1、土壤腐殖質(zhì)的提取、分離與純化綜述大車神摘要腐殖質(zhì)（humicsubstances;HS）是一類呈棕黑色或棕褐色、無(wú)定形、酸性、親水性、多分散的有機(jī)物質(zhì)，廣泛存在于土壤、水體（如河流、湖泊、海洋和地下水等）以及沉積物中，根據(jù)溶解性，腐殖質(zhì)可分為3類：腐殖酸（HA,又稱胡敏酸，只溶于堿不溶于酸），富里酸（FA,又稱黃腐酸，既溶于酸又溶于堿）和胡敏素（Humin,又稱腐殖素、腐黑物，酸堿都不溶）殖酸、富里酸廣泛存在于土壤、水體以及沉積物中，對(duì)有金屬離子、機(jī)污染物、及水處理過(guò)程中消毒副產(chǎn)物的形成有重要的影響。本文通過(guò)查閱文獻(xiàn)，總結(jié)目前學(xué)者對(duì)于腐殖酸的提取、分離與純化的相關(guān)技術(shù)進(jìn)行闡述。【關(guān)鍵詞】腐殖酸

2、、富里酸、胡敏酸、胡敏素、分離提純、概述土壤是人類賴以生存的物質(zhì)基礎(chǔ)，是人類不可缺少、不可再生的自然資源1,2土壤有機(jī)質(zhì)是土壤的重要組成部分，在土壤肥力、環(huán)境保護(hù)、農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展等方面都具有重要作用。其主要成分包括有機(jī)質(zhì)及其他有機(jī)物，其中腐殖質(zhì)類物質(zhì)占有機(jī)質(zhì)總量的85%95%腐殖質(zhì)（humicsubstances;HS）是一類呈棕黑色或棕褐色、無(wú)定形、酸性、親水性、多分散的有機(jī)物質(zhì)，廣泛存在于土壤、水體（如河流、湖泊、海洋和地下水等）以及沉積物中網(wǎng)。根據(jù)溶解性，腐殖質(zhì)可分為3類：腐殖酸（HA,又稱胡敏酸，只溶于堿不溶于酸），富里酸（FA,又稱黃腐酸，既溶于酸又溶于堿）和胡敏素（Humin,又稱

3、腐殖素、腐黑物，酸堿都不溶）4,5,其中可提取腐殖質(zhì)（HA+FA）組成復(fù)雜，存在氨基、羥基、酶基、染基和甲氧基等多種基團(tuán)，能夠?qū)λw中各種機(jī)污染物和重金屬的遷移轉(zhuǎn)化進(jìn)行影響和控制6-8（富里酸（Fulvicacid,簡(jiǎn)稱FA）屬于腐植酸的一種，別名為黃腐殖酸，是土壤腐植質(zhì)的組成成分之一。顏色較淺，多呈黃色。主要由碳、氫、氧和氮等元素構(gòu)成，碳?xì)浔戎递^低，分子式為C14Hl2O9,10。溶解能力強(qiáng)，移動(dòng)性大，對(duì)某些土壤的淋溶和沉積起很大作用，可以改善土壤環(huán)境。特性為低分子量和高生物活性。由于低分子量的特性，它能很好的粘貼及融合礦物質(zhì)和元素到它的分子結(jié)構(gòu)中，擁有很好的溶解性和流動(dòng)性。胡敏酸（Humi

4、cAcid,HA）,由芳香核和脂肪族側(cè)鏈組成，含有竣基、羥基、酮基、釀基等活性官能團(tuán)，具有較大的吸附表面積，是存在于土壤環(huán)境中的一類重要的非均質(zhì)有機(jī)物。HA容易與有機(jī)污染物發(fā)生相互作用，影響環(huán)境中有機(jī)污染物的毒性、生物降解、遷移轉(zhuǎn)化。提取土壤中的HA對(duì)分析HA理化性質(zhì)和明確HA環(huán)境作用，具有重要的意義。研究表明，腐殖質(zhì)的主要元素有碳、氫、氧、氮、硫和磷。對(duì)于賦存于同一介質(zhì)中的腐殖酸，胡敏酸碳含量略高于富里酸，氧含量略低于富里酸，但元素組成沒(méi)有太大差別等15比較了NaOH丙酮、二氧雜環(huán)己烷等六種試劑提取效率表明，NaOH§液從。進(jìn)一步研究揭示腐殖質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)與元素組成，是人類認(rèn)識(shí)世界的

