1、1第四章第四章 固相析出分離固相析出分離第一節第一節 鹽析法鹽析法第二節第二節 有機溶劑沉淀法有機溶劑沉淀法第三節第三節 其他沉淀法其他沉淀法第四節第四節 結結 晶晶 法法2生物分離過程的一般流程生物分離過程的一般流程原料液原料液細胞分離細胞分離( (離心，過濾離心，過濾) )細胞胞內產物細胞胞內產物路線一路線一路線二路線二細胞破碎細胞破碎碎片分離碎片分離路線一路線一A A路線一路線一B B清液胞外產物清液胞外產物粗分離粗分離( (沉淀沉淀/ /超過濾超過濾/ /萃取萃取) )純化純化( (層析、離子交換、吸附層析、離子交換、吸附) )脫鹽脫鹽( (凝膠過濾、超濾凝膠過濾、超濾) )濃縮濃縮(

2、 (超濾超濾) )精制精制( (結晶、干燥結晶、干燥) )包含體包含體溶解溶解( (加鹽酸胍、脲加鹽酸胍、脲) )復性復性3 濃縮； 初步純化 ； 由液態變成固態。固相析出分離法概固相析出分離法概述述 改變溶液條件，使溶質以固體形式從溶液中析出的操作技術稱為固相析出分離法固相析出分離法。 固相析出分離法固相析出分離法： 析出物為晶體時稱為結晶法； 析出物為無定形固體稱為沉淀法。固相析出的目的：固相析出的目的：4固相固相析出法析出法結晶法結晶法其他其他沉淀法沉淀法鹽析法鹽析法有機溶劑有機溶劑 沉淀法沉淀法固相析出分離法的分類固相析出分離法的分類5第一節第一節 鹽析法鹽析法 優點優點：經濟、安全、

3、操作簡便、應用范圍廣：經濟、安全、操作簡便、應用范圍廣 缺點缺點：鹽析法分辨率不高：鹽析法分辨率不高6表面形成水膜（水化層）表面形成水膜（水化層） ；帶相同電荷。帶相同電荷。p蛋白質（酶）溶液穩定的原因：蛋白質（酶）溶液穩定的原因： 有水化層有水化層.pH Pi帶負電荷帶負電荷.穩定的膠體穩定的膠體+ 有水化層有水化層pHPi.帶正電荷帶正電荷.穩定的膠體穩定的膠體水化膜水化膜7 中性鹽的親水性大于蛋白質（酶）的分子的親水性，中性鹽的親水性大于蛋白質（酶）的分子的親水性，加入大量中性鹽后，加入大量中性鹽后，奪走了水分子，破壞了水化膜，暴奪走了水分子，破壞了水化膜，暴露出疏水區域露出疏水區域，同

4、時又，同時又中和了電荷，破壞了親水膠體中和了電荷，破壞了親水膠體，蛋白質分子即形成沉淀。蛋白質分子即形成沉淀。+去水膜的蛋白質去水膜的蛋白質去水膜的蛋白質去水膜的蛋白質蛋白質分子形成沉淀蛋白質分子形成沉淀p鹽析的原理鹽析的原理酸酸堿堿8+帶正電荷的蛋白質帶正電荷的蛋白質在等電點的蛋白質在等電點的蛋白質帶負電荷的蛋白質帶負電荷的蛋白質酸酸堿堿酸酸堿堿中性鹽破壞水膜中性鹽破壞水膜中性鹽破壞水膜+帶正電荷的蛋白質帶正電荷的蛋白質帶負電荷的蛋白質帶負電荷的蛋白質不穩定的蛋白質顆粒不穩定的蛋白質顆粒溶液中蛋白質聚沉溶液中蛋白質聚沉酸酸堿堿水化膜水化膜9p鹽析過程鹽析過程10p鹽溶作用鹽溶作用 分子在等電

5、點時，相互吸引，聚合沉淀，加入分子在等電點時，相互吸引，聚合沉淀，加入少量鹽離少量鹽離子子后破壞了這種吸引力，使分子分散，溶于水中后破壞了這種吸引力，使分子分散，溶于水中鹽溶11p鹽析作用鹽析作用蛋白質分子表面的疏水區域，聚集了許多水分子，鹽濃度高時，這些水分子被鹽抽出，暴露出的疏水區域相互結合疏水區域相互結合，沉淀。12圖1 碳氧血紅蛋白的溶解度與硫酸銨離子強度的關系圖13 第一類叫第一類叫KsKs分段鹽析法，分段鹽析法，在一定在一定PHPH和溫度下通過改變離和溫度下通過改變離子強度實現，（固定子強度實現，（固定pH, pH, 溫度，溫度，改變鹽濃度改變鹽濃度），），由于蛋由于蛋白質對離子強

