錄。因子）結合，促進或阻礙從核心啟動子開始的轉錄。59603. RNA聚合酶聚合酶的下游啟動子的下游啟動子 5S RNA基因的啟動子位于轉錄區內，在轉錄起始基因的啟動子位于轉錄區內，在轉錄起始點下游點下游5083之間之間; 缺失缺失50以前的序列和缺失以前的序列和缺失83以后的序列都能以后的序列都能正常轉錄，但正常轉錄，但5083這段序列缺失，無轉錄這

42、段序列缺失，無轉錄活性；而加上此段序列，又能正常活性；而加上此段序列，又能正常轉錄轉錄; 把這段把這段DNA序列插入任何序列插入任何DNA中，中，RNA聚合酶聚合酶都能識別并起始轉錄。這段序列就是都能識別并起始轉錄。這段序列就是5S RNA基因基因的啟動子，這樣的位于轉錄起始點下游的啟動子的啟動子，這樣的位于轉錄起始點下游的啟動子又稱為又稱為內部啟動子內部啟動子。61 除啟動子外，真核生物轉錄起始點上游除啟動子外，真核生物轉錄起始點上游處還有一個稱為增強子的序列，它能極大地處還有一個稱為增強子的序列，它能極大地增強啟動子的活性，它的位置往往不固定，增強啟動子的活性，它的位置往往不固定，可存在于

43、啟動子上游或下游，對啟動子來說可存在于啟動子上游或下游，對啟動子來說它們正向排列和反向排列均有效，對異源的它們正向排列和反向排列均有效，對異源的基因也起到增強作用。基因也起到增強作用。 增強子增強子（enhancer)，又稱為遠上游序列，又稱為遠上游序列，一般都在一般都在-100以上，是啟動子的上游或下游以上，是啟動子的上游或下游對轉錄有促進作用的一段對轉錄有促進作用的一段DNA序列。序列。 62增強增強子的特點子的特點: 遠距離效應：一般位于上游遠距離效應：一般位于上游-200bp處，但可增強遠處，但可增強遠處啟動子的轉錄，即使相距處啟動子的轉錄，即使相距10kb也能發揮作用；也能發揮作用；

44、 無方向性：無論位于靶基因的上游、下游或內部都無方向性：無論位于靶基因的上游、下游或內部都可發揮增強轉錄的作用；可發揮增強轉錄的作用； 順式調節：只調節位于同一染色體上的靶基因，而順式調節：只調節位于同一染色體上的靶基因，而對其他染色體上的基因沒有作用。對其他染色體上的基因沒有作用。 無物種和基因的特異性：無物種和基因的特異性： 具有組織特異性：具有組織特異性： 有相位性：其作用和有相位性：其作用和DNA的構象有關；的構象有關； 有的增強子可以對外部信號產生反應：有的增強子可以對外部信號產生反應：63第四節第四節 轉錄過程轉錄過程64一、一、 模板識別模板識別 該階段主要指該階段主要指RNA聚

45、合酶與啟動子聚合酶與啟動子DNA雙鏈相互作用并與之結合的過程。轉雙鏈相互作用并與之結合的過程。轉錄起始前，啟動子附近的錄起始前，啟動子附近的DNA雙鏈分開形雙鏈分開形成轉錄泡以促使底物核糖核苷酸與模板成轉錄泡以促使底物核糖核苷酸與模板DNA的堿基配對。的堿基配對。 65二、二、 轉錄起始轉錄起始 就是就是RNA鏈上第一個核苷酸鍵的產生。鏈上第一個核苷酸鍵的產生。啟動子與聚合酶結合，啟動子啟動子與聚合酶結合，啟動子-聚合酶復合聚合酶復合體一旦形成體一旦形成 ，就發生結構改變，起始過程，就發生結構改變，起始過程繼續；繼續；DNA堿基對斷裂，形成堿基對斷裂，形成“泡泡”；總；總是從是從5向向3方向進

