1、-論文發表專家-中國掌木期刊網.qikanwangPnel斑點叉尾天然單鏈（ScFv）噬菌體抗體庫的構建及初步鑒定摘要：以健康未經免疫的斑點叉尾為試驗材料，取其新鮮外周血，分離淋巴細胞，提取總rna,逆轉錄合成cdna。per擴增重鏈fd和輕鏈cdna,以純化的vh、v1基因為模板,以與vh基因3'端和v1基因一5'端序列互補的linker-primermix為引物，將vh、v1隨機拼接為scfv。通過酶切連接，依次將pcr產物插入質粒p3mh相應位點，熱激法轉化大腸桿菌x11-b1ue,加入輔助噬菌體vcsm13,構建噬菌體單鏈抗體庫。測定庫容并酶切鑒定。斑點叉尾天然單鏈（s

2、cfV）噬菌體抗體庫成功構建為進一步篩選特異性抗體及從斑點叉尾病變組織中提取特異性抗原用于免疫治療奠定了基礎。關鍵詞：斑點叉尾；抗體庫；噬菌體展示；抗體單鏈（scfconstructionandpreliminaryidentificationof,ietaluruspunetaussingle-chainantibolylibraryofnaturalphageinchannelcatfishwanghui1,zoushi-ping2(1.collegeoffisheries,huazhongagriculturaluniversity,wuhan430070,china;2.yangtze

3、riverfisheriesreserchinstitute,chineseacademyoffisherysciences,wuhan430223,china)-論文發表專家-：£0,：中國掌木期刊網.qikanwangPnelabstract:peripheralblood1mphocyteswereisolatedfrom250mlblood,whichwasobtainedfrom50nonimmunnizedhealthychannelcatfishthroughtheirvenacaudalis.theheavychainfdandlightchaincdnasynthe

4、sizedfromthetotalrnaoflymphocyteswereperamplifiedandtheamplificationproductswerecompactedby1inkerprimermixintosefv.thentheamplificationproductswereligatedsuecessivelyintothephagemidvectorp3mh,thentheligatedsampiewastransformedintocompetente.colixllblue.thetransformedcellswereinfectedwithvesm13helper

5、phagetoyieldrecombinantphagescfvantibody.thesuccessfulconstructionofnaivechannelcatfishphag-論文發表專家-eantibody：£0,：中國掌木期刊網.qikanwangPnellibrarycreatedfavourableconditionsforselectingspecificphageantibodyandabstractingspecificantigen.keywords:ictaluruspunctatusrafinesque;antibodylibrary;bacterialp

6、hage;scfv斑點叉尾(ictaluruspunctatusrafinesque)亦稱溝(channelcatfish),屬于魚念形目(siluriformes)科(ieta1uridae)魚類。主要分布于美國中部、加拿大南部和大西洋沿岸的部分地區。斑點叉尾是水產養殖業中最為重要的養殖魚種之一，自20世紀80年代引進我國以來養殖規模不斷擴大，出口量也在逐年上升。但是由于斑點叉尾種質資源退化嚴重，養殖技術較低，養殖環境惡化等原因，導致人工養殖的斑點叉尾病害頻發，給養殖業帶來巨大損失。斑點叉尾疾病防治應當堅持“預防為主,防重于治”的原則。噬菌體抗體是指采用基因克隆技術將b細胞全套可變區基因克隆

7、出來，通過與噬菌體衣殼蛋白基因連接，以融合蛋白的形式表達在噬菌體表面的抗體分子。用b淋巴細胞全套抗體可變區基因克隆并組裝成的噬菌體群體稱為噬菌體抗體庫1。該技術克服了單克隆抗體雜交瘤細胞中抗體不穩定、容易丟失的弊端，直接利用抗-論文發表專家-中國掌木期刊網.qikanwangPnel原從抗體庫中篩選特異性抗體2-4。本實驗室采用未經免疫的健康斑點叉尾外周血單個核細胞（pbme）為基因來源，建立斑點叉尾天然單鏈（scfV）噬菌體抗體庫。構建的主要目的是為后期篩選抗原特異性抗體打下基礎，篩選出的抗體主要用于斑點叉尾疾病早期的抗體診斷試劑盒，從而更有效地對斑點叉尾疾病進行防治。1材料與方法1.1材料