6、度的變化非常敏感，易產生共沉淀現象，白質對離子強度的變化非常敏感，易產生共沉淀現象，用于早期的粗提液；用于早期的粗提液； 第二種叫第二種叫分段鹽析法，分段鹽析法，在一定離子強度下通過改變在一定離子強度下通過改變PHPH和溫度來實現，（固定離子強度，和溫度來實現，（固定離子強度，改變改變pHpH及溫度及溫度），），由由于溶質溶解度變化緩慢，且變化幅度小，因此分辨率更于溶質溶解度變化緩慢，且變化幅度小，因此分辨率更高，高，用于后期進一步分離純化和結晶。用于后期進一步分離純化和結晶。p 鹽析方法的類型（分級沉淀）鹽析方法的類型（分級沉淀）14蛋白質濃度對鹽析的影響蛋白質濃度對鹽析的影響高濃度蛋白溶液

7、可以節約鹽的用量；高濃度蛋白溶液可以節約鹽的用量；蛋白濃度過高，會發生嚴重共沉淀作用，影響分離效果；蛋白濃度過高，會發生嚴重共沉淀作用，影響分離效果；在低濃度蛋白質溶液中鹽析，所用的鹽量較多，共沉淀作用比較在低濃度蛋白質溶液中鹽析，所用的鹽量較多，共沉淀作用比較少，但回收率會降低；少，但回收率會降低；分步分離提純時，寧可選擇稀一些的蛋白質溶液，多加一點中性分步分離提純時，寧可選擇稀一些的蛋白質溶液，多加一點中性鹽，使共沉淀作用減至最低限度；鹽，使共沉淀作用減至最低限度；一般認為一般認為2.5%-3.0%2.5%-3.0%的蛋白質濃度比較適中。相當于的蛋白質濃度比較適中。相當于25 mg/mL2

8、5 mg/mL30mg/mL30mg/mL。p影響鹽析的因素影響鹽析的因素15對起始濃度為對起始濃度為 30g/L30g/L的的COMbCOMb溶液，溶液，大部分蛋白質在硫酸銨飽和度為大部分蛋白質在硫酸銨飽和度為 58-6558-65之間沉淀出來；之間沉淀出來；對稀釋對稀釋1010倍的倍的 COMbCOMb溶液，飽和度達到溶液，飽和度達到66%66%時才開始沉淀，而相應的沉淀范圍時才開始沉淀，而相應的沉淀范圍為為66-73%66-73%飽和度。飽和度。16l可用于蛋白質二次鹽析可用于蛋白質二次鹽析17pHpH和鹽濃度對鹽析的影響和鹽濃度對鹽析的影響 調節溶液的調節溶液的pHpH值，蛋白質值，蛋

9、白質的溶解度會隨的溶解度會隨pHpH的變化而的變化而變化；變化；調節溶液的鹽濃度，蛋白調節溶液的鹽濃度，蛋白質的溶解度會隨鹽濃度的質的溶解度會隨鹽濃度的變化而變化。變化而變化。18鹽析溫度的影響鹽析溫度的影響在低離子強度或純水中，蛋白質溶解度在低離子強度或純水中，蛋白質溶解度在一定范圍內隨溫度增加而增加。在一定范圍內隨溫度增加而增加。在高濃度下，蛋白質的溶解度隨溫度上在高濃度下，蛋白質的溶解度隨溫度上升而下降。升而下降。在一般情況下，蛋白質鹽析可在室溫下在一般情況下，蛋白質鹽析可在室溫下進行，對溫度比較敏感的酶要求在進行，對溫度比較敏感的酶要求在0-40-4進行。進行。19鹽析用鹽的選擇鹽析用

10、鹽的選擇鹽析中常用的鹽：硫酸銨、硫酸鈉、磷酸鉀、磷酸鈉鹽析中常用的鹽：硫酸銨、硫酸鈉、磷酸鉀、磷酸鈉硫酸銨是最常用的蛋白質鹽析沉淀劑硫酸銨是最常用的蛋白質鹽析沉淀劑20在相同離子強度下，鹽的種類對蛋白質溶解度的影響有一定差異；在相同離子強度下，鹽的種類對蛋白質溶解度的影響有一定差異；一般的規律為：半徑小的高價離子的鹽析作用較強，半徑大的低價離子作一般的規律為：半徑小的高價離子的鹽析作用較強，半徑大的低價離子作用較弱；用較弱；陰離子鹽析效果陰離子鹽析效果 ：檸檬酸檸檬酸POPO4 43- 3- SOSO4 42-2- CHCH3 3COOCOO- - ClCl- - NONO3 3- -SCNS

