1、嗜熱微生物的研究進展及應用宜春學院 化學與生物工程學院 03生物教育 張志剛指導老師：姜瓊摘要 嗜熱微生物是一類最適生長溫度高于45°C的微生物，嗜熱酶是從嗜熱微生物中分離得到的一類熱穩定性酶，由于嗜熱酶分子內部有很多氫鍵、二硫鍵及緊密而有韌性的空間結構的存在，所以嗜熱酶在高溫條件下具有很強的穩定性，高溫反應活性，以及對有機溶劑、去污劑和變性劑的較強抗性，嗜熱酶在許多方面都有廣泛的應用。當前獲得嗜熱酶的方法主要有：直接從嗜熱微生物中提取、利用基因工程技術在中溫宿主中表達和利用定向分子進化技術篩選。目前酶的純化主要采用層析法、高效液相色譜法和電泳法等方法。由于環境惡化,能源危機,全球變

2、暖等原因, 嗜熱酶的開發和應用將出現更加誘人的前景。 關鍵詞 嗜熱微生物；嗜熱酶；嗜熱機制；應用Thermophilic microorganism research progress and applicationZhang Zhigang College of Chemistry and Bioengineering, Bioengineering (Biology education), YiChun University Advisor: Jiang QiongAbstract Thermophilic microorganisms is a type of microorganism

3、s that the most suitable growth temperature is above 45°C,the thermophilic enzyme is a type of a thermostable enzyme separated from the thermophilic microorganism, because there is a lot of hydrogen keys and two-sulphur keys in the thermophilic enzyme molecule, so the thermophilic enzyme have a

4、 very strong stability in the hot condition, as well as there is a stronger fastness to organic solvent、 eradicator and denaturant,the thermophilic enzyme have an extensive application in many fields.The method which obtained the thermophilic enzyme includes three kinds at present: distilled directl

5、y from the thermophilic microorganism, expressed in the mild host making use of a genetic engineering technique and sieved with the directional molecule evolution technique. At present the enzyme purification methods are:chromatography、HPLC and electrophoresis. Due to the cause of worsening environm

6、ent, energy crisis,warmer weather, the development and application of the thermophilic enzyme will appear more captivating foreground.Keywords Thermophilic microorganisms; Thermophilic enzyme; Thermophilic mechanism; Application最適生長溫度高于45°C的微生物稱為嗜熱微生物，是在高溫環境下生存的一類微生物，它們有其自己的適應機制和特定的新陳代謝能力，具有獨特的

7、基因類型、特殊的生理機制及代謝產物，是地球上的邊緣生命形式。嗜熱酶是從嗜熱微生物中分離得到的一類熱穩定性酶，具有化學催化劑無法比擬的優點，尤其是在高溫條件下保持極好的穩定性，使很多高溫化學反應得以實現從而將極大的促進生物技術產業的發展。近年來，人們已從嗜熱微生物中分離得到多種嗜熱酶。今后，還應繼續在嗜熱酶的結構與功能、應用等方面作深入而全面的研究。本文主要對嗜熱酶的研究進展及應用作一綜述。1 嗜熱微生物的分類及其酶的種類和特點1.1 嗜熱微生物的分類嗜熱微生物是一類生長溫度跨度在40150之間的微生物,它可分為輕度嗜熱(最適生長溫度低于60)、中度嗜熱(最適生長溫度低于85) 和極度嗜熱(最適

8、生長溫度大于85) ,主要分布于地熱環境(海底溫泉和陸地溫泉) 和其它高溫環境(如堆肥、廄肥、高溫水處理廠)1。見諸報道的能產嗜熱蛋白酶的嗜熱微生物中,以芽孢桿菌最多。例如, Bacillus sp.MO21,B.sp.EA.1,B.thermoproteolyticus ,B . licheniformis及B.circulans,B.sp.AK1,B.sp.B18,B.smithii,B.sp.BT1,B.sp.wai 21a,B.pumilus MK65,B.sp.JB299.此外,在真菌、古細菌、放線菌中也有過報道2。1.2 嗜熱酶的種類嗜熱酶有許多種，各種酶的作用各不相同，目前已開發

