1、第三節第三節 提取與分離提取與分離一、提取一、提取 1 1、黃酮苷類與極性較大的苷元、黃酮苷類與極性較大的苷元( (羥基黃酮羥基黃酮, ,雙雙黃酮黃酮, ,橙酮橙酮, ,查耳酮等查耳酮等) )丙酮丙酮, ,乙酸乙酯乙酸乙酯, ,乙醇乙醇, ,甲醇甲醇, ,甲醇甲醇- -水水(1:1)(1:1)等提取等提取 2 2、多糖苷類、多糖苷類: : 沸水提取沸水提取 3 3、花色苷類、花色苷類: 0.1% : 0.1% 鹽酸提取鹽酸提取4 4、黃酮苷元、黃酮苷元: : 氯仿氯仿, ,乙醚乙醚, ,乙酸乙酯等提取乙酸乙酯等提取（一）溶劑萃取法（一）溶劑萃取法1 1、原理：黃酮類化合物與混入雜質極性不同、原

2、理：黃酮類化合物與混入雜質極性不同2 2、舉例：、舉例：石油醚石油醚 除葉綠素、胡蘿卜素等脂溶性色素；除葉綠素、胡蘿卜素等脂溶性色素；乙醇乙醇 除蛋白質、多糖類等水溶性雜質。除蛋白質、多糖類等水溶性雜質。（二）堿提取酸沉淀法（二）堿提取酸沉淀法1 1、原理：黃酮類化合物易溶于堿性水。、原理：黃酮類化合物易溶于堿性水。2 2、常用堿液：碳酸鈉、常用堿液：碳酸鈉, , 氫氧化鈉氫氧化鈉, , 氫氧化鈣等氫氧化鈣等 例如：從槐花米提取蘆丁過程例如：從槐花米提取蘆丁過程 槐花米槐花米加加6 6倍量水倍量水煮沸煮沸以石灰乳調以石灰乳調pH=8-9pH=8-9微沸微沸30min30min趁熱過濾趁熱過濾殘

3、渣再殘渣再水煮一次水煮一次合并兩次濾液合并兩次濾液 60-70 60-70時以時以濃鹽酸調節濃鹽酸調節pH=4-5pH=4-5靜置靜置2424小時小時抽濾抽濾水洗至中性水洗至中性 60 60干燥得粗品蘆丁干燥得粗品蘆丁沸水重結晶沸水重結晶 70-8070-80干燥得純品蘆丁。干燥得純品蘆丁。（三）碳粉吸附法（三）碳粉吸附法 1 1、適用范圍：主要用于苷類的精制。、適用范圍：主要用于苷類的精制。2 2、使用過程：、使用過程： 植物甲醇粗提物植物甲醇粗提物，加入活性炭，檢查上清；，加入活性炭，檢查上清； 沸水、沸甲醇、沸水、沸甲醇、7%7%酚酚/ /水、水、15%15%酚酚/ /醇洗脫；醇洗脫；

4、減壓濃縮減壓濃縮7%7%酚酚/ /水洗脫液至小體積；水洗脫液至小體積； 乙醚除去殘留的酚乙醚除去殘留的酚 水層中含有較純的黃酮苷類。水層中含有較純的黃酮苷類。（四）聚酰胺吸附法（四）聚酰胺吸附法1 1、 聚酰胺對于黃聚酰胺對于黃酮類化合物是比較理想的酮類化合物是比較理想的 吸附劑吸附劑 2 2、洗脫劑：不同濃度的乙醇、丙酮以及堿水、洗脫劑：不同濃度的乙醇、丙酮以及堿水3 3、分離效果：粗分、分離效果：粗分 例如：銀杏葉黃酮的提取例如：銀杏葉黃酮的提取 （五）超臨界流體萃取法（五）超臨界流體萃取法1 1、以、以COCO2 2為單一流體萃取極性較低的游離黃酮為單一流體萃取極性較低的游離黃酮或黃酮的

