1、標本的采集和運送標本的采集和運送防止雜菌污染防止雜菌污染運送留意保管運送留意保管不同期不同標本不同期不同標本用抗菌素以前用抗菌素以前采集病變明顯部位采集病變明顯部位標本必需新穎標本必需新穎藥物敏感實驗直接涂片鏡檢分別培育生化實驗血清學實驗動物實驗明明確確診診斷斷初步診斷初步診斷分子生物學技術其他檢測技術形狀與構造的檢查形狀與構造的檢查 細菌個體形狀與構造的檢查細菌個體形狀與構造的檢查 細菌的菌體形狀、陳列、染色性細菌的菌體形狀、陳列、染色性染色染色單染：單染：復染：復染：特殊染色：特殊染色：形狀與構造的檢查形狀與構造的檢查革蘭染色法革蘭染色法Gram stain：方法：初染方法：初染 媒染媒染

2、 脫色脫色 復染復染原理：原理： 1、G+菌等電點低于菌等電點低于G-菌，吸收帶正電荷的堿性燃料多菌，吸收帶正電荷的堿性燃料多 2、G +菌細胞壁肽聚糖層多，菌細胞壁肽聚糖層多，G-菌細胞壁脂質含量高菌細胞壁脂質含量高 3、G+菌含有多量核糖核酸鎂鹽與結晶紫、碘結合成大分子菌含有多量核糖核酸鎂鹽與結晶紫、碘結合成大分子復合物復合物醫學意義：醫學意義：1、鑒定細菌、鑒定細菌 2、與致病性有關、與致病性有關 3、參考選擇抗菌、參考選擇抗菌藥物藥物形狀與構造的檢查形狀與構造的檢查抗酸染色抗酸染色acid-fast stain方法：方法：1、石炭酸復紅初染：加熱、石炭酸復紅初染：加熱35min，水洗，

3、水洗 2、3%5%鹽酸酒精脫色鹽酸酒精脫色30s，水洗，水洗 3、堿性美藍復染、堿性美藍復染30s，水洗。，水洗。 4、干后鏡檢、干后鏡檢結果：結果： 抗酸桿菌抗酸桿菌 紅色紅色 非抗酸桿菌非抗酸桿菌 藍色藍色原理：分枝桿菌屬的細菌，胞壁脂質多，其中的分枝菌酸與石炭酸原理：分枝桿菌屬的細菌，胞壁脂質多，其中的分枝菌酸與石炭酸復紅結合成結實的復合物，能抵抗脫色。復紅結合成結實的復合物，能抵抗脫色。分別與鑒定分別與鑒定分別：分別： 固體平板固體平板 分區劃線法分區劃線法 單個菌落單個菌落 菌落形狀：大小、光滑度、透明、溶血性菌落形狀：大小、光滑度、透明、溶血性鑒定：鑒定：形狀特征形狀特征生化反響生

4、化反響血清學鑒定血清學鑒定動物實驗動物實驗藥物敏感實驗藥物敏感實驗對糖的發酵對蛋白質的發酵枸櫞酸鹽利用實驗尿素酶實驗甲基紅實驗吲哚實驗硫化氫實驗單糖發酵實驗VP實驗其他實驗抗原的檢測抗原的檢測優點：優點： 分別、培育細菌困難的情況下；分別、培育細菌困難的情況下； 曾經運用了抗生素、細菌已被抑制曾經運用了抗生素、細菌已被抑制/殺死；殺死； 可檢測微量的抗原可檢測微量的抗原常用方法：常用方法： 沉淀反響沉淀反響 協同凝結實驗協同凝結實驗 免疫熒光法免疫熒光法 對流免疫電泳對流免疫電泳 酶免疫法酶免疫法 免疫印跡法免疫印跡法抗體的檢測抗體的檢測原理：用知的細菌或其特異性抗原檢測患者體液中有無相應特原