5、一部分。土壤的形成與有機(jī)質(zhì)腐殖化過(guò)程密切相關(guān)，巖石經(jīng)過(guò)物理化學(xué)風(fēng)化后，風(fēng)化殘積物中的Fe、Al元素的溶解遷移與沉淀固定受腐殖質(zhì)的控制。腐殖質(zhì)在土壤中可呈游離的酸和鹽類狀態(tài)存在，但大部分呈凝膠狀與礦質(zhì)粘粒緊密結(jié)合，成為重要的礦物一一膠體物質(zhì)，從而增加土壤團(tuán)粒的水穩(wěn)性和持水性。腐殖質(zhì)還可通過(guò)增加植物根部細(xì)胞膜的滲透性、激活土壤呼吸、促進(jìn)ATP的合成與三竣酸循環(huán)以及光和作用等途徑來(lái)增加作物的生產(chǎn)。腐殖質(zhì)能夠提高化肥的利用效率，同時(shí)減輕化肥對(duì)土壤理化性狀產(chǎn)生的不良影響120因此，腐殖質(zhì)的研究對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和土地利用非常重要。腐殖質(zhì)與疏水有機(jī)污染物（HOC的相互作用，能夠增加土壤中該類物質(zhì)的溶解性與遷移率，

6、從而增加地下水被污染的風(fēng)險(xiǎn)。分配系數(shù)（KOC液用來(lái)定量描述有機(jī)污染物在液相與固相時(shí)的分配行為。特定體系下某一污染物的分配系數(shù)大小與其正辛醇-水分配系數(shù)（KOWV和體系固相有機(jī)質(zhì)含量相關(guān)。雖然分配模型已經(jīng)成功的解釋了一系列有機(jī)污染物在水一土相的分配行為，但是很多污染物在不同來(lái)源的土壤樣品中分配系數(shù)存在顯著差異。這種差異可能是土壤有機(jī)質(zhì)不同和外在因素不同所致。Rutherford等13的研究發(fā)現(xiàn)對(duì)于官能團(tuán)含量不同的腐殖質(zhì)組分與有機(jī)污染物分配系數(shù)之間關(guān)系，值得做進(jìn)一步的研究。二、腐殖酸的提取與純化1.2. 1、腐殖酸的提取：由于缺少標(biāo)準(zhǔn)方法，在以往的研究中，土壤腐殖質(zhì)的提取方法各有不同，提取劑、提取

7、液劑量、提取次數(shù)的選擇各有特點(diǎn)，使得研究的數(shù)據(jù)可比性較低。為了使腐殖質(zhì)的研究數(shù)據(jù)更具可比性，國(guó)際腐殖質(zhì)協(xié)會(huì)提出了一個(gè)參考方法，其提取土壤胡敏酸、富里酸和胡敏素，具體操作可分為三步：前處理過(guò)程稱取100g土樣于2L燒杯中，加入配置好的1L0.05mol/L的HCl,在25C條件下間歇攪拌18-24h,然后離心過(guò)濾（轉(zhuǎn)速:5000rpm,10min）,除去上清液，將沉淀物用去離子水清洗，反復(fù)離心至中性或呈弱酸性。此步驟是為了去處土壤中易溶于酸的雜質(zhì)和Fe元素等，以減少對(duì)以后步驟的干擾。堿溶過(guò)程向土壤樣品中加入1L0.1mol/L的NaOHS液，在25c條件下持續(xù)攪拌24h。然后離心過(guò)濾（轉(zhuǎn)速:15