5、碳苷類；或黃酮的碳苷類；2 2、在、在COCO2 2中加入水、乙醇等作為夾帶劑，萃取中加入水、乙醇等作為夾帶劑，萃取極性較高的黃酮或黃酮苷類。極性較高的黃酮或黃酮苷類。例如：從甘草中提取黃例如：從甘草中提取黃酮類化合物，以酮類化合物，以COCO2 2為單為單一流體可萃取極性較低的干草查耳酮一流體可萃取極性較低的干草查耳酮A A、B B；在在COCO2 2- -水水- -乙醇乙醇溶劑體系中則可提取極性較高的溶劑體系中則可提取極性較高的甘草素與異甘草素。甘草素與異甘草素。二、分離二、分離 （一）柱色譜法（一）柱色譜法1. 1. 硅膠柱色譜：硅膠柱色譜： 主要適于分離異黃酮、二氫黃酮、二氫黃主要適于

6、分離異黃酮、二氫黃酮、二氫黃酮醇及高度甲基化（或乙酰化）的黃酮及黃酮醇及高度甲基化（或乙酰化）的黃酮及黃酮醇類。酮醇類。 在加水去活化后可用于分離極性較大的化在加水去活化后可用于分離極性較大的化合物，如多羥基黃酮醇及其苷類等。合物，如多羥基黃酮醇及其苷類等。 硅膠中混存少量金屬離子，應預先用硅膠中混存少量金屬離子，應預先用濃鹽酸處理除去，以免干擾分離效果。濃鹽酸處理除去，以免干擾分離效果。 分離黃酮苷元時，用氯仿分離黃酮苷元時，用氯仿- -甲醇混合溶甲醇混合溶劑做移動相；劑做移動相； 分離黃酮苷時，用氯仿分離黃酮苷時，用氯仿- -甲醇甲醇- -水或乙酸水或乙酸乙酯乙酯- -丙酮丙酮- -水做移

7、動相。水做移動相。2. 2. 聚酰胺柱色譜聚酰胺柱色譜 可用于分離各種類型的黃酮類化合物，可用于分離各種類型的黃酮類化合物， 包括苷與苷元、查耳酮與二氫黃酮等。包括苷與苷元、查耳酮與二氫黃酮等。 分離的機理分離的機理: : 主要為氫鍵吸附主要為氫鍵吸附 ，其吸附，其吸附 強度主要取決于羥基的數目、位置以及溶劑強度主要取決于羥基的數目、位置以及溶劑的影響。的影響。 吸附規律如下吸附規律如下: :a. a. 酚羥基數目越多，吸附力越強；酚羥基數目越多，吸附力越強；b. b. 如酚羥基所處位置易形成分子內氫鍵，如酚羥基所處位置易形成分子內氫鍵， 則吸附力減小。則吸附力減小。c. c. 分子內芳香程度

8、越高、共軛雙鍵越多，分子內芳香程度越高、共軛雙鍵越多， 則吸附力增強。則吸附力增強。總之，一般吸附力由大到小的順序為：總之，一般吸附力由大到小的順序為：黃酮醇黃酮醇 黃酮黃酮 二氫黃酮醇二氫黃酮醇 異黃酮異黃酮 洗脫規律如下洗脫規律如下: :a.a. 不同類型黃酮化合物，先后流出順序為：不同類型黃酮化合物，先后流出順序為： 異黃酮異黃酮 二氫黃酮醇二氫黃酮醇 黃酮黃酮 黃酮醇黃酮醇b. b. 相同苷元，洗脫先后順序為：相同苷元，洗脫先后順序為： 叁糖苷叁糖苷 雙糖苷雙糖苷 單糖苷單糖苷 苷元苷元c. c. 母核上增加羥基，洗脫速度即相應下降；母核上增加羥基，洗脫速度即相應下降；d. d. 羥基