46、行。方向進行。 66（一（一）原）原核生物的轉錄起始核生物的轉錄起始 當當亞基發現其識別位點時，全酶就與啟動亞基發現其識別位點時，全酶就與啟動子的子的-35區區-10區序列結合形成啟動子復合物。由區序列結合形成啟動子復合物。由亞基催化形成亞基催化形成RNA的第一個磷酸二酸鍵，合成的第一個磷酸二酸鍵，合成69bp時時因子從全酶解離下來，靠核心酶在因子從全酶解離下來，靠核心酶在DNA鏈上向下游滑動，而脫落的鏈上向下游滑動，而脫落的因子與另一個因子與另一個核心酶結合成全酶反復利用。核心酶結合成全酶反復利用。 67（1）酶找到啟動子順序并與其形成封閉復合）酶找到啟動子順序并與其形成封閉復合物物(此時此

47、時DNA仍處于雙螺旋狀態仍處于雙螺旋狀態)。這一步所。這一步所識別的是識別的是-35序列，因此序列，因此-35序列的突變損害序列的突變損害啟動子的結合。啟動子的結合。68（2）然后，封閉復合物轉變為開放復合物，聚合酶）然后，封閉復合物轉變為開放復合物，聚合酶全酶所結合的全酶所結合的DNA序列中有一小段雙鏈被解開。此序列中有一小段雙鏈被解開。此時酶的結合比較緊密。在這個轉變中時酶的結合比較緊密。在這個轉變中-10區約有區約有17bp被解旋，暴露出模板鏈。被解旋，暴露出模板鏈。-10序列富于序列富于AT堿基堿基對，因為對，因為AT對比對比GC對更易于對更易于“融化融化”。-10區的突區的突變可阻礙

48、開放復合物的形成。許多突變改變了變可阻礙開放復合物的形成。許多突變改變了-10序列中的堿基，但并未減低其序列中的堿基，但并未減低其AT對的水平，卻仍對的水平，卻仍然能阻礙其然能阻礙其“融化融化”為開放復合物，可見為開放復合物，可見-10區除區除了要易于融化之外，還必須有特異的形狀，以便了要易于融化之外，還必須有特異的形狀，以便RNA 聚合酶能夠識別它。聚合酶能夠識別它。 69（3） 封封閉性和開放性啟動子復合物均為二元復合閉性和開放性啟動子復合物均為二元復合物。因為只有全酶和物。因為只有全酶和DNA這兩種成分在開放性啟這兩種成分在開放性啟動子復合物中，動子復合物中，RNA聚合酶上的起始位點和延

49、長聚合酶上的起始位點和延長位點被相應的核苷酸前體充滿，在位點被相應的核苷酸前體充滿，在亞基的催化下亞基的催化下形成形成RNA的第一個磷酸二酯鍵。的第一個磷酸二酯鍵。（4） 此此時，由時，由RNA聚合酶、聚合酶、DNA模扳和新生的模扳和新生的RNA鏈組成的復合物稱為三元復合物。三元復合鏈組成的復合物稱為三元復合物。三元復合物形成之后，物形成之后，因子從全酶解離下來，致使三元復因子從全酶解離下來，致使三元復合物中核心酶與合物中核心酶與DNA的親和力下降到非特異性結的親和力下降到非特異性結合水平以下。合水平以下。 70轉錄起始過程轉錄起始過程71 新生的新生的RNA鏈與模板形成的雜交雙鏈很短鏈與模板

50、形成的雜交雙鏈很短 ; 用胰臟用胰臟RNAase處理轉錄系統時處理轉錄系統時,由于胰臟由于胰臟RNAase能能切斷單鏈切斷單鏈RNA而不能切斷而不能切斷RNADNA雜交分子雜交分子,結果結果得到大約得到大約10個堿基的個堿基的RNA片斷片斷; 這這10個堿基中多少是受到個堿基中多少是受到DNA的保護的的保護的(形成氫鍵形成氫鍵),多少是受到多少是受到RNA聚合酶保護的聚合酶保護的(空間作用空間作用)，尚不清楚。，尚不清楚。有人推測只有兩個左右核苷酸能與有人推測只有兩個左右核苷酸能與DNA形成氫鍵而形成氫鍵而配對形成雜交狀態。而在配對形成雜交狀態。而在DNA合成中的引物可長達合成中的引物可長達5