8、000rpm,15-20min）,這一過(guò)程至少進(jìn)行兩次，以保證沉淀物與上浮物完全分離。此時(shí)HA和FA均溶于堿液中。殘?jiān)饕獮椴蝗苡趬A的腐黑物等。酸析過(guò)程棄去殘?jiān)瑢⑺械纳锨逡菏占揭粋€(gè)潔凈的玻璃燒杯中。向燒杯中加入6mol/L的HCl直至pH為1-2,止匕時(shí)HA由于不溶于酸，成絮狀沉淀。FA溶解于酸液中。靜置幾小時(shí)后離心（5000甲m,10min）分離，即可得到黑色的固態(tài)HA和亮橙色的FA酸溶液。這個(gè)方法被廣大研究學(xué)者普遍采用，通常稱為“稀堿法”2、關(guān)于“稀堿”的選用研究：關(guān)于提堿性取劑NAOH勺選用，有學(xué)者做過(guò)不同提取劑的提取效果的研究。堿性提取劑有NaON口KOH絡(luò)合劑有堿性NaO和ED

9、TA有機(jī)提取劑有丙酮、二甲亞碉（DMAO等。其中利用NaOH提取土壤腐殖質(zhì)是最古老、常用而有效的方法。Na+能夠取代腐殖質(zhì)的負(fù)電點(diǎn)位上的多價(jià)離子（如CeTMg+、Fe3+、Al3+）,以及高pH值促使腐殖質(zhì)的很多酸性官能團(tuán)解離，從而大大改變腐殖質(zhì)的溶解狀態(tài)，同時(shí)多價(jià)金屬陽(yáng)離子與OH結(jié)合生成不溶氫氧化物沉淀而被除去14。Eloff*四種非洲細(xì)沙土中提取的腐殖質(zhì)含量是丙酮等有機(jī)試劑提取量的幾十倍，是EDTAW硼酸混合液提取量的兩倍多.通過(guò)凝膠色譜研究表明，NaO昭液提取的腐殖質(zhì)分子量最大，NaBQ提取物次之，偶極非質(zhì)子溶劑(DMSODMFacetone)提取的腐殖質(zhì)分子量最小，而且腐殖化程度較低。

10、有研究還對(duì)比了NaOHfKOH的提取效率16，采用KOHS液提取腐殖質(zhì)也能獲得較高的效率，可是KO侏源少，成本高，且離子半徑大，但其滲透能力較之低，因此在研究中運(yùn)用很少見(jiàn)。3、提取劑用量：在國(guó)際腐殖質(zhì)協(xié)會(huì)推出參考方法之前，采用NaOH§液浸提腐殖質(zhì)，其濃度沒(méi)有統(tǒng)一。2000年，Rosa等17的研究指出，不同堿液提取的腐殖質(zhì)量的大小順序?yàn)椋?.1mol/LNaO譯0.5mol/LNaOH1.0mol/LNaOH且經(jīng)過(guò)240min后，腐殖質(zhì)提取量已經(jīng)達(dá)到最大值。馬連剛、肖保華網(wǎng)使用同樣的方法進(jìn)行驗(yàn)證，得到不同的結(jié)果，其模擬實(shí)驗(yàn)結(jié)果為：等量堿液一次提取的有機(jī)質(zhì)量的大小順序?yàn)椋?.1mol/

11、LNaOH,0.5mol/LNaOH弋1.0mol/LNaOH,且0.1mol/LNaOH溶液與土壤作用240min后，泥水混溶，無(wú)分層現(xiàn)象，經(jīng)過(guò)24h靜置，才出現(xiàn)薄層上清液。這可能與土壤性質(zhì)有關(guān)，Rosa等所用泥炭土的有機(jī)質(zhì)含量高，而后者所用的黃壤是一種高度脫硅富鋁土，具有機(jī)質(zhì)含量較低(約4%5%),而鐵鋁含量高，在堿性條件下。能夠產(chǎn)生大量膠體分散于泥水混合體系中，有機(jī)無(wú)機(jī)膠體混合在一起難以分離。因此，從不同的土壤或沉積物中提取腐殖質(zhì)，NaOH的濃度還是一個(gè)必須考慮的因素。正如腐殖質(zhì)協(xié)會(huì)在中明中說(shuō)的那樣，0.1mol/LNaOH溶液并不適合所有研究對(duì)象。4、提取方法的優(yōu)化：盡管稀堿法被學(xué)者廣