9、數目相同時，其位置影響洗脫順序：羥基數目相同時，其位置影響洗脫順序： 鄰位羥基黃酮鄰位羥基黃酮 對位（或間位）羥基黃酮對位（或間位）羥基黃酮 e. e. 查耳酮比相應二氫黃酮難于洗脫。查耳酮比相應二氫黃酮難于洗脫。 f. f. 洗脫能力與介質有關洗脫能力與介質有關 水水 甲醇或乙醇甲醇或乙醇 丙酮丙酮 稀稀NaOHNaOH水水溶液或氨水溶液或氨水 甲酰胺甲酰胺 二甲基甲酰胺二甲基甲酰胺 3 3，5 5，7 7，33，4-4-五羥基黃酮五羥基黃酮 3 3，5 5，7 7，33，44，5-5-六羥基黃酮六羥基黃酮 常用洗脫劑：常用洗脫劑： 堿性水溶液、含鹽水溶液、堿性水溶液、含鹽水溶液、 醇及含水

10、醇等。醇及含水醇等。 其它洗脫溶劑：含水丙酮、甲醇氯仿等其它洗脫溶劑：含水丙酮、甲醇氯仿等（二）梯度（二）梯度pHpH萃取法萃取法1 1、適用范圍：酸性強弱不同黃酮苷元的分離。、適用范圍：酸性強弱不同黃酮苷元的分離。2 2、原理：根據黃酮類苷元酚羥基數目及位置、原理：根據黃酮類苷元酚羥基數目及位置不同其酸性強弱也不同的性質，可以將總黃不同其酸性強弱也不同的性質，可以將總黃酮溶于有機溶劑后，依次用酮溶于有機溶劑后，依次用5%5%NaHCONaHCO3 3、 5%Na5%Na2 2COCO3 3、0.2%NaOH0.2%NaOH及及4%4%NaOHNaOH水溶液水溶液萃取，將黃酮按較強酸性至較弱酸

11、性的順序進萃取，將黃酮按較強酸性至較弱酸性的順序進行分離。行分離。 3 3、分離規律如下：、分離規律如下： 酸性酸性 溶解性溶解性7 7，4-4-二二OH 5%OH 5%NaHCONaHCO3 3液液 7-7-或或4-OH 5%4-OH 5%NaNa2 2CO3CO3液液 一般一般OH 0.2%OH 0.2%NaOHNaOH液液 5-OH 4%5-OH 4%NaOHNaOH液液（三）根據分子中某些特定官能團進行分離（三）根據分子中某些特定官能團進行分離1 1、鉛鹽沉淀法：適用于具有鄰二酚羥基的分離、鉛鹽沉淀法：適用于具有鄰二酚羥基的分離 具有鄰二酚羥基的黃酮成分，可被中性醋酸具有鄰二酚羥基的黃

12、酮成分，可被中性醋酸鉛沉淀；鉛沉淀； 不含鄰二酚羥基結構的黃酮成分，可被堿性不含鄰二酚羥基結構的黃酮成分，可被堿性醋酸鉛沉淀。醋酸鉛沉淀。2 2、硼酸絡合法：、硼酸絡合法：具有鄰二酚羥基的黃酮可與硼酸絡合，生成物具有鄰二酚羥基的黃酮可與硼酸絡合，生成物易溶于水，借此可與不含鄰二酚羥基結構的易溶于水，借此可與不含鄰二酚羥基結構的黃酮成分分離。黃酮成分分離。3 3、脫鉛方法、脫鉛方法 HH2 2S S法：鉛鹽沉淀懸浮于乙醇中，通入法：鉛鹽沉淀懸浮于乙醇中，通入HH2 2S S進行復分解，濾去進行復分解，濾去PbSPbS沉淀，可得黃酮類成分。沉淀，可得黃酮類成分。該法缺點：初生態該法缺點：初生態Pb

13、SPbS沉淀具有較高吸附性。沉淀具有較高吸附性。 現通用法：使用硫酸鹽或磷酸鹽，或使用現通用法：使用硫酸鹽或磷酸鹽，或使用陽離子交換樹脂脫鉛。陽離子交換樹脂脫鉛。 三、提取分離實例三、提取分離實例 從檸檬果皮中分離降血壓有效成分從檸檬果皮中分離降血壓有效成分 檸檬果皮檸檬果皮2kg2kg攪碎攪碎熱水浸取熱水浸取 濾液濾液濃濃縮后加縮后加3 3倍量乙醇倍量乙醇 水提取物水提取物 hexane( hexane(己烷己烷) )提取提取 n-BuOHn-BuOH提取提取n-BuOHn-BuOH提取物提取物加堿加堿式醋酸鉛式醋酸鉛 黃色鉛鹽沉淀黃色鉛鹽沉淀碳酸氫鈉碳酸氫鈉 濾液濾液66MHClMHCl調