11、CN- -；陽離子鹽析效果：陽離子鹽析效果： NHNH4 4+ + K K+ +NaNa+ + 高價陽離子；高價陽離子；陰離子的影響大于陽離子；陰離子的影響大于陽離子；鹽析中常用的鹽：硫酸銨、硫酸鈉、磷酸鉀、磷酸鈉；鹽析中常用的鹽：硫酸銨、硫酸鈉、磷酸鉀、磷酸鈉；鹽的種類對蛋白質溶解度的影響鹽的種類對蛋白質溶解度的影響21 常用的中性鹽中最重要的是常用的中性鹽中最重要的是(NH4)2SO4 ，因為它與其他常用鹽類，因為它與其他常用鹽類相比有十分突出的優點：相比有十分突出的優點： 1) 1) 溶解度大：溶解度大：在低溫時仍有相當高的溶解度，由于酶和各種蛋白質通常是在低溫下穩定，因而鹽析操作也要求

12、在低溫下（0-4）進行。 2)2)分離效果好：分離效果好：有的提取液加入適量硫酸銨鹽析，一步就可以除去75的雜蛋白，純度提高了四倍。 3) 3) 不易引起變性。不易引起變性。有穩定酶與蛋白質結構的作用。有的酶或蛋白質用2-3mol/L濃度(NH4)2SO4保存可達數年之久。 4) 4) 價格便宜；價格便宜； 5)5)廢液不污染環境。廢液不污染環境。硫酸銨是最常用的蛋白質鹽析沉淀劑硫酸銨是最常用的蛋白質鹽析沉淀劑22硫酸銨的加入方法：硫酸銨的加入方法：1 1）加入固體鹽法）加入固體鹽法 用于要求飽和度較高而不增大溶液體積的情況；用于要求飽和度較高而不增大溶液體積的情況；加入速度不能太快，應分批加

13、入，并充分攪拌，使其完全溶解和防加入速度不能太快，應分批加入，并充分攪拌，使其完全溶解和防止局部濃度過高；止局部濃度過高；2 2）加入飽和溶液法）加入飽和溶液法 用于要求飽和度不高而原來溶液體積不大的用于要求飽和度不高而原來溶液體積不大的情況；情況；它可防止局部過濃，但加量較多時，料液會被稀釋。它可防止局部過濃，但加量較多時，料液會被稀釋。3 3）透析平衡法）透析平衡法 先將鹽析的樣品裝于透析袋中，然后浸入飽和硫酸先將鹽析的樣品裝于透析袋中，然后浸入飽和硫酸銨中進行透析，袋內飽和度逐漸提高，達到設定濃度后，目的蛋白銨中進行透析，袋內飽和度逐漸提高，達到設定濃度后，目的蛋白析出。該法優點在于硫酸

14、銨濃度變化有連續性，鹽析效果好，但程析出。該法優點在于硫酸銨濃度變化有連續性，鹽析效果好，但程序煩瑣，故多用于結晶。序煩瑣，故多用于結晶。23硫酸銨終濃度硫酸銨終濃度,%飽和度飽和度606570758090100每每1L溶液加固體硫酸銨的質量溶液加固體硫酸銨的質量(g)硫硫酸酸銨銨初初濃濃度度，%飽飽和和度度0390430472516561662767103263654064494945926942026230034038242452061925230267307348390485583301982352733143564495463317721425229233342652235164200

15、238178319411506401321682052452853754694599134171210250339431調整硫酸銨溶液飽和度計算表（調整硫酸銨溶液飽和度計算表（25）24操作注意事項操作注意事項(1)加固體硫酸銨時，必須注意表中的溫度。加固體硫酸銨時，必須注意表中的溫度。(2)分段鹽析時，要考慮到每次分段后蛋分段鹽析時，要考慮到每次分段后蛋白質濃度的變化。白質濃度的變化。(3) 鹽析條件如鹽析條件如pH、溫度和硫酸銨的純度、溫度和硫酸銨的純度都必須嚴格控制。都必須嚴格控制。(5) 鹽析過程中，攪拌必須規則和溫和。鹽析過程中，攪拌必須規則和溫和。(6) 反應至少應在反應至少應在5