12、泛使用，但是這種方法仍存在HAFA提取率低、提取費(fèi)時(shí)等缺點(diǎn)。因此，有學(xué)者對(duì)于提取方法進(jìn)行了一些優(yōu)化。Vanessa19提出了微波輔助提取HA的方法，但微波提取的溫度為105C會(huì)使HA某些性質(zhì)發(fā)生改變。Mauro20用超聲輔助提取HA指出超聲輔助提取的HA與IHSS推薦方法提取的HA理化性質(zhì)接近，但是Mauro沒(méi)有對(duì)提取的條件進(jìn)行優(yōu)化。王冕21等在提取土壤中HA時(shí)也是采用IHSS推薦方法，并發(fā)現(xiàn)HA提取量與土壤pH之間沒(méi)有線性關(guān)系，而與土壤的有機(jī)質(zhì)呈正比關(guān)系。譙華等22,對(duì)土壤中提取胡敏酸的方法進(jìn)行了優(yōu)化，引入超聲作為胡敏酸提取的輔助條件，采用批次試驗(yàn)優(yōu)化了土壤中胡敏酸的提取方法。結(jié)果表明，基于

13、胡敏酸提取回收率和精密度，在室溫下獲得的優(yōu)化提取方法為：液土比為8:1、提取次數(shù)為3次、NaOH容液濃度為0.05mol/L、超聲功率為120W超聲時(shí)間為30min；在此優(yōu)化條件下，胡敏酸的回收率為94.73%±1.50%,顯著大于IHSS推薦方法的回收率64.76%±0.28%5、腐殖質(zhì)的純化：首先先介紹HISS提供的方法：向HA的沉淀物中加入0.5LHF-HCI混合溶液（0.1MHCI+0.3MHF,HF-HCI混酸體系被認(rèn)為能顯著降低腐殖酸中硅雜質(zhì)），然后在25c下振蕩24h。然后在5000rpm下離心10min去除上清液。換液離心三次，從而使HA含有較少灰分殘留。將

14、滲析袋裝入陽(yáng)離子交換樹(shù)脂，在HA溶液中振蕩24h,達(dá)到去除HA中雜質(zhì)陽(yáng)離子的目的。然后離心，撇去上清液，得到純化后的HA樣品，經(jīng)真空冷凍干燥后得到粉狀產(chǎn)物，在-57C下低溫保存?zhèn)溆谩⒑蠪A的亮橙色溶液流經(jīng)填有XAD-8樹(shù)脂的吸附柱，使FA被吸附在樹(shù)脂上。柱內(nèi)徑1cm,下端填入少量脫脂棉，樹(shù)脂填充長(zhǎng)度以10-15cm為宜，設(shè)置流速為1.5-2ml/min,為達(dá)到完全吸附，可串聯(lián)多根吸附柱，待流出的消液呈淡黃色即可。然后用去離子水洗滌樹(shù)脂柱至流出液呈中性或弱酸性。再用0.IMNaOH溶液從樹(shù)脂中對(duì)FA進(jìn)行洗提，洗脫出的暗褐色物質(zhì)即為富里酸。然后將滲析袋裝入陽(yáng)離子交換樹(shù)脂在FA堿溶液中振蕩24h