14、調pH=5n-BuOHpH=5n-BuOH提取提取得粗黃酮得粗黃酮類類凝膠過濾凝膠過濾不同不同pHpH水洗水洗 不同部分反復不同部分反復柱層析柱層析反復重結晶反復重結晶得不同單體。得不同單體。 四、含黃酮類化合物中藥實例四、含黃酮類化合物中藥實例1.1.黃芩黃芩 黃芩苷是黃芩的主要有效成分黃芩苷是黃芩的主要有效成分, ,具有抗菌、具有抗菌、消炎作用。尚有降轉氨酶的作用。消炎作用。尚有降轉氨酶的作用。 黃芩變綠過程黃芩變綠過程OOHOHOROOOHOHOHOOOOHOOO黃芩苷黃芩苷黃芩素（黃色）黃芩素（黃色）綠色綠色2. 2. 槐花米槐花米 蘆丁是槐花米的有效成分；蘆丁是槐花米的有效成分； 蘆

15、丁分子中含有較多酚羥基，顯示酸性而蘆丁分子中含有較多酚羥基，顯示酸性而易溶于堿液中，酸化后又析出。易溶于堿液中，酸化后又析出。OOOOHHOOHOHGlc-RhaRutinose第四節第四節 黃酮類化合物的檢識與結構鑒定黃酮類化合物的檢識與結構鑒定一、黃酮類化合物的檢識一、黃酮類化合物的檢識 1 1、顏色：、顏色： 黃酮（醇）類黃酮（醇）類黃色；查耳酮黃色；查耳酮橙黃色橙黃色 二氫黃酮（醇）、異黃酮二氫黃酮（醇）、異黃酮無色或微黃色無色或微黃色 2 2、顯色反應：、顯色反應： 鹽酸鎂粉、鹽酸鎂粉、NaBHNaBH4 4、AlClAlCl3 3、醋酸鉛等、醋酸鉛等 （一）紙色譜（一）紙色譜1 1

16、、應用范圍：適合于檢識各種類型黃酮類化合、應用范圍：適合于檢識各種類型黃酮類化合物，包括苷與苷元。物，包括苷與苷元。2 2、雙向紙色譜雙向紙色譜是檢識植物粗提物中黃酮類化合是檢識植物粗提物中黃酮類化合物存在的最好方法之一。物存在的最好方法之一。 第一向第一向通常采用一種通常采用一種“醇性醇性”溶劑溶劑展開，展開，如如n-BuOH-HOAcn-BuOH-HOAc-H-H2 2O(4:1:5 O(4:1:5 上層上層 BAW)BAW)、n-BuOH-HOAcn-BuOH-HOAc-H-H2 2O(3:1:1 O(3:1:1 ，TBA)TBA)與水飽和與水飽和的的n-BuOHn-BuOH等；等； 第

17、二向第二向通常用一種通常用一種 “ “水性水性”溶劑展開，溶劑展開， 如如2%2%5%5%HOAcHOAc等等3 3、檢識黃酮類苷元：一般用、檢識黃酮類苷元：一般用“醇性醇性”展開劑；展開劑； 檢識黃酮苷：一般用檢識黃酮苷：一般用“水性水性”展開劑。展開劑。4 4、RfRf與黃酮類化合物結構的關系：與黃酮類化合物結構的關系：（1 1）水性溶劑水性溶劑展開時，平面型分子幾乎停留原展開時，平面型分子幾乎停留原點不動點不動( (RfRf0.02);0.70.7） 單糖苷單糖苷 雙糖苷雙糖苷。（3 3）醇性溶劑展開時，羥基被甲氧基取代，）醇性溶劑展開時，羥基被甲氧基取代，因極性減小，因極性減小，RfR