51、060個核苷酸均與個核苷酸均與DNA形成氫鍵結合。為什么有形成氫鍵結合。為什么有這樣的區別，其原因還不清楚。這樣的區別，其原因還不清楚。72 真核生物轉錄起始十分復雜，往往需要多真核生物轉錄起始十分復雜，往往需要多種蛋白因子的協助，已經知道，在所有的細種蛋白因子的協助，已經知道，在所有的細胞中有一類叫做胞中有一類叫做轉錄因轉錄因子的蛋白質分子，它子的蛋白質分子，它們與們與RNA聚合酶聚合酶形成轉錄起始復合物，共形成轉錄起始復合物，共同參與轉錄起始的過程。真核生物基因中，同參與轉錄起始的過程。真核生物基因中，有專門為蛋白質編碼的基因，這些基因由有專門為蛋白質編碼的基因，這些基因由RNA聚合酶聚合

52、酶負責進行轉錄起始關鍵性作用。負責進行轉錄起始關鍵性作用。 （二）真核生物（二）真核生物的轉錄起始的轉錄起始73 根據這些轉錄因子的作用特點可大致分根據這些轉錄因子的作用特點可大致分為二類：第一類為普遍轉錄因子，它們與為二類：第一類為普遍轉錄因子，它們與RNA聚合酶聚合酶共同組成轉錄起始復合物，轉共同組成轉錄起始復合物，轉錄才能在正確的位置上開始。普遍轉錄因子錄才能在正確的位置上開始。普遍轉錄因子是由多種蛋白質分子組成的，其中包括特異是由多種蛋白質分子組成的，其中包括特異結合在結合在TATA盒上的蛋白質，叫做盒上的蛋白質，叫做TATA盒結盒結合蛋白，還有另外一組復合物叫做轉錄因子合蛋白，還有另

53、外一組復合物叫做轉錄因子D。TFD 再與再與RNA聚合酶聚合酶結合完成轉結合完成轉錄起始復合物的形成。錄起始復合物的形成。74 除除TFD以外，在細胞核提取物中還發現以外，在細胞核提取物中還發現TFA，TFF，TFE，TFH等，它們在轉等，它們在轉錄起始復合物組裝的不同階段起作用：錄起始復合物組裝的不同階段起作用： 轉錄因子（轉錄因子（Transcription Factor)結合順序：結合順序：D-A-B-F-E-HTFII-D：首先與：首先與TATA區結合區結合TFII-A：穩定：穩定TFII-D與與TATA區結合區結合TFII-B：幫助：幫助RNA酶與啟動子區結合酶與啟動子區結合TFII

54、-F：與：與RNA酶結合酶結合TFII-E與與TFII-H：促進轉錄起始：促進轉錄起始75三、通過啟動子三、通過啟動子轉錄起始后直到形成轉錄起始后直到形成9個核苷酸短鏈是通過個核苷酸短鏈是通過啟動子階段，此時啟動子階段，此時RNA聚合酶一直處于啟聚合酶一直處于啟動子區，新生的動子區，新生的RNA鏈與鏈與DNA模板鏈的結模板鏈的結合不夠牢固，很容易從合不夠牢固，很容易從DNA鏈上掉下來并鏈上掉下來并導致轉錄重新開始。導致轉錄重新開始。76四、轉錄的延伸四、轉錄的延伸一旦一旦RNA聚合酶成功地合成聚合酶成功地合成9個以上核苷酸并離開啟個以上核苷酸并離開啟動子區，轉錄便進入延伸階段。所以，通過啟動子

55、的動子區，轉錄便進入延伸階段。所以，通過啟動子的時間代表一個啟動子的強弱。時間代表一個啟動子的強弱。大腸桿菌大腸桿菌RNA聚合酶的活性一般為每秒聚合酶的活性一般為每秒50-90個核苷個核苷酸。隨著酸。隨著RNA聚合酶的移動，聚合酶的移動，DNA雙螺旋持續解開，雙螺旋持續解開，暴露出新的單鏈暴露出新的單鏈DNA模板，新生模板，新生RNA鏈的鏈的3末端不斷末端不斷延伸，在解鏈區形成延伸，在解鏈區形成RNA-DNA雜合物。雜合物。在在核心酶核心酶作用下，作用下，NTP不斷聚合，不斷聚合，RNA鏈不斷延長。鏈不斷延長。(NMP) n + NTP (NMP) n+1 + PPi77五、鏈的五、鏈的終止終