5、理：用知的細菌或其特異性抗原檢測患者體液中有無相應特異性抗體和其效價的動態變化，可作為某些傳染病的輔助診異性抗體和其效價的動態變化，可作為某些傳染病的輔助診斷。斷。原那么：原那么： 雙份血清；雙份血清； 與該地域的抗體效價的正常值比較；與該地域的抗體效價的正常值比較； 恢復期血清中抗體效價比急性期血清中抗體效價升高恢復期血清中抗體效價比急性期血清中抗體效價升高4倍倍者者抗體的檢測抗體的檢測常用方法：常用方法：凝集實驗：凝集實驗：補體結合實驗：補體結合實驗：中和實驗：中和實驗： 肥達實驗、外斐實驗、顯微鏡凝集實驗等肥達實驗、外斐實驗、顯微鏡凝集實驗等抗抗“O實驗等實驗等Q熱柯克斯體抗體檢測等熱柯

6、克斯體抗體檢測等第二節 細菌性感染的特異性預防 獲得性免疫的產生的方式 自然自動免疫：患病、隱性感染 自動免疫 人工自動免疫：接種疫苗、類毒素等 自然被動免疫：經過胎盤、初乳被動免疫 人工被動免疫：注射抗毒素、丙種球蛋 白、轉移因子 第二節第二節 細菌性感染的特異性預防細菌性感染的特異性預防一、人工自動免疫一、人工自動免疫 概念：人工自動免疫是人為地將疫苗概念：人工自動免疫是人為地將疫苗或類毒素接種于人體，使機體自動產生或類毒素接種于人體，使機體自動產生特異性免疫力的過程。是一種防治微生特異性免疫力的過程。是一種防治微生物感染的措施，主要用于預防。常用的物感染的措施，主要用于預防。常用的人工自

7、動免疫制劑有以下幾種：人工自動免疫制劑有以下幾種：第二節 細菌性感染的特異性預防 一疫苗 1 死疫苗： 用理化方法將免疫原性強的細菌殺死制成的。如百日咳、傷寒、霍亂、斑疹傷寒、流行性腦膜炎、鉤端螺旋體病等 2 活疫苗： 用減度或無毒的病原體制成,如BCG、鼠 疫和炭疽等的疫苗第二節 細菌性感染的特異性預防 活疫苗與死疫苗的比較 活疫苗 死疫苗 接種次數 1次 2-3次 接種量 小 較大 接種反響 輕 重 免疫效果 較好,維持1-5年 差,維持0.5-1年 毒力上升 有能夠 不能夠 平安性 有潛在危險性 平安性好 疫苗穩定性 相對不穩定 相對穩定 保管 不易保管 易保管第二節 細菌性感染的特異性

8、預防 3 基因工程疫苗 將編碼有效抗原組分的目的基因插入適當載體,構成重組DNA, 再導入宿主細胞, 目的基因隨重組DNA復制而復制, 隨宿主細胞分裂而擴增, 使目的基因表達大量有效抗原成分, 由此制備的疫苗稱為基因工程疫苗 如把HBsAg基因插入酵母細胞中，勝利表達并制備HBsAg疫苗第二節 細菌性感染的特異性預防 4 亞單位疫苗 利用帶有細菌維護性免疫原的組分制成的疫苗如肺炎鏈球菌莢膜多糖疫苗、鉤端螺旋體外膜蛋白疫苗等。此種疫苗免疫原性弱，需加佐劑或與類毒素結合成偶聯疫苗，以加強免疫原性 5 重組載體疫苗將編碼某一蛋白抗原的基因轉入減毒的病毒或細菌而制成的疫苗活疫苗的特殊方式：痘苗病毒6