18、f將增大。將增大。（4 4）醇性溶劑展開時，如黃酮類化合物羥）醇性溶劑展開時，如黃酮類化合物羥基被苷化，因極性增大，基被苷化，因極性增大，RfRf將下降。將下降。 5 5、大部分極性大的黃酮出現在濾紙的右上方，、大部分極性大的黃酮出現在濾紙的右上方，極性小的黃酮則出現在濾紙的左下方。極性小的黃酮則出現在濾紙的左下方。6 6、大多數黃酮類化合物在紙色譜上用紫外光、大多數黃酮類化合物在紙色譜上用紫外光燈檢查時，可以看到有色斑點，以氨蒸汽處理燈檢查時，可以看到有色斑點，以氨蒸汽處理后常產生明顯的顏色變化后常產生明顯的顏色變化附：黃酮與黃酮醇的斑點顏色變化附：黃酮與黃酮醇的斑點顏色變化濾紙上斑點顏色濾

19、紙上斑點顏色 可能結構可能結構UVUVUV/NHUV/NH3 3 深紫深紫黃或黃綠黃或黃綠（1 1）5-OH5-OH、4-OH4-OH黃酮黃酮（2 2）5-OH5-OH、4-OH 3-OR4-OH 3-OR黃酮醇黃酮醇（3 3）5-OH5-OH、33，4-OH4-OH黃酮黃酮（4 4）5-OH5-OH、34-OH 3-OR34-OH 3-OR黃酮醇黃酮醇亮 藍 色亮 藍 色熒光熒光黃綠或黃綠或 藍綠色藍綠色（1 1）無）無5-OH 5-OH 黃酮黃酮（2 2）無）無5-OH 5-OH 但有但有3-3-OROR（3 3）無）無5-OH 5-OH 但有但有33，44雙雙- -OHOH暗 黃 或橙色

20、無顏色變化無顏色變化（1 1）3-OH3-OH或或5-OR 5-OR 黃酮黃酮（2 2）3-OH3-OH、33，4-OH4-OH黃酮醇黃酮醇( (二二) )TLCTLC主要指吸附薄層主要指吸附薄層1 1、硅膠、硅膠TLCTLC 用途：分離與鑒定弱極性黃酮類化合物。用途：分離與鑒定弱極性黃酮類化合物。 分離黃酮苷元常用的展開劑：分離黃酮苷元常用的展開劑： 甲苯甲苯- -甲酸甲酯甲酸甲酯- -甲酸（甲酸（ 541 541 ）等。）等。 分離黃酮苷元的衍生物如甲醚、乙酸乙酯分離黃酮苷元的衍生物如甲醚、乙酸乙酯 等中性成分，常用的展開劑是：苯等中性成分，常用的展開劑是：苯- -丙酮丙酮（9191）或苯

21、）或苯- -乙酸乙酯（乙酸乙酯（7.52.57.52.5）等。）等。2 2、聚酰胺、聚酰胺TLCTLC 特點：特別適合于分離含游離酚羥基的特點：特別適合于分離含游離酚羥基的 黃酮及其苷類。黃酮及其苷類。 常用的展開劑：常用的展開劑： 乙醇乙醇- -水（水（3 3：2 2）、丙酮）、丙酮- -水（水（1 1：1 1）、）、 水飽和的正丁醇水飽和的正丁醇- -醋酸（醋酸（100100：1 1）等）等3 3、常用的薄層色譜顯色方法、常用的薄層色譜顯色方法 1 1）紫外燈下觀察；）紫外燈下觀察； 2 2）氨蒸氣處理后觀察顏色變化）氨蒸氣處理后觀察顏色變化 3 3）2 2 AlClAlCl3 3甲醇溶液