9、的嗜熱酶有：1）降解淀粉類的嗜熱酶：極端耐熱淀粉酶、熱穩定的葡萄糖糖化酶(1,4-glucanohydrolase)、熱穩定的支鏈淀粉酶(pullulanase)、熱穩定的環糊精糖基轉移酶(cycodextrin glycosytransferases,CGTase)；2）降解纖維素類物質的嗜熱酶：熱穩定性纖維素酶；3）熱穩定的木聚糖酶(xylanases)；4）降解幾丁質的熱穩定性酶：熱穩定的幾丁質酶；5）降解蛋白質的熱穩定性酶：熱穩定的蛋白酶；6）葡萄糖異構酶(glucose isomersae)和木糖異構酶(xylose isomersae)；7）DNA聚合酶等3。1.3 嗜熱酶的特點嗜

10、熱酶是一類主要來源于嗜熱微生物的熱穩定酶,能夠在高溫下長時間保持活性而不變性,其特點可概括為三點：1）作用的最佳溫度高 嗜熱酶作用最佳溫度大多數在6080 之間,但也有少數例外。例如,來自Bacillus sp. B18的嗜熱蛋白酶,其作用最佳溫度為854；來自Thermoplasma acidophilum的嗜熱蛋白酶,其作用最佳溫度為955。最值得一提的是,來自Pseudomonas sp.的嗜熱蛋白酶,其作用最佳溫度為1206。2）具有良好的耐熱性 例如,由Bacillus sp.AK1產生的proteinase AKl在60、70時酶活性無變化,90時酶活性半衰期為19min7；由Th

11、ermoactinomyces sp. E79產生的嗜熱蛋白酶在90時,酶活半衰期為10min8；由Thermus sp. Rt41A產生的嗜熱蛋白酶在70時酶活半衰期為24h9。3）具有良好的PH和熱穩定性 例如,由Thermoactinomyces sp. E79產生的嗜熱蛋白酶,在pH5.012.0范圍內,酶活相當穩定8；由Bacillus sp. B18產生的嗜熱蛋白酶在pH5.012.0范圍內,酶活也相當穩定4；Bacillus stearothermophilus HY269產生的嗜熱蛋白酶在70、80時,pH穩定范圍分別為pH6. 010.0、pH6.08.010。2 嗜熱酶的熱

12、穩定機制嗜熱酶的耐熱性主要是由其分子內部結構決定的。維持嗜熱酶內部立體結構的化學鍵，主要是氫鍵、二硫鍵的存在及數量與其熱穩定性有關。一般認為，當這些鍵存在及數量增加時，酶的熱穩定性增強；這些鍵斷開，則酶的熱穩定性降低或喪失。嗜熱酶分子的許多微妙構造很可能與其穩定性有關。這些包括：稍長的螺旋結構，三股鏈組成的-折疊結構，C和N端氨基酸殘基間的離子作用以及較小的表面環等。這些構造形成了嗜熱酶緊密而有韌性的空間結構，從而提高其穩定性。酶蛋白為適應熱環境會發生結構改變，但每一種酶的熱適應機制不盡相同。一些酶在高溫條件下結構發生了重排，使一些空間短距離基團相互作用，堆積的結構更優化，內部空洞的數量和體積

13、減少，在分子內部形成了一個疏水作用很強的疏水核，同時分子外部的極性表面積增加，所有這些都有利于增強嗜熱酶的穩定性11。3 嗜熱酶的獲得3.1 直接從嗜熱微生物中提取 從嗜熱微生物的生境即堆肥、培養料、木屑堆、木片堆、樹木、土壤、空氣、動物巢穴、動物糞便、動物身體、昆蟲等及火山口、沙漠、發熱電器和電纜等特殊高溫環境中分離嗜熱微生物，然后直接從嗜熱微生物中提取出嗜熱酶。3.2利用基因工程技術在中溫宿主中表達將嗜熱微生物中的目的基因利用基因工程技術在中溫宿主中成功表達，可在溫和培養條件下得到大量的嗜熱酶，從而克服因嗜熱微生物生長速度較慢、培養條件嚴格而難以獲得大量嗜熱微生物的困難。目前，一些從嗜熱微

14、生物中獲得的基因已在大腸桿菌等中溫宿主中得到了成功的表達12。3.3利用定向分子進化技術篩選將克隆的某一基因經體外誘變和重組獲得大量突變體，經中溫宿主表達后，再篩選得到在高溫條件下有催化活力的突變體，著種定向分子進化技術是獲得嗜熱酶的一種新的途徑。4 嗜熱酶的純化目前酶的純化主要采用層析法：4.1 離子交換層析。離子交換層析是根據不同蛋白質與離子交換劑結合力不同而分離蛋白質。利用此方法能有效純化嗜熱酶。例如,孫超等10用CM-纖維素層析柱分離嗜熱脂肪芽孢桿菌HY269的耐熱金屬蛋白酶獲得成功。4.2 親和層析。親和層析法是純化質的一種極為有效方法,它通常只需一步處理即可達到純化目的。它是根據蛋