8、淋巴細胞分離液購自上海超研生物科技有限公司；rna提取純化試劑Jtrizol（bioflux）、逆轉錄試劑盒、taqdna聚合酶、dntp購自takara公司；t4dna連接酶購自promega公司；限制性內切酶spei、xhoi、saci、xbai、pmdl8tsimplevector載體及試驗所用培養基均購自北京盈信陽光生物技術有限公司；dna凝膠回收試劑盒，質粒純化試劑盒均購自鼎國生物公司。宿主菌x11b1ue,由本實驗室保存；輔助噬菌體vcsm13,來自武漢生物制品研究所；載體p3mh,由海軍總醫院王琰教授惠贈，由本實驗室保存。引物序列：pl(vhfor):5'cggagctc

9、acaccagggggaaatcgtc-3-論文發表專家-gaaacagtcac：£0,：中國掌木期刊網.qikanwangPnelagagactggcgagctctctgctagagacaccaccttgttcctcp5(vhftggggcggaggcggaggtetctctcactgacor1inkegggaccggtteaggctctcca3'3rv1bacgtcaccggcggaggctegk):5'gtcggtggtggcattgag1）淋巴細胞的提取和純化。通過尾靜脈從未經免疫的多條斑點叉尾抽取外周靜脈血共250ml,常規方法分離pbmc。洗滌計數后，每1

10、07個細胞加1mltrizo1提取總rna,經異丙醇沉淀，75%乙醇洗滌后溶于1g/1depc水中，取適量做瓊脂糖凝膠電泳，鑒定rna質量，并用紫外分光光度計測定rna濃度，其余保存于70-論文發表專家-：£0,：中國掌木期刊網.qikanwangPnel2）逆轉錄cdna和pcr擴增vh段及v1鏈基因。以o1igodt20為引物，按照takara產品說明書，將rna逆轉錄為cdna。分別用輕鏈v1,重鏈vh引物（pl、p2、p3、p5）進行pcr擴增。95C預變性5min;94c30s,64C（不同引物組合退火溫度不同，波動于55-65C之間）30s,72c50s,3035個循環；

11、72C延伸10min。3）以純化的vh、v1基因為模板，以與vh基因3'端和vl基因5'端序列互補的p5為引物，進行重疊延伸反應，4抹120mmol/1的mgcl2,5110Xmmol/ldntp,0.5plbsa（10mg/ml）,2plcdna,28.5pl去離子水，總體積50pl,反應條件為94C1min,63C4min,共7個循環，將vh、v1隨機拼接為單鏈（scfv）。4）單鏈（scfv）pcr產物經過電泳，回收，純化，連接t載體，然后轉化x11blue,提取質粒后，經saci和xbai雙酶切，1%瓊脂糖凝膠電泳回收目的條帶。將表達載體p3mh用同樣的兩個酶進行酶切，

12、用1%瓊脂糖凝膠電泳回收目的條帶，再與已經回收的輕鏈片斷進行連接反應（pcr產物0.45pg,線性載體1.4wg）,4C連接過夜。次日加入200w1超級感受態x11b1ue,進行熱激轉化（冰浴30min,42C熱激90s,冰浴12min）。轉化反應結-論文發表專家-束后立即加入800pg預熱到37：£0,：中國掌木期刊網.qikanwangPnelC的soc培養基，37C,200r/min振蕩1h。加入10mlsoc培amp）。取部養基（含50mg/1tet和25mg/1分菌液鋪1b-amp瓊脂平板，計算庫容5）上述菌液加入socamp培養液振蕩1h后，加入輔助噬菌體vcsm13約1

13、012pfu,混勻后加入50mlsob培養基，繼續振蕩培養2h,之后加入kana至70mg/1,37C振蕩過夜。次日4C,4000r/min離心15min,得到上清液，加入聚乙二醇8000及nac1使兩者的終濃度為40g/1和30g/1。振蕩促溶，冰浴30min,9000r/min離心20min,4C。棄上清液，用2ml10g/1bsapbs懸浮噬菌體沉淀，14000r/min離心5min,除去殘留的細菌碎片。收集上清液，加入nan3至0.2g/1,4C保存。至此，用dna重組的方法，將單鏈基因（scfv）組合到了噬粒載體，即為scfv噬菌體表面呈現文庫。6 ）將適量ovasmp、ovasmz

14、分別溶解于0.1mo1/1ph9.6的碳酸鹽緩沖液中，包被無菌e1isa板，100ii1/孔，置于無菌小濕盒4C過夜。次日用pbst洗板3次后用5%bsapbs37C封閉2h,棄封閉液，同上洗滌，干燥備用。7 ）取等體積1%ova-pbs與庫菌液混合，37C孵育-論文發表專家-：£0,：中國掌木期刊網.qikanwangPnel30min。取包被孔2孔，加入上述混合液1001/孔,37C孵育2h;同時接種10111大腸桿菌x11b1ue于10ml1b中，37C220r/min振蕩培養至對數生長期。棄去孔中的液體，用150w1/孔pbst(0.1%tween-20)洗滌，過程中用移液器