15、。在經(jīng)過(guò)陽(yáng)離子交換之后，再將FA在45c下進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮。最后使用真空冷凍干燥，得到純化后的FA粉末，在-57C下低溫保存?zhèn)溆谩Ｔ诟乘崽崛∵^(guò)程中，粘土礦物可能以膠體形式混入，從而增加灰分含量，為了降低灰分含量，透析之前，常用混合酸（HCL/HF進(jìn)行處理，經(jīng)過(guò)兩次混合酸處理后，灰分含量可達(dá)到可接受水平23。由于干擾物質(zhì)的復(fù)雜性，至今還沒(méi)有一個(gè)可普遍接受的分析過(guò)程來(lái)純化腐殖酸。三、腐殖質(zhì)分組腐殖質(zhì)分組是在三種腐殖酸的提取基礎(chǔ)上，進(jìn)一步進(jìn)行細(xì)分，但是目前國(guó)內(nèi)研究學(xué)者對(duì)這一方面的研究還很少。純化去除了大量的雜質(zhì)，但是所獲得物質(zhì)本身的性質(zhì)差異還很大。就分子量而論，腐殖質(zhì)組分本身的差異是非常巨大的，水

16、體富里酸的平均分子量范圍在6002000,胡敏酸分子量稍大(15005000)24,源于土壤、沉積物的腐殖質(zhì)平均分子量較大，不均勻分布在幾百到幾十萬(wàn)之間。據(jù)腐殖質(zhì)分子量大小差異將腐殖質(zhì)做進(jìn)一步的劃分也非常有意義，分子量大小不同，其很多性質(zhì)，諸如溶解度、吸附特性及絡(luò)合能力等可能也不相同。因此，為了獲得比較均質(zhì)的腐殖質(zhì)組分，在排除無(wú)機(jī)離子與非腐殖質(zhì)類有機(jī)質(zhì)的干擾之外，還需要對(duì)腐殖質(zhì)進(jìn)行更細(xì)致的分組。目前，腐殖質(zhì)的分組分離并不意味著要得到純粹同質(zhì)的化合物，而是要獲得某些物理化學(xué)屬性取值比較狹窄的混合物25o腐殖質(zhì)進(jìn)一步分組的技術(shù)有沉淀、電泳、排阻色譜和超濾。但是一個(gè)獨(dú)特的、通用的分組方法仍然在探尋中

17、，由于其對(duì)于現(xiàn)在國(guó)內(nèi)普遍研究現(xiàn)狀沒(méi)有太大的實(shí)用意義，就不再做單獨(dú)介紹了。四、總結(jié)兩百多年來(lái)，經(jīng)過(guò)研究者的不懈努力，對(duì)腐殖質(zhì)有一定的了解，由于其本身的復(fù)雜性，研究仍然存在有很多問(wèn)題：腐殖質(zhì)是高分子混合物還是超分子體系，研究者至今還沒(méi)有統(tǒng)一的看法；腐殖質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)，盡管研究者提出各種各樣的理論模型，但如今仍然是一個(gè)謎；腐殖質(zhì)的提取方法難以統(tǒng)一，不同提取方法所獲得的物質(zhì)或多或少存在差異，使得研究數(shù)據(jù)可比性較低，據(jù)此得出的結(jié)論爭(zhēng)議性較大。要充分揭示腐殖質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)和化學(xué)屬性，關(guān)鍵在于如何對(duì)不同來(lái)源的腐殖質(zhì)進(jìn)行有效提取、純化與分組，使得研究對(duì)象盡量簡(jiǎn)單而均一。現(xiàn)有的土壤腐殖質(zhì)分離提純方法，基于腐殖質(zhì)溶解

18、特性的不同，只能將腐殖質(zhì)分為胡敏酸、富里酸及胡敏素三類。然而，這三類物質(zhì)本身并不是均質(zhì)的高分子化合物，而是成分復(fù)雜的有機(jī)混合物。盡管這一分類方法簡(jiǎn)化了腐殖質(zhì)的研究，但研究結(jié)果仍然是一個(gè)非常概括性的描述。要獲取更加精確的信息，需對(duì)三類物質(zhì)進(jìn)行再分組，特別是按照分子量對(duì)HAFA進(jìn)行再分組，獲得分子量分布范圍比較狹窄的亞組。目前，排阻色譜和超濾技術(shù)作為腐殖質(zhì)化學(xué)與物理分離的兩種代表性新技術(shù)，色譜分離測(cè)定精度高，而超濾具有操作簡(jiǎn)便、分離量大和對(duì)分離物質(zhì)無(wú)破壞等優(yōu)點(diǎn)，在腐殖質(zhì)研究中，兩者的結(jié)合將有助于深化理解土壤腐殖質(zhì)的化學(xué)性質(zhì)和分子結(jié)構(gòu)。隨著膜技術(shù)的不斷發(fā)展，可將分子進(jìn)一步的分離，最終將會(huì)獲得成分均一