15、白質與相應配基親和力大小不同而分離蛋白質,即目的蛋白因具有較強親和力而留在層析柱上,非目的蛋白因親和力小而被洗脫下來。例如,金城等13利用Cbz-L-Phe-T-Sepharose 4B親和層析柱從嗜熱脂肪芽孢桿菌HY269中分離純化耐熱金屬蛋白酶。4.3 凝膠過濾層析。它是根據蛋白質分子大小不同而分離蛋白質。這也是一種有效純化嗜熱酶的方法。例如,唐兵等14用Sephadex G50凝膠柱從嗜熱脂肪芽孢桿菌WF146中純化耐熱中性蛋白酶。4.4 離子交換層析與凝膠過濾層析配合使用。在分離純化的過程中,常常出現目的蛋白與非目的蛋白具有相同電荷性質或相同分子量。這就使得用一步離子交換層析或凝膠層析

16、變得無效。若兩種方法結合,則能取得滿意效果。例如,Kumar CG15用離子交換層析、凝膠過濾層析純化嗜熱堿性蛋白酶。純化嗜熱酶除了層析法,還有高效液相色譜法、電泳法。最值得一提的是:Manro GK等9利用基因工程技術構建融合蛋白的方法來幫助純化嗜熱酶。5 嗜熱酶的應用利用嗜熱酶作為生物催化劑有如下的優點:(1)酶制劑的制備成本降低。因為嗜熱酶的穩定性高,因而可以在室溫下分離提純和包裝運輸,并且能長久地保持活性;(2)加快了動力學反應。隨著反應溫度的提高,分子運動速度加快,酶催化能力加強;(3)對反應器冷卻系統的要求標準降低,因而減少了能耗。由于嗜熱酶有耐高溫的特性,所以生產中不需要復雜的冷

17、卻裝置。一方面節省了開支,另一方面也降低了冷卻過程對環境所造成的污染;(4)提高了產物的純度。在嗜熱酶催化反應條件下(超過70),很少有雜菌生存,從而減少了細菌代謝物對產物的污染;(5) 生化過程在高溫下進行,能提高難溶物質如淀粉、纖維素、脂類的溶解性和可利用性,降低有機化合物的黏度而利于物質的擴散和混合。 基于嗜熱酶的高溫反應活性，以及對有機溶劑、去污劑和變性劑的較強抗性，使它在許多方面都有廣泛的應用潛力。5.1 食品釀造工業 食品加工過程中,通常要經過脂肪水解,蛋白質消化、纖維素水解等處理過程16 。嗜熱蛋白酶、淀粉酶及糖化酶已經在食品加工過程中發揮了重要作用。一些具有耐熱活性的-淀粉酶已

18、用于淀粉加工、酒精、啤酒及其他發酵工業生產。嗜高溫水解酶給食品工業帶來生機,消化蛋白酶加工纖維使食品更具風味和有益健康。在啤酒中應用-葡聚糖酶可以提高麥汁分離速度,降低啤酒渾濁度,減少膠狀沉淀。嗜熱鏈球菌是TTC 法檢測牛乳中抗生素的指示菌,又是酸奶生產特定菌,它與保加利亞桿菌混合培養能產生出芳香適口的酸奶。-半乳糖苷酶可用于生產低乳糖食品,改善乳制品的風味和營養,在水解過程中還會發生轉糖苷反應, 生成具有多種功能的低聚乳糖(GOS)17 。5.2 造紙工業傳統的方法是利用強酸或強堿處理木槳,大約90%的木質素可以被水解。從嗜熱菌Thermotoga中分離得到1,4-木聚糖內切酶,其最適溫度為

19、105,用這種酶處理木漿可以有效地去除木質素,減少對化學漂白劑的用量 18。5.3 環境保護 在環境保護方面,主要體現在處理食品和造紙工業廢水、芳香族化合物、氰化物、有機磷農藥、重金屬及其他有機難降解物質19 。利用嗜熱酶處理木漿可以有效地祛除木質素,減少對化學漂白劑的用量,從而減少了對環境的污染。在污水處理及廢物處理方面,人們不僅可以利用嗜熱酶的耐熱性,更重要的是利用它對有機溶劑的抗性。所以在許多污染地區利用嗜熱酶除去烷類化合物的污染有很大的優勢16。5.4 能源利用 目前,人們利用的主要能源物質為煤和石油,然而大多數煤和石油中都含有很高的無機或有機硫成分,在天然煤中硫的含量大約是0.5%6

