1、布魯氏菌血清學(xué)檢驗(yàn)布魯氏菌血清學(xué)檢驗(yàn) 免疫學(xué)基礎(chǔ)免疫學(xué)基礎(chǔ) n由于布魯氏菌培養(yǎng)的營(yíng)養(yǎng)條件苛刻而且時(shí)間長(zhǎng)，所以布魯氏菌的血清學(xué)診斷越來越受到重視。 主要是根據(jù)相應(yīng)抗原抗體可以在體主要是根據(jù)相應(yīng)抗原抗體可以在體外發(fā)生特異性結(jié)合并呈現(xiàn)可見反應(yīng)的外發(fā)生特異性結(jié)合并呈現(xiàn)可見反應(yīng)的原理原理,用已知抗原用已知抗原(或抗體或抗體)檢測(cè)體液中檢測(cè)體液中未知的抗體未知的抗體(或抗原或抗原).由于試驗(yàn)時(shí)通常由于試驗(yàn)時(shí)通常是用患者血清作為待檢材料是用患者血清作為待檢材料,所以檢測(cè)所以檢測(cè)抗原抗體的體外試驗(yàn)又稱為血清學(xué)試抗原抗體的體外試驗(yàn)又稱為血清學(xué)試驗(yàn)或血清學(xué)反應(yīng)驗(yàn)或血清學(xué)反應(yīng). n血清學(xué)檢查既可協(xié)助早期診斷，還可血

2、清學(xué)檢查既可協(xié)助早期診斷，還可確定是否復(fù)發(fā)或重復(fù)感染。確定是否復(fù)發(fā)或重復(fù)感染。n感染感染1-2周后，患者血清中出現(xiàn)周后，患者血清中出現(xiàn)IgM抗抗體，可以用凝集試驗(yàn)或抗人球蛋白試體，可以用凝集試驗(yàn)或抗人球蛋白試驗(yàn)檢測(cè)驗(yàn)檢測(cè)n感染周后，患者血清中出現(xiàn)感染周后，患者血清中出現(xiàn)IgG抗體，抗體，可以用補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)，熒光抗體或可以用補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)，熒光抗體或ELISA檢測(cè)檢測(cè) 虎紅平板的凝集反應(yīng)RBPT） 原理原理n該試驗(yàn)又稱為班氏孟加拉紅平板凝集該試驗(yàn)又稱為班氏孟加拉紅平板凝集試驗(yàn)。由于所用的抗原是酸性試驗(yàn)。由于所用的抗原是酸性PH3.63.9帶色的抗原，該抗原帶色的抗原，該抗原與被檢血清作用時(shí)能抑制血

3、清中的與被檢血清作用時(shí)能抑制血清中的IgM類抗體的凝集活性、檢查出的抗體是類抗體的凝集活性、檢查出的抗體是IgG類，因此提高了該項(xiàng)反應(yīng)的特異性。類，因此提高了該項(xiàng)反應(yīng)的特異性。 器材與試劑n虎紅平板凝集抗原、被檢血清、清潔脫脂玻片或有凹形孔的玻片、0.1ml吸管或微量加樣器、混合棒或牙簽 試驗(yàn)方法n在玻片上加0.03ml被檢血清，然后加入虎紅平板抗原0.03ml，充分混勻，在5分鐘內(nèi)觀察結(jié)果。(四四) 結(jié)果判定結(jié)果判定n有二種方法，第一種是，出現(xiàn)可見的凝集反應(yīng)就判為陽性；n另一種用“+”表示凝集程度按下列標(biāo)準(zhǔn)用加號(hào)記錄反應(yīng)強(qiáng)度：n+：出現(xiàn)大的凝聚片或小的粒狀物，液體完全透明，100%凝集n+：