15、反復吹打，重復洗滌5次，每次5min。然后加入1001孔甘氨酸鹽酸洗脫液(ph2.2),37C孵育30min,再加入71/孔2mo1/1tris中和，之后將液體轉移到10m1無菌離心管中，加入2m1新鮮制備的大腸桿菌x11-b1ue,37C孵育30min,分別取10pl、lpl、0.1p1涂1bat平板(amp50p1/m1,tet101/m1),37C培養過夜，計數菌落數，測定轉化率。其余菌液全部轉入10ml1b培養液(tet10pg/ml)中，加入5plamp,37c振蕩培養1h,再加入5plamp,繼續振蕩培養1h,然后再轉入100ml1b培養液(amp5010pg/ml)中繼續培養2h

16、,加入約1012pfu輔助噬菌體vcsm13,37C繼續培養2h,再加入卡那霉素終濃度至70g/ml,37C180r/min振蕩培養過夜。4c,4000r/min離心15min,收集上清液，加入4gpeg8000和3gnac1,37C搖床促溶5min后冰浴30min,4C8000r/min離心30min,棄上清液，倒置-論文發表專家-離心管10min瀝干殘液，加入3：£0,：中國掌木期刊網.qikanwangPnelml含l%bsa的tbs重懸沉淀，4C12000r/min離心5min,收集上清液即為次級SCfV噬菌體抗體庫。每一輪篩選后均測定次級庫的滴度并計算噬菌體投入/產出比（回

17、收率），作為特異性噬菌體抗體富集的指標。8）單克隆噬菌體抗體的制備。將獲得的單個噬菌體克隆轉染新鮮制備的大腸桿菌xllblue,鋪1b平板（amp50pg/ml,tet10pg/ml）,37C培養過夜。挑取30個單菌落，分別接種到2ml1b培養基中（amp50g/ml,tet10pg/ml）,37C振蕩培養至對數生長期，加入5011vcsm13,37C振蕩培養2h,之后加入卡那霉素至終濃度70wg/m1,30C振蕩培養過夜。4C,12000r/min離心10min,收集上清液即為單抗。9）噬菌體單抗的e1isa鑒定。用e1isa法進行抗體特異性結合性能的鑒定：分別用ovasmp、ovasmz包

18、被酶標板，3%bsa-pbs封閉，之后將上步中單抗用1%bsa-pbs稀釋1倍加入到酶標板中37C孵育2h,同時設空白、vcsml3、ova做陰性對照。2結果2.1 總rna提取由圖1可見，甲醛變性電泳顯示rna條帶清晰，28s、18-論文發表專家-：£0,：中國掌木期刊網.qikanwangPnels亮度之比約為2：1,并且可以見到微弱的5s條帶（圖1）。測定a值1.8,說明rna無降解，無蛋白污染，可以作為模板進行逆轉錄。2.2逆轉錄生成cdnacdna第一i鏈電泳顯本cdna為從2502500bp彌漫性分布的條帶。用設計的18s引物做內參，擴增后可見明顯18s條帶，證明cdna

19、性質良好。2.4pcr擴增重鏈vh段和輕鏈v1段擴增的重鏈vh段和輕鏈v1段產物經過1%瓊脂糖凝膠電泳，在650bp左右可見較亮特異性條帶。2.5通過1inker連接重鏈vh段和輕鏈v1段成單鏈（scfv）基因連接重鏈vh段和輕鏈v1段成單鏈（scfv）段產物經過1%瓊脂糖凝膠電泳，在1400bp左右可見較亮特異性條帶。2.6單鏈（scfv）噬菌體抗體的構建及鑒定切下1400bp左右條帶回收后連接t載體，將kt鏈、入一t鏈合并與p3mh分別用saci和xbai雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳可見約1400bp和4000bp大小的單一條帶，為所需的載體和目的片段。回收后將二者連接，電轉化，搖-論文發表專家