22、甲醇溶液三、紫外可見光譜在黃酮類化合物鑒定中的應用三、紫外可見光譜在黃酮類化合物鑒定中的應用（一）一般程序：（一）一般程序： 測定樣品在甲醇溶液中的測定樣品在甲醇溶液中的UVUV光譜；光譜； 在甲醇溶液中分別加入各種診斷試劑后，在甲醇溶液中分別加入各種診斷試劑后， 測紫外可見光譜；測紫外可見光譜； 常用的診斷試劑：常用的診斷試劑： 甲醇鈉、醋酸鈉、醋酸鈉甲醇鈉、醋酸鈉、醋酸鈉/ /硼酸、三氯化鋁硼酸、三氯化鋁以及三氯化鋁以及三氯化鋁/ /鹽酸等鹽酸等（二）黃酮類化合物在甲醇溶液中的（二）黃酮類化合物在甲醇溶液中的UVUV特征特征 OO+OO+OO+BenzoylBenzoyl( (苯甲酰基苯甲

23、酰基) ) cinnamoylcinnamoyl( (桂皮酰基桂皮酰基) )( (峰帶峰帶II II，220-280nm) 220-280nm) （峰帶（峰帶I I，300-400nm300-400nm） 反映反映A A環取代情況環取代情況 反映反映B B環取代情況環取代情況 1 1、黃酮與黃酮醇類：、黃酮與黃酮醇類： 在在200-400 nm200-400 nm之間都出現兩個吸收峰，之間都出現兩個吸收峰，二者峰形相似，但帶二者峰形相似，但帶位置不同，據此分類。位置不同，據此分類。 在黃酮及黃酮醇母核上，如在黃酮及黃酮醇母核上，如7-7-及及4 4 位引位引入羥基、甲氧基等供電子基，將引起相應

24、吸收入羥基、甲氧基等供電子基，將引起相應吸收帶紅移。帶紅移。 通常，整個母核上氧取代程度越高，帶通常，整個母核上氧取代程度越高，帶越向長波方向位移。越向長波方向位移。 帶帶的峰位主要受的峰位主要受A-A-環氧取代程度的影響；環氧取代程度的影響； B- B-環的取代基對帶環的取代基對帶的峰位影響甚微，但的峰位影響甚微，但可影響它的形狀。可影響它的形狀。 如黃酮及黃酮醇母核上的羥基甲基化或苷化如黃酮及黃酮醇母核上的羥基甲基化或苷化時，將引起帶時，將引起帶位置紫移；位置紫移； 如黃酮及黃酮醇母核上的羥基被乙酰化了，如黃酮及黃酮醇母核上的羥基被乙酰化了，則原來酚羥基對光譜的影響將完全消除。則原來酚羥基

25、對光譜的影響將完全消除。 2 2、查耳酮及橙酮類、查耳酮及橙酮類共同特征是帶共同特征是帶很強，為主峰；帶很強，為主峰；帶較弱，較弱，為次強峰。為次強峰。查耳酮中，帶查耳酮中，帶位于位于220220270nm270nm，帶，帶位位于于340340390390nmnm； 查耳酮中，如在環上引入了氧取代基，也引查耳酮中，如在環上引入了氧取代基，也引起帶起帶位置紅移，尤其位置紅移，尤其2-2-位引入位引入-OH-OH時影響時影響最大。最大。 查耳酮中，如查耳酮中，如2- OH2- OH被甲基化或苷化，被甲基化或苷化， 則引起帶則引起帶位置紫移。位置紫移。 橙酮中，常顯現橙酮中，常顯現3 34 4個吸收峰，但主要吸個吸收峰，但主要吸收峰（帶收峰（帶）一般位于）一般位于370370430 430 nmnm。 天然橙酮的帶天然橙酮的帶可能出現在可能出現在370370413 413 nmnm。3 3、異黃酮、二氫黃酮及二氫黃酮醇、異黃酮、二氫黃酮及二氫黃酮醇 這三類化合物中，除有由這三類化合物中，除有由A-A-環苯甲酰系統環苯甲酰系統引起的帶引起的帶吸收外，因吸收外，因B B環不與吡喃酮環上的環不與吡喃酮環上的羰基共軛（或共軛很弱），故帶羰基共軛（或共軛很弱），故帶很弱，常在很弱，常在主峰的長波方向處有一肩峰。主峰的長波方向處有一肩峰