1、實驗一、PCR技術(shù)及應(yīng)用實驗原理 多聚酶鏈反應(yīng)（多聚酶鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù)的原理類似于）技術(shù)的原理類似于DNA的天然復(fù)制過程。可簡述為：的天然復(fù)制過程?？珊喪鰹椋?在微量離心管中加入適量緩沖液，加入微在微量離心管中加入適量緩沖液，加入微量模板量模板DNA，四種脫氧核苷酸（，四種脫氧核苷酸（dNTP），），和耐熱和耐熱Taq聚合酶及兩個合成的聚合酶及兩個合成的DNA引物，引物，并有并有Mg2+存在。存在。實驗原理加熱使模板DNA在高溫下（94）變性，雙鏈解鏈，這是所謂變性階段。降低溶液溫度，使合成引物在低溫（56）與模板DNA互補退火形成部分雙鏈，這是所謂退火階段。溶液反應(yīng)溫度升至中溫（72），

2、在Taq酶作用下，以四種dNTP為原料，引物為復(fù)制起點，模板DNA的一條雙鏈在解鏈和退火之后延伸為兩條雙鏈，這是延伸階段。如此反復(fù)，在同一反應(yīng)體系中可重復(fù)高溫變性、低溫復(fù)性和DNA合成這一循環(huán)，使產(chǎn)物DNA重復(fù)合成，并且在重復(fù)過程中，前一循環(huán)的產(chǎn)物DNA可作為后一循環(huán)的模板DNA而參與DNA的合成，使產(chǎn)物DNA的量按2n方式擴增。經(jīng)過2535個循環(huán)，DNA擴增倍數(shù)可達106109。實驗原理 實驗?zāi)康?本實驗以食蟹猴人芽囊蟲蟲本實驗以食蟹猴人芽囊蟲蟲DNA為模板，設(shè)計引物，擴增出為模板，設(shè)計引物，擴增出1100 bp的的擴增產(chǎn)物。學(xué)習(xí)并掌握擴增產(chǎn)物。學(xué)習(xí)并掌握PCR 反應(yīng)的基反應(yīng)的基本原理與實驗

3、技術(shù)。本原理與實驗技術(shù)。器材和試劑器材 PCR擴增儀，旋渦振蕩器，臺式離心機，擴增儀，旋渦振蕩器，臺式離心機，加樣槍及槍頭等加樣槍及槍頭等器材與試劑器材與試劑試劑： 1、藍色帽管：天根、藍色帽管：天根2Taq MasterMix(內(nèi)含內(nèi)含Taq DNA 聚合酶、聚合酶、 dNTP 、Mg和上樣和上樣buffer等）等） 2、白色管：引物、白色管：引物 1 引物引物 2 3、白色管：無菌、白色管：無菌ddH2O 4、模板、模板DNA：人芽囊蟲基因組：人芽囊蟲基因組DNA 操作操作 無菌無菌ddH2O 8 ul 2Taq MasterMix 10 ul 引物引物1 0.5 ul 引物引物2 0.5

4、 ul 模板模板DNA 1ul 總體積總體積 20 ul混勻后，高速瞬時離心混勻后，高速瞬時離心 ，置，置PCR儀上儀上操作操作PCR擴增的設(shè)定：設(shè)置設(shè)置PCR擴增儀的熱蓋溫度為擴增儀的熱蓋溫度為99預(yù)變性：預(yù)變性：94 4min循環(huán)：循環(huán)： 95變性變性45s 54退火退火 45s 35個循環(huán)個循環(huán) 72延伸延伸1min最后延伸：最后延伸：72 5min產(chǎn)物進行電泳拍照。產(chǎn)物進行電泳拍照。注意事項注意事項由于由于PCR技術(shù)非常敏感，可使一個技術(shù)非常敏感，可使一個DNA分子得以擴增，裝有分子得以擴增，裝有PCR試劑的試劑的微量離心管打開之前，應(yīng)先在微量離心微量離心管打開之前，應(yīng)先在微量離心機上