20、%,在燃過煤的廢物中,它的含量高達11%,SO2直接進入大氣中,促進了酸雨的形成,所以對煤的直接利用已引起了嚴重的環境污染。在煤和石油脫硫處理中,用化學法脫硫需要100400高溫,而且由于有硫酸的生成,導致了很強的酸性環境。而用物理方法價格昂貴,同時也會引起好煤的流失。與這些方法相比,微生物除硫所需能量少,避免了好煤的流失及對環境的污染,既提高了煤的質量,又降低了成本16。嗜熱細菌木聚糖異構酶能緩解能源危機和環境污染的日益嚴重,并促進資源的再生,尤其對農副產品及林產品的木質廢棄物以及以農產品和林產品為原料的木業和造紙廠廢棄物中的木糖的利用,特別是通過微生物轉化木糖產生乙醇的研究已經成為熱點之一

21、。有研究表明嗜熱酶能將葡萄糖轉化為氫氣和水,這種從糖中獲取無污染燃料的方法可能導致能源革命,已經研究了嗜高溫微生物的半纖維素酶,可在較高溫度下水解樹脂。 石油開采過程中,利用粘膠混合細沙在巖石床上加壓,出現裂縫后,用超嗜熱酶可以提高油和氣的流動性,加速石油或天然氣的流出16。美國Halliburton能源服務公司將把Diversa公司制造的一種嗜熱酶加入該公司已獲專利的壓裂液中。壓裂液是天然聚合物, 在高壓下用于在巖層中壓出裂縫。一旦巖層被壓裂, 壓裂液中的酶就會使物質分解, 降低油的粘度, 從而使油能流出裂縫20。5.5 代謝工程方面嗜熱菌在糖代謝、三羧酸循環、氨基酸代謝中除了催化每一步酶的

22、熱穩定性較高以外,還有一些區別性的特點。如高溫菌的烯醇化酶為10或8聚體,而常溫菌為2聚體,高溫菌中的乙酰輔酶A和天門冬氨酸對丙酮酸羧化酶有雙重作用,纈氨酸對乙酰乳酸合成酶的反饋抑制,高溫菌中有2種類型的天門冬氨酸激酶存在等21,為發現新的代謝途徑提供了依據。5.6 醫藥工業耐熱-淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶等已廣泛應用于醫藥工業。如利用-淀粉酶生產葡萄糖,利用脂肪酶高度立體選擇,進行光學合成手性藥物等。極端微生物酶的相關產物已應用于疾病的診斷及治療、胎兒性別鑒定及法醫鑒定等22。5.7 遺傳研究嗜熱微生物酶對核苷酸序列分析、染色體畸變和基因突變等理論研究工作起很大促進作用21。在PCR 技術中DN

23、A聚合酶起著關鍵性的作用。近年來,PCR得到較大的改進,通過Taq酶或其他一些低保真酶的作用,PCR反應中加入少量具有高熱穩定性的來自古細菌的高保真性DNA聚合酶,可以大幅度降低大片段DNA(2040kb)擴增的錯配率,這對進行一些哺乳動物的基因擴增是非常有用的23。5.8 生物轉化及抗生素的生產隨著對嗜熱酶研究的深入,其在生物轉化方面的作用日益引起人們的重視。已有報道,嗜熱菌對維生素及類固醇等生物物質的修飾有重要作用。在堆肥實驗中,Kplan及合作者利用嗜熱菌對2,4,6-三硝基甲苯進行了轉化24。另外,他們也利用Pseudomonas thermophila中的一種嗜熱需氧菌生產出了多種B

24、族維生素。在抗生素的生產中,利用嗜熱酶催化獲得的抗生素也有報道。在利用嗜熱菌Thermoactinomyces 獲得的9種抗生素中,兩種熱紅菌素及熱綠鏈菌素已進行工業化生產并在醫藥領域得到應用25。5.9 洗滌劑行業嗜熱酶還有一個重要的應用領域就是洗滌劑行業，如蛋白酶、脂肪酶、-淀粉酶和纖維素酶等，上述酶已廣泛用作去污劑的添加劑。然而，一般酶是在30-40中發揮作用，如果水的溫度超過該溫度，則洗滌效果受到影響。洗碗機和工業去油污使用的洗滌劑需要在高溫下洗滌，因而需要開發高溫酶做添加劑。因此，嗜熱酶的應用將拓展洗滌劑市場26。此外，嗜熱酶還在冶金工業方面也有廣泛的應用。6前景展望當前，嗜熱微生物