9、核酸疫苗 或稱DNA疫苗、基因疫苗 是將能編碼引起維護性免疫應對的病原體免疫原基因片段和質粒載體直接注射入宿主體以表達目的免疫原，進而產生特異性體液免疫和細胞免疫的新型疫苗第二節 細菌性感染的特異性預防第二節 細菌性感染的特異性預防 二類毒素toxoid類毒素是外毒素經0.3-0.4%甲醛處置后，失去毒性仍堅持抗原性的生物制品參與適量的磷酸鋁或氫氧化鋁等制成精制的類毒素在體內吸收緩慢免疫效果好 如白喉類毒素、破傷風類毒素等第二節 細菌性感染的特異性預防第二節 細菌性感染的特異性預防 人工自動免疫和人工被動免疫的比較 區別要點 人工自動免疫 人工被動免疫 免疫物質 抗原 抗體或細胞因子 接種次數

10、 1-3次 1次 免疫出現時間 慢 2-4周 快 立刻 免疫繼續時間 長 數月-數年 短 2-3周 主要用途 預防 治療或緊急預防 三 生物制劑的運用及本卷須知 一接種對象： 根據發病的年齡、職業、流行地域確立接種對象 二接種途徑： 死疫苗、類毒素接種量大，常用皮下注射；活疫苗接種量小，常用皮膚劃痕、皮內注射、口服及噴霧等；丙種球蛋白、動物血清和抗毒素采用肌肉注射 第二節 細菌性感染的特異性預防 三接種劑量、次數及間隔時間 死疫苗接種劑量大，常分2-3次注射，間隔時間隨免疫力建立情況而定，傷寒疫苗產生免疫力快，間隔7-10天，類毒素吸收較慢，間隔3-4周。普通需1-2年后再接種一次 四接種反響

11、及預防接種忌諱癥 1.普通反響 2.異常反響 3.運用生物制品的忌諱癥第二節 細菌性感染的特異性預防第三節 細菌感染的治療一、抗菌藥物的種類一、抗菌藥物的種類二、抗菌藥物的主要作用機制二、抗菌藥物的主要作用機制1. 試述檢測病原菌的根本程序和原那么？2. 對曾經分別出的細菌菌落，怎樣從微生物學角度去進一步鑒定？3. 試述疫苗研制及其開展的主要階段？ 思索題應留意以下原那么應留意以下原那么對本身帶有雜菌對本身帶有雜菌 (如咽拭子、糞便如咽拭子、糞便) 或易受污染的標本，要進展或易受污染的標本，要進展病毒分別培育時，應運用抗生素。病毒分別培育時，應運用抗生素。 因病毒在室溫中易失去活性，標本應低溫

12、保管并盡快送檢。因病毒在室溫中易失去活性，標本應低溫保管并盡快送檢。 血清學診斷標本的采取應在發病初期和病后血清學診斷標本的采取應在發病初期和病后23w內各取內各取1份血份血清，以便對比雙份血清抗體效價的動態變化。清，以便對比雙份血清抗體效價的動態變化。動物接種動物接種雞胚接種雞胚接種細胞培育細胞培育 動物接種動物接種是最原始的病毒培育方法，是最原始的病毒培育方法，根據病毒種類不同，選擇敏打動物及適宜接種部位，根據病毒種類不同，選擇敏打動物及適宜接種部位，如嗜如嗜 神經性病毒狂犬病毒可接種于小鼠腦內；神經性病毒狂犬病毒可接種于小鼠腦內；痘病毒可接種于家兔角膜或皮內。痘病毒可接種于家兔角膜或皮內

13、。 雞胚接種雞胚接種 雞胚對多種病毒敏感。雞胚對多種病毒敏感。 普通采用孵化普通采用孵化914天的雞胚，天的雞胚， 根據病毒種類不同，將病毒標本根據病毒種類不同，將病毒標本 接種于雞胚的不同部位，接種于雞胚的不同部位， 最常用的雞胚接種部位有：最常用的雞胚接種部位有： 羊膜腔羊膜腔 尿囊腔尿囊腔 絨毛尿囊膜絨毛尿囊膜 卵黃囊等卵黃囊等 雞胚接種雞胚接種 雞胚接種雞胚接種 細胞培育細胞培育 原代細胞：原胚腎細胞原代細胞：原胚腎細胞 二倍體細胞：人胚肺二倍體細胞：人胚肺WI-26株細胞株細胞 傳代細胞：癌細胞傳代細胞：癌細胞 細胞培育細胞培育 病毒在細胞中增殖的目的：病毒在細胞中增殖的目的： 細胞