5、作瞬時離心使液體沉積于管底。機上作瞬時離心使液體沉積于管底。最好在加完所有其它反應(yīng)成分后才加模最好在加完所有其它反應(yīng)成分后才加模板板DNA，加模板，加模板DNA時不要形成噴霧。時不要形成噴霧。若用沒有熱蓋的若用沒有熱蓋的PCR擴增儀，則需在反擴增儀，則需在反應(yīng)體系中加入液體石蠟等礦物油封閉體應(yīng)體系中加入液體石蠟等礦物油封閉體系以防止反應(yīng)過程中液體的蒸發(fā)。系以防止反應(yīng)過程中液體的蒸發(fā)。 【思考題思考題】 1、PCR反應(yīng)的原理是什么？反應(yīng)的原理是什么？ 2、PCR反應(yīng)體系包括那些？反應(yīng)體系包括那些？實驗二實驗二 質(zhì)粒質(zhì)粒DNADNA的提取的提取質(zhì)粒質(zhì)粒 (plasmid)特點特點 能在宿主細胞內(nèi)獨

6、立自主復(fù)制；帶有某些能在宿主細胞內(nèi)獨立自主復(fù)制；帶有某些遺傳信息遺傳信息, , 會賦予宿主細胞一些遺傳性狀。會賦予宿主細胞一些遺傳性狀。 載體的選擇標準載體的選擇標準 能自主復(fù)制；能自主復(fù)制； 有克隆位點（外源有克隆位點（外源DNADNA插入點），常具有多插入點），常具有多個單一酶切位點，稱為個單一酶切位點，稱為多克隆位點多克隆位點； 具有兩個以上的具有兩個以上的遺傳標記遺傳標記，便于重組體的，便于重組體的篩選和鑒定；篩選和鑒定； 分子量小分子量小，以容納較大的外源以容納較大的外源DNADNA。質(zhì)粒的復(fù)制型質(zhì)粒的復(fù)制型質(zhì)粒在細胞內(nèi)的復(fù)制一般有兩種類型質(zhì)粒在細胞內(nèi)的復(fù)制一般有兩種類型: 嚴謹型嚴

7、謹型(Stringent control) ：只在細胞：只在細胞周期的一定階段進行復(fù)制，當細胞染周期的一定階段進行復(fù)制，當細胞染色體復(fù)制一次時，質(zhì)粒也復(fù)制一次，色體復(fù)制一次時，質(zhì)粒也復(fù)制一次，每個細胞內(nèi)只有每個細胞內(nèi)只有12個質(zhì)粒個質(zhì)粒 松弛型松弛型(Relaxed control) ：質(zhì)粒在整：質(zhì)粒在整個細胞周期中隨時可以復(fù)制，當染色個細胞周期中隨時可以復(fù)制，當染色體復(fù)制停止后，質(zhì)粒仍然能繼續(xù)復(fù)制，體復(fù)制停止后，質(zhì)粒仍然能繼續(xù)復(fù)制，每個細胞中含有每個細胞中含有10-200個拷貝。個拷貝。實驗?zāi)康?掌握堿裂解法抽提質(zhì)粒的掌握堿裂解法抽提質(zhì)粒的原理原理、步驟步驟及及各主要試劑的作用各主要試劑的作

8、用。質(zhì)粒質(zhì)粒 DNA 的分離和純化的分離和純化質(zhì)粒提取的主要步驟：質(zhì)粒提取的主要步驟：細菌的培養(yǎng)細菌的培養(yǎng)細菌的收集和裂解細菌的收集和裂解提純的思路 質(zhì)粒的特性：共價、閉合、環(huán)狀的小分子量質(zhì)粒的特性：共價、閉合、環(huán)狀的小分子量DNA 要去除的物質(zhì)：要去除的物質(zhì)：蛋白蛋白基因組基因組DNARNA 堿裂解法抽提質(zhì)粒堿裂解法抽提質(zhì)粒 1.1.質(zhì)粒提取試劑盒質(zhì)粒提取試劑盒(離心柱型離心柱型)實驗原理 堿法提取主要是利用共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒與線性染色質(zhì)在堿法提取主要是利用共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒與線性染色質(zhì)在拓撲學(xué)上的差異拓撲學(xué)上的差異來分離它們。來分離它們。 在在堿性堿性pH，染色體，染色體DNA的氫鍵斷裂，雙螺