16、0mmol/L緩沖溶液中進行。緩沖溶液中進行。(4) 鹽析后一般要放置鹽析后一般要放置0.51h。25鹽析法結晶肌紅蛋白26分步鹽析法: 生產上有時先以較低的鹽濃度除去部分雜蛋白，再提高飽和度沉淀目的物。血清血清球蛋白球蛋白清蛋白清蛋白(NH(NH4 4) )2 2SOSO4 450%50%飽和度飽和度飽和飽和析出析出析出析出27反抽提法,共沉淀較低濃度鹽溶液溶雜蛋白大腸桿菌RNA聚合酶的制備28硫酸銨鹽析方法的優點硫酸銨鹽析方法的優點經濟；不需特殊設備；操作簡便；安全；應用范圍廣；較少引起變性（有時對生物分子具有穩定作用）29水解變酸；水解變酸；高高pH pH 釋氨，腐蝕；釋氨，腐蝕；殘留產

17、品有影響。殘留產品有影響。硫酸銨鹽析法的缺點：硫酸銨鹽析法的缺點：30脫鹽的方法脫鹽的方法3132 有機溶劑沉淀法即向水溶液中加入一定量親水性的有機溶劑，降低溶質的溶解度，使其沉淀析出的分離純化方法。第二節第二節 有機溶劑沉淀法有機溶劑沉淀法有機溶劑沉淀的基本原理有機溶劑沉淀的基本原理n有機溶劑能降低水溶液的介電常數；n有機溶劑能破壞蛋白質表面的水膜。 33l親水性有機溶劑加入溶液親水性有機溶劑加入溶液后降低了介質的介電常數，后降低了介質的介電常數，使溶質分子之間的靜電引使溶質分子之間的靜電引力增加。力增加。l水溶性有機溶劑本身的水水溶性有機溶劑本身的水合作用降低了自由水的濃合作用降低了自由水

18、的濃度，壓縮了溶質分子表面度，壓縮了溶質分子表面原有水化層的厚度，導致原有水化層的厚度，導致溶質分子脫水凝聚。溶質分子脫水凝聚。原理34有機溶劑沉淀有機溶劑沉淀35 缺點缺點：有機溶劑沉淀法易使蛋白質等生有機溶劑沉淀法易使蛋白質等生物大分子變性，操作需在低溫下進行；物大分子變性，操作需在低溫下進行；需要耗用大量有機溶劑，成本較高；需要耗用大量有機溶劑，成本較高；有有機溶劑一般易燃易爆，所以貯存比較困難機溶劑一般易燃易爆，所以貯存比較困難或麻煩。或麻煩。有機溶劑沉淀法的特點：有機溶劑沉淀法的特點： 優點優點：分辨能力比鹽析法高。分辨能力比鹽析法高。有機有機溶劑沸點低，易揮發除去，不會殘留于溶劑沸

19、點低，易揮發除去，不會殘留于成品中，產品更純凈，沉淀物與母液間成品中，產品更純凈，沉淀物與母液間的密度差較大，分離容易。的密度差較大，分離容易。36二、操作條件的控制二、操作條件的控制 1 1、溶劑選擇、溶劑選擇 常用的溶劑是乙醇、丙酮、甲醇，其他溶劑如二甲基甲酰胺、二甲基亞砜也可做沉淀劑。 沉淀用有機溶劑的選擇主要應考慮沉淀作用強、對生物分子的變性作用小、毒性小以及揮發性適中。 2 2、溫度、溫度 在使用有機溶劑沉淀生物高分子時務必控制在低溫下進行。373 3、溶液酸堿度的控制、溶液酸堿度的控制 控制溶液pH時務必使溶液中大多數蛋白質分帶有相同電荷;而不要讓目的物與主要雜質分子帶相同電荷，以

20、致出現共沉作用。4 4、離子強度的控制、離子強度的控制 用溶劑沉淀蛋白質時離子強度多控制在0.01-0.05mol/L較好，通常不應超過5%的含量。 常用的助沉劑多為低濃度的單價鹽，有醋酸鈉、醋酸銨和氯化鈉等。385 5、樣品濃度的控制、樣品濃度的控制 一般認為蛋白質的初始濃度為0.5%-2%為好，粘多糖則以1%-2%較合適。6 6、某些金屬離子的助沉淀作用、某些金屬離子的助沉淀作用 實際操作時往往先加溶媒沉淀除去雜蛋白，再加Zn2+沉淀目的物。39兩性電解質在溶液pH處于等電點pI時，分子表面凈電荷為零，使兩性溶質溶解度下降，析出沉淀。1、等電點沉淀法、等電點沉淀法第三節第三節 其他沉淀法其