14、病變效應細胞病變效應-cytopathic effect, CPE 紅細胞吸附景象紅細胞吸附景象-hemadsorption，HAd 干擾景象干擾景象-interference 細胞培育細胞培育細胞病變效應細胞病變效應-cytopathic effect, CPEq有些病毒在細胞內增殖時可引起特有的細胞病變，稱為細胞病變效應有些病毒在細胞內增殖時可引起特有的細胞病變，稱為細胞病變效應 (CPE)。常見的變化有細胞變圓、聚集、壞死、溶解或零落等。常見的變化有細胞變圓、聚集、壞死、溶解或零落等。q有些病毒如麻疹病毒、有些病毒如麻疹病毒、CMV、RSV等等 作用于細胞膜，可使臨近的細胞相互作用于細胞

15、膜，可使臨近的細胞相互交融，構成多核巨細胞或稱交融細胞。交融，構成多核巨細胞或稱交融細胞。 q有些病毒有些病毒 (如狂犬病病毒、麻疹病毒等如狂犬病病毒、麻疹病毒等) 可在培育細胞中構成胞漿或核內的包可在培育細胞中構成胞漿或核內的包涵體。涵體。 細胞培育細胞培育細胞病變效應細胞病變效應-cytopathic effect, CPE 細胞培育細胞培育細胞病變效應細胞病變效應-cytopathic effect, CPE 細胞培育細胞培育紅細胞吸附景象紅細胞吸附景象-hemadsorption,HAdq 流感或副流感病毒等感染細胞后，由于細胞膜上出現了血凝素，具有流感或副流感病毒等感染細胞后，由于細

16、胞膜上出現了血凝素，具有吸附脊椎動物吸附脊椎動物 (豚鼠、雞、猴等豚鼠、雞、猴等) 紅細胞的才干，這一景象稱紅細胞吸附；紅細胞的才干，這一景象稱紅細胞吸附；q 常用來測定具有常用來測定具有HA的粘病毒與副粘病毒的增殖；的粘病毒與副粘病毒的增殖；q 假設有相應的抗血清，那么能中和細胞膜上的假設有相應的抗血清，那么能中和細胞膜上的HA，HAd不再發生，稱不再發生，稱紅細胞吸附抑制實驗。紅細胞吸附抑制實驗。 細胞培育細胞培育干擾景象干擾景象-interferenceq 某些病毒感染細胞時不出現某些病毒感染細胞時不出現CPE或其他易于測出的變化或其他易于測出的變化(如如HAd)，q 但能干擾在其后感染

17、的另一病毒的增殖。但能干擾在其后感染的另一病毒的增殖。q 如風疹病毒感染如風疹病毒感染Vero細胞時細胞時CPE不明顯，但它能干擾后感染的埃不明顯，但它能干擾后感染的埃可病毒的增殖，從而阻抑后者所特有的可病毒的增殖，從而阻抑后者所特有的CPE。 原列情況需求進展血清學檢查：原列情況需求進展血清學檢查： 采集標本中分別病毒已很困難；采集標本中分別病毒已很困難； 目前尚未建立分別該病毒的方法和技術；目前尚未建立分別該病毒的方法和技術； 判別臨床治療效果；判別臨床治療效果； 進展流行病學調查；進展流行病學調查； 基層醫療機構無法開展病毒分別實驗。基層醫療機構無法開展病毒分別實驗。 原理：是用知病毒抗