9、旋結(jié)構(gòu)解開；的氫鍵斷裂，雙螺旋結(jié)構(gòu)解開；質(zhì)粒質(zhì)粒DNA的大部分氫鍵也斷裂，但超螺旋共價閉合環(huán)狀的大部分氫鍵也斷裂，但超螺旋共價閉合環(huán)狀的兩條鏈不會完全分離。的兩條鏈不會完全分離。 當當用用pH4.8的的KAc或或NaAc高鹽緩沖液調(diào)節(jié)其高鹽緩沖液調(diào)節(jié)其pH值到中性值到中性時，時，質(zhì)粒質(zhì)粒DNA分子分子能夠迅速準確地復(fù)性，呈溶解狀態(tài)，能夠迅速準確地復(fù)性，呈溶解狀態(tài)，離心時留在離心時留在上清上清中；而中；而線狀染色體線狀染色體DNA則不能復(fù)性，形則不能復(fù)性，形成纏繞的網(wǎng)狀物，通過離心，染色體成纏繞的網(wǎng)狀物，通過離心，染色體DNA與不穩(wěn)定的大與不穩(wěn)定的大分子分子RNA、蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物一

10、起復(fù)合物一起沉淀沉淀下來而被除去。下來而被除去。 再用再用酚氯仿抽提酚氯仿抽提進一步純化質(zhì)粒進一步純化質(zhì)粒DNADNA，用，用無水乙醇無水乙醇沉淀沉淀質(zhì)粒質(zhì)粒DNADNA。平衡液平衡液BL (Buffer BL) 溶液溶液P1 (Buffer P1)溶液溶液P2 (Buffer P2)溶液溶液P3 (Buffer P3)去蛋白液去蛋白液PD (Buffer PD) 漂洗液漂洗液PW (Buffer PW)洗脫緩沖液洗脫緩沖液EB (Buffer EB)RNase A (10 mg/ml) 吸附柱吸附柱CP3 (Spin Columns CP3)收集管收集管(2 ml) (Collection

11、Tubes 2 ml) 質(zhì)粒提取試劑盒組成質(zhì)粒提取試劑盒組成 1. 使用本試劑盒之前，先在溶液使用本試劑盒之前，先在溶液P1中加入中加入RNaseA。溶液。溶液P1使用完畢后，請立即至于使用完畢后，請立即至于4保存。保存。2. 漂洗液漂洗液PW在第一次使用前需加入無水乙醇，在第一次使用前需加入無水乙醇，15ml的漂的漂洗液中需加入洗液中需加入60ml的無水乙醇，混勻后方可使用。的無水乙醇，混勻后方可使用。3. 使用前先檢查平衡液使用前先檢查平衡液BL、溶液、溶液P2 和和P3 是否出現(xiàn)渾濁，是否出現(xiàn)渾濁，如有渾濁現(xiàn)象，可在如有渾濁現(xiàn)象，可在37水浴中加熱幾分鐘，即可恢復(fù)水浴中加熱幾分鐘，即可恢