19、的腐殖質(zhì)。參考文獻(xiàn)：1張晉京,竇森,李翠蘭.土壤腐殖質(zhì)分組研究J.土壤通報(bào),2004,12(6):706709.2QuallsRG,HainesBL.1991.Geochem-istryofdissolvedorganicnutrientsinwaterpercolatingthroughaforestecosystem.SoilSciSocAmJ,55:11121123.3趙勁松，張旭東，袁星，等.土壤溶解性有機(jī)質(zhì)的特性與環(huán)境意義J.應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào),2003,1(1):126130.4KiptonH,PowellJ,FentonE.Sizefractionationofhumicsubstan

20、ces:EffectprotonationandmetalbindingpropertiesJ.AnalyticaChimicaActa,1996,334:27-385 KoivulaN,H-nninenK.ConcentrationsofmonosaccharidesinhumicsubstancesintheearlystagesofhumificationJ.Chemosphere,2001,44:271-2796 NguyenKL,LewiskDM,JollyM,etal.Determinationofsolublealuminiumconcentrationinalkalinehum

21、icwaterusingatomicabsorptionspectrophotometryJ.WaterResearch,2004,38:4039-40447WuW乙XuY,ScharmmKW,etal.EffectofNaturalDissolvedHumicmaterialonbioavailabilityandacutetoxicityoffenpropathrintotheGrassCarp,CtenopharyngodonidellusJ.EcotoxiclogyandEnvironmentalSafety,1999,42:203-2068XingB.Sorptionofnaphth

22、aleneandphenanthrenebysoilhumicacidsJ.EnvironmentalPollution,2001,111:303-3099邊文驊.腐殖酸形成的生物學(xué)機(jī)理研究概況J.河北師范大學(xué)學(xué)報(bào)，2000,24:526530.10竇森.土壤有機(jī)質(zhì)M.北京：科學(xué)出版社，2010.11李學(xué)垣，土壤化學(xué)M.北京：高等教育出版社，2001,26.12牛育華，李仲謹(jǐn)，郝明德，余麗麗，朱雷.腐殖酸的研究進(jìn)展J.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008,36(6)13TherfordDW,ChiouCT,kileDe.Influenceofsoilorganic-mattercompositiononth

23、epartitionoforganic-compoundsJ.Environ.Sci.Tech.,1992.26(2):336-34014HayesMHB,SwiftRS,WardleRE,BrownJK.Humicmaterialsfromanorganicsoil-comparisonofextractantsandofpropertiesofextractsJ.Geoderma,1975,13(3):231-245.15EloffJN,PauliFW.ExtractionandelectrophoreticfractionationfsoilhumicsubstancesJ.Planta

24、ndSoil,1975,42(2):413-42216PiccoloA,MirabellaA.Molecular-weightdistributionofpeathumicsubstancesextractedwithdifferentinorganicandorganicsolutionsJ.ScienceoftheTotalenvironment,1987,62:39-46.17RosaAH,RochaJC,FurlanM.Humicsubstancesofpeat:StudyoftheparametersthatinfluenceontheprocessofalkalineextractionJ.QuimicaNova,2000,23(4):472-47618馬連剛；肖保華.土壤腐殖質(zhì)提取與分組綜述J礦物巖石地球化學(xué)通報(bào)，2011-10-10,4(30)19 VanessaR,AntonioM,PilarB.Applicationofmicrowaveen