18、原來檢測病人血清中有無相應抗體，故須原理：是用知病毒抗原來檢測病人血清中有無相應抗體，故須待病人感染后體內產生抗體時才干檢出。待病人感染后體內產生抗體時才干檢出。 另外，在采取臨床標本及病人血清應留意病程，必需采取患者急另外，在采取臨床標本及病人血清應留意病程，必需采取患者急性期血清與恢復期血清性期血清與恢復期血清 (雙份血清雙份血清) 進展血清學實驗。進展血清學實驗。假設第假設第2次血清抗體滴度比第次血清抗體滴度比第1次高出次高出4倍以上時，才有診斷意義。倍以上時，才有診斷意義。 中和實驗中和實驗(neutralizing test, NT test) 補體結合實驗補體結合實驗 (compl

19、ement fixation test,CF test) 血凝抑制實驗血凝抑制實驗(hemagglutinatia inhibition test, HI test) 凝膠免疫分散實驗凝膠免疫分散實驗 中和實驗中和實驗(neutralizing test, NT test) 是病毒在活體內或細胞培育中被特異性抗體中和而失去感染性的一種實驗。是病毒在活體內或細胞培育中被特異性抗體中和而失去感染性的一種實驗。 中和抗體中和抗體(netralizing antibodies,NTAb)是作用于病毒外表抗原是作用于病毒外表抗原 (衣殼或包膜衣殼或包膜) 的抗體，同種不同型病毒間普通無交叉，特異性高，抗

20、體在體內維持時間長。的抗體，同種不同型病毒間普通無交叉，特異性高，抗體在體內維持時間長。 中和抗體陽性不一定表示正在感染中，也能夠因以前有過隱性感染所致。中和抗體陽性不一定表示正在感染中，也能夠因以前有過隱性感染所致。 中和實驗適用于病毒疫苗研討和人群免疫情況調查，在臨床診斷上較少運用。中和實驗適用于病毒疫苗研討和人群免疫情況調查，在臨床診斷上較少運用。 補體結合實驗補體結合實驗 (complement fixation test,CF test) 用知病毒可溶性補體抗原用知病毒可溶性補體抗原(CF)來檢測病人血清中相應來檢測病人血清中相應(CF)抗體。抗體。 CF抗原是病毒的內部抗原，同種異

21、型間常有交叉，故特異性較抗原是病毒的內部抗原，同種異型間常有交叉，故特異性較中和實驗低。中和實驗低。 但但CF抗體抗體IgM出現較早，消逝較快，故出現較早，消逝較快，故CF陽性可作為近期陽性可作為近期感染的目的。感染的目的。 血凝抑制實驗血凝抑制實驗(hemagglutinatia inhibition test, HI test) 具有具有HA的病毒能凝集雞、豚鼠、人等的紅細胞，稱血凝景象。的病毒能凝集雞、豚鼠、人等的紅細胞，稱血凝景象。 這種景象能被相應抗體抑制，稱這種景象能被相應抗體抑制，稱HI實驗。實驗。 其原理是相應抗體與病毒結合后，阻抑了病毒外表的其原理是相應抗體與病毒結合后，阻抑

22、了病毒外表的HA與紅細胞的結合。與紅細胞的結合。 本實驗簡易、經濟，特異性高，常用于粘病毒及乙型腦炎病毒感染的輔助本實驗簡易、經濟，特異性高，常用于粘病毒及乙型腦炎病毒感染的輔助診斷及流行病學調查，也可鑒定病毒的型與亞型。診斷及流行病學調查，也可鑒定病毒的型與亞型。 血凝抑制實驗血凝抑制實驗(hemagglutinatia inhibition test, HI test) 病毒病毒 +雞雞RBC = 凝集血凝實驗凝集血凝實驗 病毒病毒 +特異性抗體特異性抗體 +雞雞RBC=不凝集不凝集 血凝抑制實驗血凝抑制實驗 形狀學檢查形狀學檢查 電鏡和免疫電鏡電鏡和免疫電鏡 先將標本與病毒特異性抗體混合，促進病毒顆粒凝集，先將標本與