12、復(fù)澄清。澄清。 實驗準備實驗準備 實驗儀器與材料實驗儀器與材料（一）儀器：超凈工作臺，（一）儀器：超凈工作臺，恒溫搖床，臺式離心機，恒溫搖床，臺式離心機，高壓滅菌鍋高壓滅菌鍋（二）材料：（二）材料：1.5ml 離心管，離心管，加樣槍，加樣槍，含有質(zhì)粒含有質(zhì)粒pVAX1pVAX1的大腸桿菌的大腸桿菌TOP10 TOP10 、LBLB液液體培養(yǎng)基體培養(yǎng)基實驗步驟實驗步驟 1. 細菌培養(yǎng)：細菌培養(yǎng)：接種含接種含質(zhì)粒質(zhì)粒pVAX1的的大腸桿菌大腸桿菌TOP10 10l 到到10ml含含氨芐青霉氨芐青霉素素(100g /ml)的的LB培養(yǎng)液中，培養(yǎng)液中， 37搖培過夜（搖培過夜（1012h）2. 柱平衡

13、柱平衡：向吸附柱中加入：向吸附柱中加入500ul的的平衡液平衡液BL，將吸附柱置于收集管上，將吸附柱置于收集管上 12000 rpm，1min倒掉收集管中的廢液，將吸附柱置于收集管上倒掉收集管中的廢液，將吸附柱置于收集管上3. 收集菌體：收集菌體： 取取1.5ml菌液轉(zhuǎn)入小離心管中菌液轉(zhuǎn)入小離心管中 12000 rpm，1min棄上清。將離心管倒置于紙巾上，以盡量去除上清。棄上清。將離心管倒置于紙巾上，以盡量去除上清。 4.懸浮懸?。?加加250ul溶液溶液P1于細菌沉淀中，渦旋震蕩（或用加樣槍吹打），徹底于細菌沉淀中，渦旋震蕩（或用加樣槍吹打），徹底懸浮細菌沉淀。（注：一定要徹底懸浮，否則抽

14、提質(zhì)粒懸浮細菌沉淀。（注：一定要徹底懸浮，否則抽提質(zhì)粒DNA的純度及得率會的純度及得率會大大降低）。大大降低）。5. 裂解：裂解：加加250ul溶液溶液P2，立即，立即輕柔顛倒離心管輕柔顛倒離心管6-8次次, （此時菌液應(yīng)變得此時菌液應(yīng)變得清亮粘清亮粘稠稠，所用時間，所用時間不應(yīng)超過不應(yīng)超過5min，以免質(zhì)粒受到破壞）。，以免質(zhì)粒受到破壞）。(注意：此步需輕柔混合，不要劇烈震蕩，以免打斷基因組注意：此步需輕柔混合，不要劇烈震蕩，以免打斷基因組DNA，造成提取的質(zhì)，造成提取的質(zhì)粒中混有基因組片斷。如果未變得清亮，可能由于菌體過多，裂解不徹底，粒中混有基因組片斷。如果未變得清亮，可能由于菌體過多，

15、裂解不徹底，應(yīng)減少菌體量。應(yīng)減少菌體量。)6.中和：中和： 加加350ul溶液溶液P3 ，立即溫和顛倒離心管立即溫和顛倒離心管6-8次次，充分混勻，此時將出，充分混勻，此時將出現(xiàn)白色絮狀沉淀?，F(xiàn)白色絮狀沉淀。（注：此時（注：此時質(zhì)粒質(zhì)粒DNA復(fù)性復(fù)性，染色體染色體DNA與蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物沉復(fù)合物沉淀淀）。）。 12000 rpm, 10 min7.轉(zhuǎn)移上清：轉(zhuǎn)移上清：將上清轉(zhuǎn)移到將上清轉(zhuǎn)移到CP3中（注意盡量不要吸出沉淀）中（注意盡量不要吸出沉淀） 12000 rpm, 30-60sec8. 漂洗漂洗DNA：向吸附柱向吸附柱CP3中加入中加入600 l漂洗液漂洗液PW（請先檢查（請