21、他沉淀法402、選擇性變性沉淀法、選擇性變性沉淀法利用表面活性劑或有機溶劑引起變性；利用對熱的穩定性不同，加熱破壞某些組分 而保留另一些組分；選擇性的酸堿變性。41 不同分子量的聚乙二醇（PEG）應用較多的是相對分子質量6000-20 000的PEG ； 聚乙烯吡咯烷酮和葡聚糖等。 3、有機聚合物沉淀法、有機聚合物沉淀法 常用的有機多聚物：常用的有機多聚物：42金屬復合鹽金屬復合鹽 所用的金屬離子，包括Fe2+、Ba2+、Mg2+、 Hg2+、Ag2+等；蛋白質和酶分子中因為含有羥基、氨基、咪唑基和硫氫基等，均可以和上述金屬離子作用形成鹽復合物有機酸類復合鹽有機酸類復合鹽 含氮有機酸如苦味酸、

22、苦桐酸和鞣酸等能夠與有機分子的堿性功能團形成復合物而沉淀析出。 4、生成鹽類復合物的沉淀、生成鹽類復合物的沉淀43CTAB（十六烷基三甲基季胺溴化物）；CPC(十六烷基氯化吡啶)；SDS（十二烷基磺酸鈉）等。5、離子型表面活性、離子型表面活性6、離子型多聚物沉淀、離子型多聚物沉淀是一類溫和的沉淀劑，常用的有核酸（多聚陰離子）可作 用于堿性蛋白；魚精蛋白（多聚陽離子）則作用于酸性蛋白質。44第四節第四節 結結 晶晶 法法454647484950 過飽和溶液的形成過飽和溶液的形成蒸發法蒸發法冷卻法冷卻法化學反應結晶法化學反應結晶法鹽析結晶法鹽析結晶法等電點法等電點法復合法復合法制備制備 結晶的首要

23、條件是溶液的過飽和。結晶的首要條件是溶液的過飽和。51 1. 1.蒸發法蒸發法 借蒸發出去部分溶劑的結晶方法。使溶液在借蒸發出去部分溶劑的結晶方法。使溶液在加壓、常壓或減壓下加壓、常壓或減壓下加熱，加熱，蒸發除去一部分溶蒸發除去一部分溶劑，以達到或維持溶液過飽和度。劑，以達到或維持溶液過飽和度。 適于溶解度隨溫度變化不顯著的物質或隨溫適于溶解度隨溫度變化不顯著的物質或隨溫度升高溶解度降低的物質。度升高溶解度降低的物質。52 2. 2.冷卻法冷卻法 基本上不除去溶劑，而是使溶液基本上不除去溶劑，而是使溶液冷卻降溫冷卻降溫成為成為過飽和溶液。過飽和溶液。 此法適于溶解度隨溫度降低而顯著減小的物質此

24、法適于溶解度隨溫度降低而顯著減小的物質 3. 3.化學反應結晶法化學反應結晶法 向溶液中加入反應劑，生成一個向溶液中加入反應劑，生成一個新的溶解度更新的溶解度更低的物質，低的物質，當濃度超過它的溶解度時就有結晶析當濃度超過它的溶解度時就有結晶析出。出。 如：在抗生素的溶液中加入成鹽劑（酸、堿或如：在抗生素的溶液中加入成鹽劑（酸、堿或鹽類），使抗生素以鹽類），使抗生素以鹽的形式鹽的形式結晶析出。結晶析出。 NaOHNaOH, CH, CH3 3COOKCOOK53 4. 4.解析法解析法 向溶液中加入某些物質，使溶質的溶解度降低，向溶液中加入某些物質，使溶質的溶解度降低，形成過飽和溶液而結晶析出

25、。形成過飽和溶液而結晶析出。 抗溶劑或沉淀劑：固體、液體、氣體抗溶劑或沉淀劑：固體、液體、氣體 抗溶劑的特點：極易溶解在原溶液的溶劑中抗溶劑的特點：極易溶解在原溶液的溶劑中 鹽析結晶法：用鹽析結晶法：用固體氯化鈉固體氯化鈉作為抗溶劑使溶液作為抗溶劑使溶液 中的溶質盡可能的結晶出來中的溶質盡可能的結晶出來有機溶劑結晶法：向水溶液中加入一定量的有機溶劑結晶法：向水溶液中加入一定量的親水親水 性的有機溶劑性的有機溶劑，降低溶質的溶解，降低溶質的溶解 度，使其結晶析出度，使其結晶析出水析結晶法：易溶于有機溶劑的物質，向其溶液水析結晶法：易溶于有機溶劑的物質，向其溶液 中加入適量中加入適量水水即可析出晶體即可析出晶體54 5. 5.等電點法等電點法 利用某些生物物質具有利用某些生物物質具有兩性化合物性質兩性化合物性質當溶當溶液液pHpH值調至等電點時溶