20、-：£0,：中國掌木期刊網.qikanwangPnel菌擴增，提取質粒dna,用saci和xbai雙酶切后電泳,顯示出約4000bp和約1400bp的兩條帶，說明單鏈（scfv）庫構建成功。所獲得的輕連庫的庫容為5.1X107o對隨機挑選的20個單菌落進行菌液pcr,其中18個可以擴增出輕鏈片段，說明重組率為90%。2.7噬菌體抗體庫的構建及鑒定經過提取抗體庫質粒dna,分別用xhoi和spei,saci和xbai雙酶切后電泳，顯示4100bp和1400bp左右條帶；用xhoi單酶切，顯示約5500bp大片段。以噬菌體抗體庫噬粒dna為模板，以單鏈（scfv）引物組合進行pcr,擴增

21、出約1400bp的插入片段，說明構建抗體庫成功。抗體庫進行了4次構建，按照蘭風華等5的方法計算庫容分別為1.63X107、1.11X107、1.42X107、1.51X107,積累在一起總庫容為5.67X107,單鏈（scfv）庫的重組效率達到90%。2.8抗體的篩選分別用ovasmp、ovasmz為固相抗原對噬菌體抗體庫進行5輪富集篩選。從表1、表2中可以看出，隨著篩選輪數的增多，雖然抗原包被量在不斷減少，洗脫次數不斷增加，抗體的投入產出比仍不斷升高，說明噬菌體抗體得到明顯富集。2.7噬菌體抗體的e1isa檢測-論文發表專家-：£0,：中國掌木期刊網.qikanwangPnel挑取

22、單個克隆，小規模制備抗體后，ovasmp、ovasmz作為包被抗原，設空白、vcsml3、ova做陰性對照,對60個樣進行平行檢測，結果得到smp陽性菌株11個，smz陽性菌株9個，其余均為陰性。3討論斑點叉尾是水產養殖中的重要經濟魚種，在其原產地美國的養殖規模達到水產養殖的60%以上。引進我國以來，養殖規模日益擴大，出口量也不斷增加。此次試驗我們選擇斑點叉尾作為建庫對象，不僅是因為它在水產養殖業中的重要地位，還在于它是硬骨魚類免疫系統研究較為透徹的模式動物之一。作為硬骨魚類的代表性魚種，斑點叉尾的優勢在于，目前已經積累了大量關于斑點叉尾免疫球蛋白結構和功能方面的生物學信息；已經建立起體外細胞

23、培養體系，可以利用此體系做抗原遞呈，細胞融合及溫度對免疫系統影響方面的試驗；已經建立起特定類型的無性白細胞系包括b細胞、巨噬細胞、t細胞及nk細胞等6。選擇未經免疫的斑點叉尾,分離外周血淋巴細胞，提取總rna,模擬具體內天然的抗體譜，構建大庫容噬菌體抗體文庫，為進一步篩選特異性抗體打下基礎。噬菌體抗體庫技術誕生以來，已經取得了巨大的成果，顯示它的強大生命力。它不僅能夠生產具有識別功能的特異性抗體，而且能夠篩選和生產具有催化和切割功能的抗體酶，解決了雜交瘤系統低效及鼠單抗的動物源性難題，對于腫瘤、自身免疫性疾病和感染性-論文發表專家-：£0,：中國掌木期刊網.qikanwangPnel

24、疾病發病機理的研究、診斷、被動免疫和治療有極為重要的試驗價值。目前認為抗體引物的多樣性與細菌轉化率是影響抗體庫容量的主要因素，而庫容的大小與抗體親和力大小成正比。為了獲得親和力高的抗體，本試驗從50尾健康未經免疫的斑點叉尾外周血中分離出淋巴細胞抽提總rna,經15對特異性引物rt-pcr擴增出scfv抗體基因片段，制備超級感受態進行轉化，經過四次轉化構建的庫容為5.67X107。如果要得到接近體內b淋巴細胞群數量（約108）的抗體庫，必須通過增加轉化次數來累積庫容。據相關文獻報道lobb等8通過上百次的電穿孔轉化獲得了1010的抗體庫，接近體內經過人工免疫達到的抗體水平。接近體內經過人工免疫達到的抗體水平。在從自建的斑點叉尾天然單鏈（scfv）噬菌體抗體庫中篩選得到抗磺胺類藥物的魚源單抗。試驗中利用偶聯卵血清蛋白的兩種磺胺類藥物包被固相，對自建的斑點叉尾天然單鏈（scfV）噬菌體抗體庫進行篩選，在篩選過程中，抗原濃度呈半數遞減，洗脫次數逐漸增加，以減少親和力弱的抗體的結合。經過5輪的富集淘選，我們得到多株特異性良好的抗體，并證明了所構建的噬菌體抗體庫具有良好的多樣性。噬菌體抗體庫技術的引入使針對性魚源單抗的制備成為