16、先檢查是否已加入無水乙醇），是否已加入無水乙醇），12,000 rpm離心離心30-60 sec，倒掉收集管，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱中的廢液，將吸附柱CP3放入收集管中。放入收集管中。9 . 重復(fù)步驟重復(fù)步驟8。10. 去漂洗液：去漂洗液：將將空吸附柱空吸附柱重新置于收集管上，重新置于收集管上，10000rpm，2min，以除去吸附柱中殘余的漂洗液。，以除去吸附柱中殘余的漂洗液。11. 收集質(zhì)粒：收集質(zhì)粒：將吸附柱置于一個干凈的小離心管上將吸附柱置于一個干凈的小離心管上，向吸附膜，向吸附膜的中間部位滴加的中間部位滴加30-50ul洗脫漂洗液洗脫漂洗液EB（或（或dw），放置，放置2min

17、，12000 rpm，2min，離心管中即為收集的質(zhì)粒溶液，做好標記，離心管中即為收集的質(zhì)粒溶液，做好標記，低溫保存?zhèn)溆?。低溫保存?zhèn)溆?。DNADNA的保存的保存 1 1、短期貯存：、短期貯存： 44或或-20-20存放于存放于TETE（TrisTris和和EDTAEDTA）緩沖液中。緩沖液中。 TETE緩沖液的緩沖液的PHPH與與DNA DNA 貯存有關(guān)，貯存有關(guān)，PHPH為為8 8時，可減少時，可減少DNADNA脫氨反脫氨反應(yīng)，應(yīng)，PHPH低于低于7.07.0時時DNADNA容易變性。容易變性。2 2、長期貯存：、長期貯存： 置于置于TETE緩沖液中緩沖液中-70-70可保存數(shù)年；在可保存數(shù)

18、年；在DNADNA溶液中加一滴氯仿溶液中加一滴氯仿可有效防止細菌和核酸的污染。可有效防止細菌和核酸的污染。離心的注意事項離心的注意事項1. 重量相等重量相等離心管或試管需離心管或試管需平衡（稱重）平衡（稱重）2. 位置對稱位置對稱平衡好的離心管平衡好的離心管或試管需或試管需對稱對稱放置放置實驗三實驗三 質(zhì)粒質(zhì)粒DNA的限制性酶切的限制性酶切與鑒定與鑒定【實驗?zāi)康膶嶒災(zāi)康摹?學(xué)習(xí)通過限制性酶切法簽定陽性克隆的方學(xué)習(xí)通過限制性酶切法簽定陽性克隆的方法原理與技術(shù)，熟悉瓊脂糖電泳原理及操法原理與技術(shù)，熟悉瓊脂糖電泳原理及操作作 ?！緦嶒炘韺嶒炘怼?限制性內(nèi)切酶是限制性內(nèi)切酶是DNA操作過程中所使用

19、的基本工操作過程中所使用的基本工具。限制酶特異性地結(jié)合于一段被稱為限制酶識具。限制酶特異性地結(jié)合于一段被稱為限制酶識別序列的特殊別序列的特殊DNA序列之內(nèi)或其附近的特異位點序列之內(nèi)或其附近的特異位點上，并在此切割雙鏈上，并在此切割雙鏈DNA。分子克隆中常用的為。分子克隆中常用的為II類限制酶，其識別位點長度為類限制酶，其識別位點長度為4、5或或6個核苷酸個核苷酸的反向重復(fù)序列。限制酶的切割點因酶而異，有的反向重復(fù)序列。限制酶的切割點因酶而異，有些產(chǎn)生帶平端的些產(chǎn)生帶平端的DNA片段，而另一些產(chǎn)生帶有粘片段，而另一些產(chǎn)生帶有粘性末端的性末端的DNA。1、質(zhì)粒、質(zhì)粒DNA的限制酶切的限制酶切 pV