4、有明顯的凝聚片，液體幾乎完全透明，75%凝集n+：有可見的凝集片，液體不甚透明，50%凝集n+：液體混濁，只有少量粒狀物，25%凝集n-：液體均勻混濁評(píng)價(jià)評(píng)價(jià)n此法簡(jiǎn)便、快速、容易操作，適于基層大面積檢疫；n此法有一定敏感性，檢查牛的陽性率稍高于綿羊、山羊。n因?yàn)樵谒嵝原h(huán)境下IgM活性受抑，該法主要是檢查IgG類凝集抗體，所以特異性較好，與補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)、二巰基乙醇2-ME試驗(yàn)和抗球蛋白Coombs0試驗(yàn)有較高的吻合率。n該法受制備抗原時(shí)條件影響較大，所以每批制備抗原應(yīng)予以檢查、標(biāo)化方可應(yīng)用。 試管凝集試驗(yàn)試管凝集試驗(yàn)的原理1897年萊特氏等(Wright)與其同事發(fā)現(xiàn)患該病的病人血清與馬爾他細(xì)

5、菌的培養(yǎng)物產(chǎn)生了凝集現(xiàn)象，遂稱之為萊特氏凝集反應(yīng)，成了迄今常用的血清學(xué)診斷方法之一。設(shè)備及試劑n試管凝集抗原n被檢血清n0.5%的石碳酸生理鹽水n吸管n試管n試管架n孵箱操作步驟n被檢血清的稀釋:一般情況下,每份血清用5支小試管,第一管加入2.3毫升石碳酸生理鹽水,第二管不加，第三、四、五管各加入0.5毫升.用1毫升吸管吸取被檢血清0.2毫升,加入第一管中,混勻。混勻后, 以該吸管吸取第一管中血清加入第二和第三管各0.5毫升，以該吸管將第三管混勻，并吸取0.5毫升加入第四管,依次稀釋到第五管,混勻后從第五管吸出0.5毫升棄去.如此稀釋后,從第二管起血清稀釋度分別為1:12.5 1:25 1:5

6、0 1:100操作步驟n加入抗原:先以0.5%石碳酸生理鹽水將抗原原液做適當(dāng)稀釋一般是作1:10稀釋）,稀釋后的抗原加入各稀釋的血清管第一管不加，作為血清對(duì)照）,每管0.5毫升,混勻。加入抗原后，第二管至第五管每管總量為1毫升，從第二管起血清稀釋度分別為1:25 1:50 1:100 1:200，從第一管再吸出0.5毫升，剩1毫升。n對(duì)照管的制作:n抗原對(duì)照適當(dāng)稀釋的抗原加石碳酸鹽水）n被檢血清對(duì)照n陰性對(duì)照陰性血清稀釋后加抗原）n陽性對(duì)照陽性血清稀釋到原有滴度加抗原）n然后將試驗(yàn)管和對(duì)照管充分混勻后，放于37溫箱中20-22小時(shí)后取出，在室溫下放置2個(gè)小時(shí)，以比濁管為標(biāo)準(zhǔn)判定結(jié)果。結(jié)果的判定

7、n判定比濁管的制備判定比濁管的制備:每次試驗(yàn)須配制比濁每次試驗(yàn)須配制比濁管作為判定的標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)管作為判定的標(biāo)準(zhǔn)依據(jù).n配制方法是配制方法是:取本次試驗(yàn)用的抗原稀釋液取本次試驗(yàn)用的抗原稀釋液一般一般1:105-10毫升，加入等量的毫升，加入等量的0.5%石碳酸生理鹽水作倍比稀釋，按下石碳酸生理鹽水作倍比稀釋，按下表配制比濁管表配制比濁管n比濁管的配制比濁管的配制 試管凝集反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)比濁管配制管號(hào) 抗原稀釋液ml） 生理鹽水ml） 透明度 標(biāo)志1 0.00 1.00 100% + 2 0.25 0.75 75% + 3 0.50 0.50 50% + 4 0.75 0.25 25% 5 1.00 0.

8、00 0% 結(jié)果記錄n根據(jù)各管中上層液體的清亮程度記錄結(jié)果，根據(jù)各管中上層液體的清亮程度記錄結(jié)果，特別是特別是50%清亮度（清亮度（+）對(duì)判定結(jié)果關(guān)系）對(duì)判定結(jié)果關(guān)系較大，一定要與比濁管對(duì)比判定較大，一定要與比濁管對(duì)比判定n血清對(duì)照為清亮透明無沉淀血清對(duì)照為清亮透明無沉淀,抗原對(duì)照為均抗原對(duì)照為均勻混濁在兩種對(duì)照管都成立的情況下，才勻混濁在兩種對(duì)照管都成立的情況下，才可判定試驗(yàn)管，否則應(yīng)重做。對(duì)沉淀需要可判定試驗(yàn)管，否則應(yīng)重做。對(duì)沉淀需要經(jīng)驗(yàn)判定。經(jīng)驗(yàn)判定。n “+” 幾乎完全凝集，上清液75%清亮n“+”顯著凝集，上清液50%清亮n“+” 微量凝集，液體25%清亮n “-” 無凝集，液體不清