25、及其嗜熱酶越來越受到人們的重視。但因嗜熱酶的穩定性機理仍不太清楚、培養條件苛刻、雖然利用基因工程技術已在中溫宿主中得到表達，但酶的表達量低等原因，其廣泛應用受到限制。嗜熱酶的研究還處于起步階段,有許多問題有待解決,主要包括以下幾個方面: 1）進一步篩選具有優良特性的高產菌株；2）加強嗜熱酶耐熱機制的研究,為人們利用蛋白質工程技術改造天然酶提供理論依據；3）開發適合嗜熱微生物生長的生物反應器以實現工業化生產；4）加強嗜熱酶的應用研究。由于環境惡化,能源危機,全球變暖等原因, 嗜熱微生物酶的開發和應用將出現更加誘人的前景。致謝在我的論文完成之際，首先要感謝我的指導老師姜瓊，姜老師平日里工作繁忙，但

26、在我做畢業設計的過程中，給予我許多幫助，及時的糾正我在論文創作中各種錯誤。除了姜老師的專業水平是我敬佩外，他的治學嚴謹和科學研究的精神也是我學習的榜樣。其次要感謝的是一起幫助我的同學，沒有他們的幫助，此次設計將會變得更加困難。最后感謝化生學院和我的母校宜春學院為我提供了許多論文的素材。參考文獻1 和致中,彭謙,陳俊英.高溫微生物學M.北京:科學出版社,2000.1-3.2 張云峰,羅玉明,王新風.嗜熱蛋白酶的研究與應用J.淮陰師范學院學報,2003,2(3):245-246.3 王順民,董文賓.嗜熱酶的研究及其在食品等相關工業的應用J.自然雜志,2004,26(6):339-341.4 Fuj

27、iwara N,Masui A,ImanakaT.Purification and propertes of the highly thermostable alkaline protease from and alkaliphilic an thermophilic Bacillus spJ.J Biotechnol,1993,30(2):245-246.5 Beadell J S,Clark D S.Probing stability-activity relationship in the thermophilic protease from Thermoplasma acidphilu

28、m by random mutagenesisJ.Extremephiles,2001,5(1):3-10.6 Barach J T,Adams D M.Thermostability at ultrahigh temperatures of thermolysin and a proteinase from a psychotrophic pseudomonasJ.Bochem Biophys Acta,1977,485(2):417-427.7 Peek K,Veitch D P.Some characterization of a proteinase from a thermophil

29、ic Bacillus sp.expressed in Escherichia coli comparision with the native enzyme and its processing in E.Coli and in vitroJ.Appl Environ Microbiol,1993,59(4):1168-75.8 Lee J K,Kim Y O.Pification and chara cterization of a thermostable alkaline protease from thermoactinomyces sp.E79 and DNA sequence o

30、f the encoding gene J.Biosci Biotechaol Biochem,1996, 60(5):840-846.9 Manro G K,MeHale R H,Saul D J,et al.A gene encoding a thermophilic alkaline serine protenase from thermus sp.Strain Rt41 A and its expession in escherichia coliJ.Microbiology,1995,141:1731-1738.10 孫超,金城,楊壽鈞等.嗜熱脂肪芽孢桿菌HY269耐熱蛋白酶基因表達

31、產物的純化及性質研究J.生物工程學報,1999,150(1):80-87.11 王冬梅,白復芹.嗜熱酶的穩定性及其應用前景J.山東農業大學學報(自然學版),2006,37(3):477-478.12 王雅蘭,車秀君,工淑蘭.五種川貝的一階導數光譜法鑒別J.中藥材,1994,17(7):1913 金城,楊壽鈞,劉宏迪等.耐熱中性蛋白酶產生條件及酶的親和層析純化J.微生物學報,1994, 34(4):285-292.14 唐兵,周林峰,陳向東等.嗜熱脂肪芽孢桿菌高溫蛋白酶的產生條件及酶學性質J.微生物學報, 1999,40(3):188-193.15 Kumar CG. Purification and characterization of a thermostable alkaline protease from alkealiphilic Bacil