20、AX1酶切位點的分布示意圖【實驗儀器與試劑實驗儀器與試劑】一、實驗儀器一、實驗儀器 1、微量移液器、微量移液器 2、離心機、離心機 3、恒溫水浴箱、恒溫水浴箱二、試劑二、試劑 1、EcoR I 和和 Hind 2、ddH2O【實驗步驟實驗步驟】 在一個潔凈的在一個潔凈的1.5 ml離心管中混勻下列反應(yīng)物：離心管中混勻下列反應(yīng)物：反應(yīng)物反應(yīng)物體積（體積（l）質(zhì)粒質(zhì)粒DNA1010M Buffer2Hind 0.5EcoR-I0.5水7總計202、將反應(yīng)物置于、將反應(yīng)物置于37水浴，溫浴水浴，溫浴2小時。小時。3、加入、加入5 l加樣緩沖液，混勻后即可加樣加樣緩沖液，混勻后即可加樣進行電泳。進行電

21、泳。4、在紫外觀察分析儀上觀察酶切的結(jié)果。、在紫外觀察分析儀上觀察酶切的結(jié)果。一、實驗原理瓊脂糖是一種天然聚合長鏈狀分子，可以形成具有剛性的濾孔，凝膠孔徑的大小決定于瓊脂糖的濃度。DNA分子在堿性緩沖液中帶負電荷，在外加電場作用下向正極泳動。DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動時，有電荷效應(yīng)與分子篩效應(yīng)。不同DNA的分子量大小及構(gòu)型不同，電泳時的泳動率就不同，從而分出不同的區(qū)帶。1、瓊脂糖凝膠電泳、瓊脂糖凝膠電泳二、試劑與器材二、試劑與器材電泳儀電泳儀電泳槽電泳槽緩沖液緩沖液瓊脂糖瓊脂糖凝膠槽凝膠槽梳子梳子取液器取液器溴酚藍溴酚藍試試 劑劑 1、50Tris-乙酸-EDTA緩沖液（TAE緩沖液），pH

22、8.3：稱取Tris 242g，EDTA-Na2 37.2 g 溶于800 ml去離子水，充分攪拌溶解，加入57.1 ml的乙酸，充分混勻定容至1000mL。 2、瓊脂糖： 1g 溶于TAE緩沖液中加熱配成100mL。 3、0.05%溴酚藍-50%甘油溶液（5Loading Buffer ） ：取一定量的0.1%溴酚藍水溶液，與等體積甘油混合而成。 4、0.5g/mL溴化乙啶染色液：稱取5mg溴化乙啶，用去離子水溶解，定容至100mL。從中取1mL，用無離子水稀釋至100mL。（有毒，戴手套，通風柜內(nèi)進行。） 5、DNA Marker （TaKaRa公司） 1）DL2,000TM DNA Ma

23、rker本本 Marker為已含有為已含有1Loading Buffer的的DNA溶液溶液可取可取5L直接電泳直接電泳 1、水平板型電泳槽 2、直流穩(wěn)壓電泳儀 3、微量移液槍 4、凝膠成像系統(tǒng)：可發(fā)射紫外光，通過電腦進行凝膠圖像的實時觀測 器器 材材三、操作方法三、操作方法 1、瓊脂糖凝膠液的制備：稱1g 瓊脂糖，置于三角燒瓶中，加入100mL TBE緩沖液，瓶口扣上一小燒杯，加熱至微沸，瓊脂全部融化。取出搖勻，即為1%瓊脂糖。注注 意意要完全融化混勻要完全融化混勻 2、凝膠板的制備 置水平板于工作臺面上，將樣品槽模板（梳子）插進水平板上凹槽內(nèi)，距一端約0.5cm。梳子底邊與水平板表面保持0.5-1mm的間隙。待瓊脂糖冷至65左右，小心地倒入托盤內(nèi)，使凝膠緩慢地展開在水平板表面形成一層約3mm厚均勻膠層。靜置0.5小時。注注 意意液內(nèi)不存有氣泡液內(nèi)不存有氣泡 待凝固完全后，用滴管在梳齒附近加人少量緩沖液潤濕凝膠，雙手均勻用力輕輕拔出樣品槽模板，則在膠板上形成相互隔開的樣品槽。將凝膠連