9、亮n確定每份血清滴度是以出現(xiàn)“+”及以上的凝集現(xiàn)象的最高血清稀釋度n“+”完全凝集，上清液完全凝集，上清液100%清亮清亮診斷標(biāo)準(zhǔn)n沒有進(jìn)行過菌苗接種的人、畜血清試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)是：n人、牛、馬、鹿、駱駝等大家畜血清為1：100( +)及以上者為陽性，1：50(+)為可疑。n豬、羊(綿羊、山羊)、犬等小家畜血清在1：50(+)及以上者為陽性，1：25(+)為可疑。n對(duì)可疑反應(yīng)的人和動(dòng)物應(yīng)在10-25天內(nèi)重復(fù)檢查，以便進(jìn)一步確定診斷。影響試驗(yàn)結(jié)果的因素及注意事項(xiàng)n 受檢血清應(yīng)新鮮、無溶血、無污染，存放血清處溫度不能超過10，采血后應(yīng)于34日內(nèi)進(jìn)行檢查，因放置時(shí)間過長(zhǎng)可能會(huì)導(dǎo)致血清效價(jià)降低。n 遵守操作

10、規(guī)程：所用的器材要清潔、枯燥，試劑的加量一定要正確，放入溫箱的溫度和時(shí)間都要按要求，否則都影響結(jié)果。每份血清和抗原均要有對(duì)照。n高滲鹽水作凝集反應(yīng)，一般濃度在1012%，一般切記人血清不能用高滲鹽水。n作凝集反應(yīng)時(shí)，有個(gè)別血清會(huì)出現(xiàn)前帶現(xiàn)象，即作凝集反應(yīng)時(shí)，有個(gè)別血清會(huì)出現(xiàn)前帶現(xiàn)象，即稀釋度低的血清管內(nèi)稀釋度低的血清管內(nèi)(或血清量多的格或血清量多的格)不發(fā)生凝不發(fā)生凝集，而稀釋度高的管內(nèi)集，而稀釋度高的管內(nèi)(或血清量少的格或血清量少的格)出現(xiàn)凝出現(xiàn)凝集，這叫做前帶現(xiàn)象。如果某血清在平板凝集反集，這叫做前帶現(xiàn)象。如果某血清在平板凝集反應(yīng)中出現(xiàn)了前帶現(xiàn)象，那么做試管反應(yīng)時(shí)應(yīng)多做應(yīng)中出現(xiàn)了前帶現(xiàn)象，

11、那么做試管反應(yīng)時(shí)應(yīng)多做幾個(gè)管，多采用幾個(gè)稀釋度。幾個(gè)管，多采用幾個(gè)稀釋度。n 氯化鈉的含量增高對(duì)血清反應(yīng)有明顯的影響，鹽氯化鈉的含量增高對(duì)血清反應(yīng)有明顯的影響，鹽的濃度越高，反應(yīng)的敏感性提高，因此在獸醫(yī)界的濃度越高，反應(yīng)的敏感性提高，因此在獸醫(yī)界為了克服凝集反應(yīng)中的阻抑抗體的干擾，對(duì)羊血為了克服凝集反應(yīng)中的阻抑抗體的干擾，對(duì)羊血清采用高滲鹽水作凝集反應(yīng)，一般濃度在清采用高滲鹽水作凝集反應(yīng)，一般濃度在1012%，切記一般人血清不能用高滲鹽水。，切記一般人血清不能用高滲鹽水。n 前帶現(xiàn)象產(chǎn)生的原因n 膠體粒子學(xué)說：血清稀釋度低所含的膠體粒子多，它影響抗原抗體的結(jié)合，而稀釋度高的則含膠體粒子少，所以出現(xiàn)凝集。