56、止1. 終止子終止子概念：概念：RNA鏈的終止與一段序列有關，其終止信號鏈的終止與一段序列有關，其終止信號存在于已轉錄過的序列。這段終止信號序列叫存在于已轉錄過的序列。這段終止信號序列叫終止子。終止子。終止子可以分為兩類：終止子可以分為兩類：1）不）不依賴于蛋白質輔助因子而能實現終止依賴于蛋白質輔助因子而能實現終止作用；作用；2）依）依賴蛋白質輔因才能實現終止作用。這種蛋白質賴蛋白質輔因才能實現終止作用。這種蛋白質輔因子稱為輔因子稱為釋放因子，通常又稱釋放因子，通常又稱因子。因子。78兩類終止子的共同序列特征：兩類終止子的共同序列特征： 在轉錄終止點之前有一段回文在轉錄終止點之前有一段回文序列

57、；序列； 回文序列的兩個重復部分回文序列的兩個重復部分(每個每個720bp)由幾個堿由幾個堿基對的不重復節段基對的不重復節段隔開；隔開； 回文序列的對稱軸一般距轉錄終止點回文序列的對稱軸一般距轉錄終止點1624bp。 79兩類終止子的不同點是：兩類終止子的不同點是： 不依賴不依賴因子的終止子的回文序列中富含因子的終止子的回文序列中富含GC堿基堿基對，在回文序列的下游方向又常有對，在回文序列的下游方向又常有68個個AT堿基堿基對對(模板鏈上為模板鏈上為A)； 依賴依賴因子的終止子中回文序列的因子的終止子中回文序列的GC對含量較少。對含量較少。在回文序列下游方向的序列沒有固定特征，其在回文序列下游

58、方向的序列沒有固定特征，其AT對含量比前一種終止對含量比前一種終止子低。子低。80E.coli的色氮酸操縱元的轉錄終止子（不依賴的色氮酸操縱元的轉錄終止子（不依賴因子）因子）81噬菌體噬菌體的的TA1TA1終止子序列（依賴終止子序列（依賴因子）因子）822. 抗抗終止及抗終止因子終止及抗終止因子 在一些終止子上，終止事件可以被某些與在一些終止子上，終止事件可以被某些與RNA 聚聚合酶相互作用的特異輔助因子所阻止。合酶相互作用的特異輔助因子所阻止。“抗終止抗終止(Antitermination)”使酶越過終止子序列而繼續轉使酶越過終止子序列而繼續轉錄，此過程稱為錄，此過程稱為通讀通讀(Readt

59、hrough)。 抗終止是在細菌噬菌體感染中被發抗終止是在細菌噬菌體感染中被發現的，是現的，是細菌細菌操縱子和噬菌體調控回路中的一個調控操縱子和噬菌體調控回路中的一個調控機制。機制。 83圖圖5.11 抗終止作用決定抗終止作用決定RNA聚合酶在終止子位聚合酶在終止子位 點處終止還是通讀下去點處終止還是通讀下去84第五節第五節 原核和真核生物原核和真核生物mRNA的特的特征比較征比較851. mRNA在大腸桿菌細胞內占總在大腸桿菌細胞內占總RNA的的2%左右，左右，tRNA占占16%左右，左右，rRNA則占則占80%以上。以上。 真核細胞的真核細胞的mRNA往往以較大相對分子量的前往往以較大相對

60、分子量的前體體RNA出現在核內，只有成熟的、相對分子質量出現在核內，只有成熟的、相對分子質量明顯變小并經化學修飾的明顯變小并經化學修飾的mRNA才能進入細胞質，才能進入細胞質，參與蛋白質的合成。所以，真核細胞參與蛋白質的合成。所以，真核細胞mRNA的合的合成和功能表達發生在不同的空間和時間范疇內。成和功能表達發生在不同的空間和時間范疇內。2. mRNA的代謝很快，細菌的代謝很快，細菌mRNA平均半壽期為平均半壽期為2分鐘，真核分鐘，真核mRNA半壽期較長，平均半壽期較長，平均5小時。小時。863. 原核生物原核生物mRNA與相應的基因是共線的，與相應的基因是共線的，并且是多順反子；真核不是共線